Содержание к диссертации
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
Этиология и патогенез инсулинзависимого сахарного диабета 12
Нарушение обмена веществ при ИЗСД 14
Механизмы образования свободных радикалов 18
Радикальные окислительные процессы 21
Система антиоксиданти ой защиты организма 25
Ферментативное звено антиоксидантной системы 26
Неферментативное звено антиоксидантной системы 31
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 35
Объект исследований 35
Методы исследований 37
Приготовление эритроцитарной массы 37
Определение содержания гемоглобина 39
Определение содержания малонового диальдегида 39
Определение содержания диеновых коньюгатов 40
Определение проницаемости эритроцитарных мембран 40
Определение сорбционной способности эритроцитов 42
Определение количества восстановленного глутатиона 42
Определение активности глутатионпероксидазы 43
Определение активности глутатион-8-трансферазы 44
Определение активности глутатионредуктазы 45
Определение активности глюкозо фосфатдегидрогеназы 45
Определение активности супероксиддисмутазы 46
Определение активности каталазы 47
Определение содержания церулоплазмина модифицированным методом Ревина 48
2.2.15. Метод раздельного определения аскорбиновой, дегидро-аскорбиновой и дикетогулоновой кислот 49
2.2.16. Статистическая обработка результатов 50
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 53
3.1. Оценка процессов перекисного окисления липидов у детей и подростков с ИЗСД 53
3.2. Состояние эритроцитарных мембран у детей и подростков с ИЗСД 62
3.3. Содержание восстановленного глутатиона и активность ферментов его метаболизма в эритроцитах у детей и подростков с ИЗСД 72
3.4. Активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах у детей и подростков с ИЗСД 85
3.5. Содержание церулоплазмина в плазме крови у детей и подростков с ИЗСД 93
3.6. Содержание аскорбиновой кислоты и её метаболитов в эритроцитах у детей и подростков с ИЗСД 97
3.7. Интегральная характеристика уровня перекисных про цессов и системы антиоксидантов в крови у детей и под ростков с ИЗСД 107
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ИЗ
ВЫВОДЫ 128
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 130
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Сахарный диабет (СД) является одной из актуальных проблем здравоохранения. Это заболевание, которым во всём мире страдает более 150 млн. человек. Процент заболевших людей с каждым годом неуклонно растёт, причём не только в развивающихся странах, но и в экономически развитых. Специальные расчёты экспертов ВОЗ показывают, что к 2010 году количество больных СД в мире достигнет 230 млн. человек. В Российской Федерации заболеваемость составляет 1-2%, официально зарегистрировано около 2 млн. больных СД, из которых 300 тыс. приходится на больных, страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД), встречающимся в основном в молодом возрасте и у детей (Levy, Lightman, 1997; Балаболкин, 1999; Древальидр., 1999).
Помимо высокой распространенности, ИЗСД является одной из частых причин инвалидизации и летальности, что обусловлено его сосудистыми осложнениями, к которым относятся микроангиопатия, клиническими проявлениями которой являются ретинопатия и нефропатия; макроангиопатия, приводящая к инфаркту миокарда, инсульту и гангрене нижних конечностей, а также нейропатия, в патогенезе которой значительное место отводится первичному поражению сосудов, участвующих в кровоснабжении периферических отделов нервной системы. Диабет сокращает продолжительность жизни на 2-11% (Касаткина, 1999; Балаболкин, 1998).
Таким образом, ИЗСД вследствие высокой распространённости, ранней инвалидизации и уменьшения продолжительности жизни больных является одной из важнейших медико-социальных проблем. Изучение механизмов инсули-новой регуляции, этиологии и патогенеза ИЗСД, поиски новых методов лечения проводятся в мире очень широко и интенсивно. В последнее время главные задачи исследований - переход от диагностики диабета к его предсказанию, от лечения к предупреждению (Levy, Lightman, 1997; Дедов и др., 1998).
В связи с распространённостью, большой медико-социальной значимостью и в целях комплексного решения проблем, связанных с СД, Правительство Российской Федерации 7 октября 1996 года утвердило федеральную целевую программу «Сахарный диабет». Это заболевание стало проблемой здравоохранения во всём мире, занимая по медико-социальной значимости место непосредственно после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний (Балаболкин, 1998; Altobelli et al., 2000).
Поскольку основной причиной инвалидизации больных и летальности являются сосудистые осложнения ИЗСД, то усилия многочисленных научных лабораторий и учёных направлены на выяснение механизмов патогенеза этих нарушений (Балаболкин, Клебанова, 2000).
Результаты многих исследований и, в частности, DCCT (The Diabetes Control and Complication Trial) свидетельствуют о том, что одной из основных цричин развития поздних сосудистых осложнений диабета является гипергликемия (Brownlee, 1992; The Diabetes Control..., 1993; Туракулов и др., 1999; Балаболкин, Клебанова, 2000). Однако, молекулярные механизмы, определяющие взаимосвязь между нарушением гомеостаза глюкозы и развитием диабетических ангиопатий, окончательно не ясны. Накапливается все больше данных о том, что повреждающее действие гипергликемии на сосудистую стенку опосредуется свободными радикалами. В связи с этим, в настоящее время широко ведутся исследования по изучению процессов свободнорадикального окисления (СРО) при ИЗСД. При этом установлено, что в механизмах повышения окислительного стресса (ОС) при диабете участвует не только гипергликемия, но и ги-поинсулинемия. Доказано, что хроническая гипергликемия через повышение скорости аутоокисления глюкозы увеличивает образование свободных радикалов, увеличивая процессы гликозилирования, приводит к избыточному образованию окисленных белков, а повышенная активность полиолового пути обмена глюкозы способствует истощению запасов НАДФН. Гипоинсулинсмия активирует симпатическую нервную систему и опосредованное катехоламинами образование свободных радикалов, а через вызванное катехоламинами повышение уровня ненасыщенных жирных кислот дополнительно увеличивает образование свободных радикалов, и снижает уровень глутатиона (одного из важных водорастворимых антиоксидантов) (Wolff, Dean, 1987; Yan, Harding, 1997; Baynes, Thorpe, 1999; Ceriello, 1999; Балаболкин, Клебанова, 2000; Keenoy et al., 2001; Majchrzak et al., 2001; Антонова и др., 2003).
Ликвидацию последствий окислительного стресса осуществляет система антиоксидантной защиты. Нарушение функционирования данной системы может играть определённую роль в патогенезе ИЗСД. Имеющиеся в литературе работы, посвященные изучению состояния перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) у детей с диабетом очень разноречивы и чаще всего касаются исследований лишь нескольких показателей системы «ПОЛ-АОС» (Haglof et al., 1983; Балашова и др., 1993; Дедов и др., 1995; Никифоров и др., 1995; Бобырева, 1998; Buyukkocak et al., 2000; Kinalski et al., 2000; Telcietal., 2000).
Особое значение в настоящее время придаётся состоянию эритроцитар-цых мембран, как своеобразной модели для оценки степени тяжести патологического процесса. Существенная роль в такого рода исследованиях отводится цатохимическим особенностям мембран (структурно - функциональные перестройки мембран, метаболизм мембранных липидов, интенсивность мембрано-дестабилизирующих процессов). Высокая корреляция между изменениями свойств мембран эритроцитов и клеточных мембран внутренних органов по-зроляет использовать эритроцитарные мембраны в качестве естественной модели для исследования общих характеристик всех биомембран (Черницкий, Воробей, 1981; Ивков, Берестовский, 1982; Кагава, 1985; Дороховских, 1998; Колосова и др., 2000).
Таким образом, исследование уровня ПОЛ, различных звеньев АОС, а также состояния эритроцитарных мембран может иметь важное прогностическое значение для больных ИЗСД, будет способствовать познанию патогенетических процессов заболевания и развитию использования антиоксидантной терапии.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Изучить особенности изменения уровня пе-роксидации липидов и компонентов антиоксидантнои системы в крови у детей и подростков с ИЗСД в зависимости от продолжительности, степени компенсации и наличия осложнений заболевания.
Для достижения поставленной цели были определены следующие ЗАДАЧИ:
1. Оценить уровень липидной пероксидации, состояние эритроцитарных мембран и системы АОС в крови у детей и подростков с ИЗСД в зависимости от продолжительности заболевания.
2. Исследовать влияние развития декомпенсации на процессы ПОЛ, состояние эритроцитарных мембран и систему АОС у детей и подростков с ИЗСД.
3. Изучить особенности липидной пероксидации, состояние эритроцитарных мембран и антиоксидантнои системы в крови у детей и подростков с осложнениями ИЗСД.
4. На основе выявленных особенностей состояния системы ПОЛ-АОС в крови у детей и подростков с ИЗСД разработать практические рекомендации по выявлению активации перекисных процессов при ИЗСД.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые проведено комплексное исследование системы «ПОЛ-АОС» у детей и подростков с ИЗСД, включающее определение первичных и вторичных продуктов липидной пероксидации, изучение различных звеньев АОС, обладающих как внутриклеточной, так и внеклеточной направленностью действия. При этом обнаружено, что ИЗСД протекает с активацией процессов ПОЛ и нарушениями в системе антиоксидантнои защиты, которые имеют разнонаправленные изменения при данной патологии.
Впервые для оценки состояния эритроцитарных мембран при ИЗСД использован метод мочевинного гемолиза, с помощью которого обнаружены значительные нарушения проницаемости уже в дебюте заболевания.
Впервые проведена детальная оценка уровня аскорбиновой кислоты (АК) и её метаболитов при ИЗСД, что свидетельствует о накоплении окисленных форм АК при данной патологии, главным образом, за счёт нарушения восстановления дегидроаскорбиновой кислоты (ДАК) в АК.
Для решения задач системного анализа при ИЗСД впервые использован нейросетевой классификатор и предиктор. Это позволило выявить наиболее информативные показатели из комплекса исследуемых параметров в нейросетевой модели Здоровые-Больные, а также установить взаимосвязь между ферментами, участвующими в обезвреживании продуктов перекисных процессов и состоянием эритроцитарных мембран при ИЗСД.
Для контроля за течением ИЗСД впервые предложено использование индексов прооксидантного статуса эритроцита, отражающих интенсивность сво-боднорадикальных процессов.
Материалы диссертации используются при чтении курсов: «Биохимия», «Биохимия тканей», «Молекулярные механизмы гормональной регуляции» студентам биологического факультета КрасГУ. Методики, изложенные в диссертации, включены в разделы большого практикума по биохимии на кафедре биохимии и физиологии человека и животных КрасГУ, а также используются студентами для выполнения курсовых и дипломных работ.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Показатели проницаемости и, сорбционной способности эритроцитарных мембран отражают нарушение состояния клеточных мембран при ИЗСД и могут быть использованы для оценки функционального состояния эритроцитарных мембран и уровня эндогенной интоксикации у больных сахарным диабетом, а также при других патологиях.
Для контроля за уровнем компенсации при ИЗСД предложено использование дополнительного критерия - индекса прооксидантного статуса эритроцита. Расчёт данного параметра рекомендуется проводить путём определения соотношения содержания диеновых коньюгатов (ДК) к восстановленному глута-тиону (FSH).
Для контроля за вероятностью развития поздних осложнений ИЗСД также рекомендуется введение индекса прооксидантного статуса эритроцита. Расчёт данного параметра рекомендуется проводить путём определения соотношения содержания малонового диальдегида (МДА) и активности супероксиддис-мутазы (СОД).
Снижение активности СОД при развитии поздних осложнений может свидетельствовать о преимущественной роли супероксидных радикалов в повреждении сосудистой стенки и позволяет рекомендовать использование анти-оксидантной терапии, направленной на обезвреживание в первую очередь О г
Полученные результаты указывают на целесообразность добавления к традиционной инсулинотерапии антиоксидантов и мембраностабилизирующих препаратов уже на ранней стадии заболевания с целью защиты клеток организма, и в частности - (З-клеток (имеющих слабую АОС), от токсического воздействия продуктов липопероксидации и активных форм кислорода (АФК), а также для профилактики сосудистых осложнений сахарного диабета.
В то же время при лечении ИЗСД не рекомендуется назначение высоких доз витамина С из-за выявленного нами нарушения восстановления ДАК в АК.
Результаты проведённых исследований внедрены в практику работы Краевой детской клинической больницы (г. Красноярск).
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Усиление процессов ПОЛ, изменения структурно-функциональных свойств эритроцитарных мембран и нарушения в системе антиоксидантной защиты происходят уже дебюте ИЗСД и остаются таковыми на протяжении всего исследуемого периода заболевания.
2. При декомпенсации ИЗСД наблюдается более выраженное увеличение уровня первичных продуктов ПОЛ, снижение содержания восстановленного глутатиона, снижение активности всех исследуемых ферментов (кроме глутатионпероксидазы) и увеличение содержания окисленных форм АК (в большей степени за счёт ДАК) по сравнению с группой субкомпенсированного диабета.
3. Развитие осложнений ИЗСД сопровождается более выраженным повышением плазменного уровня МДА и снижением активности СОД по сравнению с соответствующими показателями в группе детей без осложнений.
АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ. Основные положения работы доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Достижения науки и техники - развитию сибирских регионов» (Красноярск, 1999); итоговых научно-практических конференциях Института медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 1999, 2001, 2002); международном конгрессе "Научная молодежь на пороге XXI века" (Томск, 2000); молодежной научной конференции СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск, 2000); Российской конференции «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях» (Москва, 2000); X Международном симпозиуме «Концепция гомеостаза: теоретические, экспериментальные и прикладные аспекты» (Красноярск, 2000); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Молодая наука - XXI веку» (Иваново, 2001); Международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения A.M. Уголева «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2001); II Всероссийской конференции по финансово-актуальной математике и смежным вопросам (Красноярск, 2003); заседании Красноярского отделения Всероссийского Физиологического общества им. И.П. Павлова (Красноярск, 2003).
ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации опубликованы в 15 печатных работах.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, изложения и обсуждения результатов исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы (218 источников, в том числе 108 иностранных). Работа содержит 30 таблиц и проиллюстрирована 17 рисунками.
