Содержание к диссертации
Введение
1 .Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Свободнорадикальные процессы в живых организмах 8
1.1.1. Краткая характеристика свободных радикалов 9
1.1.2. Процесс ПОЛ 13
1.1.3. Система регуляции ПОЛ - антиоксиданты 16
1.2. Пестициды - поллютанты и ксенобиотики 19
1.2.1. Влияние пестицидного загрязнения на водные экосистемы 20
1.2.3. Механизмы токсического действия пестицидов 22
1.3. Детоксикация ксенобиотиков 26
1.3.1. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков 26
1.3.2. Глутатионовая система 30
2. Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Объекты и материалы исследования 33
2.2. Постановка эксперимента 37
2.3. Методы исследования 39
2.3.1. Определение радикальных продуктов ПОЛ методом ХЛ 39
2.3.2. Определение содержания малонового диальдегида 39
2.3.3. Определение активности СОД 39
2.3.4. Определение активности каталазы 39
2.3.5. Определение содержания восстановленного глутатиона 40
2.3.6. Определение активности глутатион-Б-трансферазы 40
2.3.7. Определение активности глутатионредуктазы 40
2.3.8. Определение активности карбоксилэстеразы 40
2.3.9. Определение активности ацетилэстеразы 41
2.3.10. Определение содержания общего белка 41
2.3.11. Статистическая обработка результатов исследования 41
3. Результаты исследования и их обсуждения 42
3.1. Токсикометрическая характеристика исследованных пестицидов 43
3.2. Интенсивность процесса ПОЛ у гидробионтов 44
3.3. Состояние антиоксидантной системы у гидробионтов 52
3.4. Состояние глутатионовой системы у гидробионтов 61
3.5. Активность ферментов детоксикации у гидробионтов 74
4. Выводы 103
5. Список литературы 105
- Краткая характеристика свободных радикалов
- Механизмы токсического действия пестицидов
- Объекты и материалы исследования
- Интенсивность процесса ПОЛ у гидробионтов
Введение к работе
Антропогенное воздействие на биосферу именуют глобальной экологической проблемой. Одним из важных антропогенных химических факторов, вызывающих неблагоприятные изменения окружающей природной среды являются пестициды, которые вносятся в окружающую среду для решения сельскохозяйственных задач и способны циркулировать и накапливаться в ней. Передаваясь по трофическим цепям, они попадают в организм человека и могут создавать угрозу его здоровью. Тем не менее, современная человеческая цивилизация обойтись без них не может.
Общие молекулярные механизмы действия пестицидов на живые организмы изучены недостаточно, несмотря на то, что известно большое количество вызываемых ими эффектов. Теоретические исследования и изучение этих механизмов определяется несколькими причинами. Во-первых, это позволит создавать более мощные антидоты, что уменьшит риск отравлений при несчастных случаях. Во-вторых, позволит создать новые, более эффективные пестициды, которые будут наносить меньший вред окружающей среде. Кроме того, понимание молекулярных механизмов действия пестицидов является необходимой предпосылкой для разработки научных основ и методов регламентации химических веществ.
В этой связи перспективным является изучение ранних проявлений пестицидной интоксикации в дозах малой интенсивности, а поиск селективных, доступных методов биоиндикации их токсического эффекта является приоритетным направлением современной науки. В то же время эта задача является актуальной с экологических позиций.
Следует подчеркнуть, что при длительном воздействии малых доз токсикантов развивается хронический токсический стресс, в механизмах которого на первый план выдвигаются общие, неспецифические реакции, а специфические изменения часто играют роль пускового триггера.
С точки зрения современной науки, в реакции живого организма на токсическое действие ксенобиотиков одно из важнейших мест занимает усиление процессов свободно-радикального окисления, приводящее к активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) в разных тканях позвоночных и беспозвоночных животных - млекопитающих, птиц, рыб, ракообразных, моллюсков. Регуляция ПОЛ осуществляется согласованной и сбалансированной работой систем антиоксидантной защиты и биотрансформации (детоксикации) ксенобиотиков, представляющих собой единую, энергозависимую, синхронно функционирующую систему, которая обеспечивает удаление потенциально опасных соединений, обладающих высоким деструктивным потенциалом. Поэтому при исследованиях воздействий ксенобиотиков на живые организмы необходим системный подход, позволяющий оценивать состояние всех взаимосвязанных звеньев защиты организма.
Следует отметить, что представители одного и того же класса химических соединений зачастую обладают разными токсическими свойствами. Однако на первых стадиях их воздействия ответные реакции у разных живых организмов реализуются на основе общих молекулярных механизмов токсичности.
В настоящее время начинают использоваться и постоянно создаются пестициды новых поколений. К пестицидам будущего относят несколько химических классов соединений. Одним из направлений синтеза новых пестицидов является химическая модификация арилоксифеноксипропионовых кислот. Еще более перспективны гетероциклические соединения разных рядов, в том числе,- пестициды, принадлежащие к химическому классу тиазолов (неоникотиноидов). В литературе практически нет сведений о потенциальной опасности и механизмах токсического действия пестицидов этих классов.
Целью настоящей работы являлась комплексная оценка уровня свободно-радикальных процессов, интенсивности перекисного окисления липидов, активности антиоксидантных ферментов, состояния глутатионовой системы и активности некоторых ферментов детоксикации в организмах гидробионтов при воздействии пестицидов, относящихся к классам производных арилоксифеноксипропионовых кислот и тиазолов (неоникотиноидов).
Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:
1. Определить уровень свободно-радикальных процессов методом люминол-НгОг-хемилюминесценции (ХЛ) и интенсивность процессов ПОЛ по содержанию одного из молекулярных продуктов - малонового диальдегида (МДА) - в условиях интоксикации указанными пестицидами гидробионтов.
2. Изучить активность антиоксидантных ферменто в супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы - у этих тест-объектов при воздействии пестицидов двух классов.
3. Исследовать состояние глутатионовой системы (уровень глутатиона -GSH, активность глутатионтрансферазы - ГСТ и глутатионредуктазы - ГР) у вышеназванных тест-объектов в тех же условиях.
4. Оценить активность ферментов детоксикации - карбоксил- и ацетил-эстераз - у исследованных гидробионтов при пестицидной интоксикации.
5. Исследовать зависимость изменений изученных биохимических показателей от тест-объекта и химического класса пестицидов.
6. Найти маркеры токсического воздействия пестицидов и оценить их перспективность для диагностических целей.
Краткая характеристика свободных радикалов
Общая особенность свободных радикалов, и АФК в частности - их высокая реакционная способность и малое время жизни в биосубстратах. Высокая реакционная способность АФК делает их высоко токсичными для биологических систем на всех уровнях организации - от молекулярного до организменного. Можно утверждать, что АФК занимают ведущее место в патогенезе радиационного поражения, деструкции тканей, вызванной развитием воспалительной реакции; постишемических, реперфузионных и гипероксических повреждений; а также целого ряда бронхо-легочных, сердечно-сосудистых и генетически обусловленных заболеваний (Зенков и др., 1993). Показано что продукты ПОЛ, такие как альдегиды, эпоксиды, липидные перекиси ингибируют синтез ДНК и деление клеток и в то же время индуцируют развитие опухолей (Зенков и др., 1993). Взаимодействие АФК с ДНК лежит в основе мутагенного, канцерогенного и тератогенного эффектов радикалов. Наиболее чувствительной мишенью для АФК является остаток гуанина, при окислении которого образуется 8-оксигуанозин с последующим возникновением разрывов в ДНК (Брусков и др., 1996). Кроме того, АФК вызывает как прямое повреждение остальных азотистых оснований, так и повреждение рибозы с ее последующей фрагментацией, и образование поперечных сшивок между ДНК и белками и между соседними пиримидиновыми и пуриновыми основаниями (Пескин, 1997).
Выявлен широкий спектр физиологических эффектов АФК, к которым прежде всего относятся регуляция клеточной пролиферации и дифференцировки: они включают каскад реакций, которые передают митотический сигнал при воздействии "физиологических" агентов, таких как факторы роста (Кобляков, 1998). Обнаружена индукция транскрипции определенных генов (в том числе онкогенов и ВИЧ). Известно воздействие АФК на биосинтез белка, причем эта регуляция, очевидно, осуществляется на этапе транскрипции. У млекопитающих АФК модулируют активность двух глобальных транскрипционных факторов NF-азВ и АР-1 (Пескин, 1996). Для ряда АФК (NO, О2"", Н2О2) обнаружено участие в регуляции тонуса сосудов.
Кислород в синглетном состоянии 1 Ag. Синглетный кислород образуется во многих реакциях с участием АФК в виде побочного продукта и в небольших количествах образуется при спонтанной дисмутации супероксидных радикалов. Специализированных систем его генерации не найдено. Эффективными ингибиторами СЬ являются фенольные антиоксиданте, каротиноиды (особенно (3-каротин), гистидин и др. обладает высокой реакционной способностью, что позволяет ему запускать ПОЛ: он в 1500 раз быстрее, чем 02 взаимодействует с жирными кислотами, образуя гидроперекиси. Известно участие 102 в повреждении нуклеиновых кислот (преимущественно гуанина) и индукции канцерогенеза (Меныцикова, Зенков, 1993). Супероксидный анион-радикал (Ої). Образование супероксида обнаружено в нормально функционирующих митохондриях и микросомах (Владимиров и др., 1991), в активированных нейтрофилах, эозинофилах, макрофагах и моноцитах (Клебанов и др., 1988; Basaga, 1990). Ферментативная генерация 0{ происходит при участии ксантиноксидазы (Fridovich, 1970; Щепеткин, 1998), флавинсодержащих дегидрогеназ (Афанасьев, 1979) и ряда других ферментов. Неферментативная генерация супероксида показана при аутоокислении оксигемоглобина и оксимиоглобина (Lassman et. al., 1984), цитохрома Р-450 (Владимиров и др., 1991), аскорбиновой кислоты (Scarpa et. al, 1983), глутатиона, адреналина и норадреналина (Афанасьев, 1979), в Q-цикле при работе двух звеньев электрон-транспортной цепи (Меньщикова и др., 1997; Демин и др., 1998).
Главной системой защиты от 02 является супероксиддисмутаза, которая конвертирует молекулы супероксида в перекись водорода. Кроме того, тушителями 02" являются убихинон, гистидин и аскорбиновая кислота.
Супероксид - весьма реакционно-способное соединение, время его жизни порядка 10 6 сек (Меньщикова, Зенков, 1993). Биоэффекты супероксида прежде всего обусловлены несколькими реакциями: депротонирование и окисление субстратов (что позволяет ему запускать процессы ПОЛ), а также образование Н202 и восстановление Fe3+ (что приводит к образованию ОЫ). Помимо патологической роли 0{ известны и его положительные эффекты: внутриклеточная регуляция, вазомоторное действие; супероксид макрофагов необходим для пролиферации лимфоцитов (Вольский и др., 1988).
При протонировании супероксида образуется пергидроксилъный радикал HOi, который является более стабильной молекулой (время жизни 10" с), и за счет отсутствия заряда способен сравнительно легко мигрировать через мембраны. Он может индуцировать ПОЛ, способен превращаться в Н202 и в 02" , обладает цитотоксическим действием (Меньщикова, Зенков, 1993).
Перекись водорода Н2О2. Известно несколько механизмов генерации перекиси: дисмутация 0{ супероксиддисмутазой; двухэлектронное восстановление Ог ферментами (ксантиноксидазой, оксидазами L-аминокислот и др.) (Роговин и др., 1977); одноэлектронное восстановление 0{ металлами переменной валентности (Си , Fe и т.п.). В клетке существует два основных фермента защиты от перекиси водорода: каталаза и глутатионпероксидаза. Первый эффективно работает при высоких концентрациях перекиси, второй - при низких (Gaetani et. al. 1996).
Биологическое действие перекиси водорода связывают с двумя механизмами (Владимиров и др., 1991): 1) перекись - предшественник других АФК, в том числе гидроксильного радикала ОН, 2) собственное цитотоксическое действие перекиси. Открыто большое число биоэффектов Н2О2, среди которых цитотоксичность, сосудосуживающее действие, ингибирование пролиферации лимфоцитов и др.
Гидроксильный радикал ОН в биосистемах образуется главным образом в результате одноэлектронного восстановления Н202 металлами переменной валентности, в основном Fe: ОН также образуется при окислении арахидоновой кислоты (подлинное трехэлектронное восстановление 02), при микросомальном окислении, в реакциях с флавинами и убихиноном (Куликов и др., 1988; Владимиров и др., 1991; Зенков и др., 1993). Помимо этого установлена генерация ОН с участием аскорбата (Benatti et. al., 1983) и в присутствии тиольных соединений (Rowley, Halliwell, 1982). Специфических систем защиты от ОН нет, хотя его могут перехватывать низкомолекулярные легкоокисляемые соединения типа урацила, глюкозы и т.п.
Механизмы токсического действия пестицидов
В I фазе детоксикация ксенобиотиков происходит через реакции окисления, восстановления, гидролиза. Этот процесс осуществляется с участием цитохрома Р-450, флавинсодержащей монооксигеназы (окисление аминов), неспецифических эстераз и амидаз (гидролизуют эфирные и амидные связи) (Gonzalez, 1993).
Подавляющее большинство реакций I фазы осуществляется цитохромом Р-450 (неспецифическая оксидаза). Именно его активностью обусловлены реакции гидроксилирования, О-, Р- и S-окисления, окислительного и восстановительного дегалогенирования, окислительного десульфурирования и деалкилирования, азо-восстановления. Цитохром Р-450, CYP (КФ 1.14.14.1) является ключевым ферментом системы микросомального монооксигеназного окисления, именно с ним связана биотрансформация сотен ксенобиотиков, включая пестициды (Каган и др., 1988; Гуляева и др., 1994). Помимо CYP в состав монооксигеназного комплекса входят цитохром Ь5, НАДФН-цитохром Р-450-редуктаза и НАДН-цитохром Ь5-редуктаза. (Арчаков, 1985). CYP выполняет каталитическую функцию, а остальные компоненты являются переносчиками электронов. Механизм реакции состоит в переносе двух электронов на гемовую группу цитохрома Р-450 в присутствии молекулярного кислорода, в результате чего один атом кислорода восстанавливается до воды, другой может встраиваться в молекулу субстрата. Отличительной чертой функционирования CYP является стабильная генерация 02 - в ходе реакции (Жуков, Жирнов, 1988). Тройной комплекс фермент-субстрат-кислород до восстановления вторым электроном может вступать в обратимую реакцию превращения в окисленный фермент-субстратный комплекс, высвобождая Ог -. Кроме того, образование супероксида возможно на участке ФПі - цит Ь5. Высвобождение Н2О2 возможно после восстановления комплекса вторым электроном.
CYP представляет собой суперсемейство ферментов, включающих около 100 гемопротеидов с различной, но перекрывающейся субстратной специфичностью (Мишин, Ляхович, 1985). Изоферменты кодируются большим и сложным суперсемейством генов. Наиболее важные в метаболизме чужеродных веществ 4 семейства: CYP1, CYP2, CYP3 и CYP4; они содержатся главным образом в печени. Цитохромы других семейств участвуют в метаболизме стероидов и других физиологически активных соединений в надпочечниках и гонадах (Gonzalez, 1990). Установлено, что в метаболизме пестицидов у пресноводных и морских рыб наибольшее значение имеет подсемейство CYP1A (Gallagher et. al., 1995; Banka et. al., 1997; Flammarion et. al., 1998; Stagg, 1998). Обнаружена индукция подобных CYP1A белков у водных беспозвоночных животных - аннелид, моллюсков, ракообразных и иглокожих под воздействием различных токсинов (Zanger et. al., 1997). При оценке воздействия ксенобиотиков у морских членистоногих, моллюсков и иглокожих были идентифицированы 6 изоформ, относящихся к подсемейству CYP4A (Snyder, 1998).
Помимо CYP в I фазе биотрансформации принимает участие ряд других ферментов. Флавин-содержащая монооксигеназа осуществляет N-, Р- и S-окисление и десульфурирование. Эпоксидгидролаза превращает эпоксиды в трансдигидродиолы. Алкоголь- и альдегид- дегидрогеназы осуществляют превращения спиртов и альдегидов. Путем, альтернативным и/или параллельным пути цитохрома Р-450, является гидролиз сложноэфирных связей в молекуле ксенобиотика. Этот путь осуществляется различными эстеразами, локализованными в разных субклеточных фракциях. К примеру, ацетилэстераза (КФ 3.1.1.6) локализована в микросомах, а карбоксилэстераза (КФ 3.1.1.1) -преимущественно в цитоплазме (Куценко, 2002). Поскольку в работе проведено исследование эстераз, остановимся на них подробнее. В тканях и плазме человека и животных содержатся ферменты, обладающие эстеразной активностью. Их низкая специфичность обеспечивает гидролиз эфиров различного строения. Из 78 ферментов подподкласса 3.1.1 рассмотрим два: карбоксилэстераза и ацетилэстераза. Карбоксилэстераза (КФ 3.1.1.1) (гидролаза карбоксиловых эфиров) Реакция: карбоксиловый эфир + Н20 = спирт + карбоксиловый анион Другие названия: али-эстераза, В-эстераза, монобутираза, кокаинэстераза, прокаинэстераза, метилбутираза, бутирилэстераза, бутиратэстераза, эстераза витамина А, неспецифическая карбоксилэстераза; эстераза D, В или А; серинэстераза и др. Комментарии: широко распространена и обладает низкой субстратной специфичностью; также катализирует реакции ферментов КФ 3.1.1.2 (арилэстераза), КФ 3.1.1.6 (ацетилэстераза) и ряда других ферментов этой группы (http://www.chem.qmul.ac.Uk/iubmb/enzyme/EC3/l/l/l .html). Ацетилэстераза (КФ 3.1.1.6) (ацетил-эфир ацетилгидролаза) Реакция: ацетиловый эфир + Н20 = спирт + ацетат Другие названия: С-эстераза (в животных тканях), гидролаза ацетиловых эфиров, п-нитрофенилацетат эстераза, ацетилэстераза цитрусовых (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/en2yme/EC3/l/l/6.html). Описанные пути трансформации объединяют в I фазу детоксикации. Ко II фазе относят реакции конъюгации, кратко перечисленные ниже (Голиков и др., 1986; Гуляева и др., 2000). Трансформированные ксенобиотики вступают в одну из возможных реакций конъюгации: глюкоронидную, сульфатную, метилирования, ацетилирования, с глутатионом, с глутамином и с аминокислотами В этой группе реакций ведущую роль отводят ряду ферментов. УДФ-глюкуронилтрансфераза переносит остаток глюкуроновой кислоты на молекулу ксенобиотика, а глутатион-8-трансфераза - глутатион. Общим для этих двух ферментов является то, что в результате обеих реакций образуются метаболиты, менее токсичные, чем исходные вещества, а сами эти реакции относят к безусловному пути детоксикации. При действии сульфотрансферазы и N-ацетилтрансферазы, переносящих, соответственно остаток серной или уксусной кислоты, могут образовываться более реакционные метаболиты, в связи с чем данные называют условным путем детоксикации. у-глутамил-транспептидаза участвует в превращении конъюгатов ксенобиотиков с глутатионом.
Объекты и материалы исследования
В основе метода лежит реакция распада Н202, катализируемая соединениями Fe с образованием ОН и Н02", вызывающих окислительную ХЛ люминола, интенсивность которой определяли на хемилюминометре (ИОНХ, Украина) с детектором ФЭУ-37 в составе сцинтилляционного измерительного зонда VA-S-968 (RTF) и базового сцинтилляционного спектрофотометра 22028 (RTF), а также цифропечатного устройства и самописца.
Вторичным (промежуточным) продуктом ПОЛ является малоновый диальдегид. Его количество определяли колориметрическим способом (Стальная, Гаришвили, 1977). Метод основан на образовании в кислой среде триметинового комплекса, состоящего из одной молекулы МДА и двух молекул 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК), который обладает розовым цветом. Интенсивность окраски пропорциональна количеству МДА. Содержание МДА рассчитывали исходя из е0= 1.56-105М"1см 1л и выражали в нМолях на мг общего белка [нМоль /мг белка].
СОД является антиоксидантным ферментом, дисмутирующим 02 . Его активность определяли колориметрическим способом комбинацией методов (Fried, 1975 и Черемисина и др., 1994). Определение основано на способности СОД ингибировать восстановление нитросинего тетразолия НСТ (Fried, 1975) в условиях генерации 02" , которая осуществляется при окислении адреналина в адренохром при участии 02 (Черемисина и др., 1994). Активность фермента выражали в условных единицах на мг белка в минуту [у.е. / мг белка мин]. За условную единицу активности фермента принимали 50 % ингибирование скорости восстановления НТС.
Активность каталазы, антиоксидантного фермента, разлагающего Н2Ог определяли колориметрически (Королюк и др., 1988). Метод основан на том, что неразложившаяся перекись водорода образует с молибдатом аммония комплекс желтого цвета. Активность каталазы рассчитывали, исходя из Єо=22,2-103 MM CM V И выражали в международных единицах на мг общего белка [ME / мг белка].
Определение содержания восстановленного глутатиона (GSH) GSH является низкомолекулярным антиоксидантом и косубстратом ряда глутатионовых ферментов. Его содержание определяли по реакции с реактивом Эллмана (5,5-дитиобис-(2-нитробензойной) кислотой), в которой образуется соединение с максимумом поглощения при А,=412 нм (Ellman, 1959). Количество GSH определяли по калибровочной кривой и выражали в мкМолях на мг белка [мкМ / мг белка].
Конъюгирующую активность ГСТ, фермента, осуществляющего реакцию конъюгации глутатиона с ксенобиотиками и продуктами ПОЛ, определяли фотометрическим способом (Habig et.al., 1974). Метод основан на том, что конъюгат глутатиона с субстратом 1-хлор-2,4-динитро-бензолом обладает максимумом поглощения при =340 нм с Єо = 9,6 нМ_,см" л. Активность фермента выражали в международных единицах на мг общего белка [ME / мг белка].
Активность фермента, осуществляющего реакцию восстановления окисленного глутатиона за счет окисления NADP-H, определяли фотометрически (Юсупова, 1989). Метод основан на измерении скорости окисления NADP-H, которая регистрируется по уменьшению поглощения восстановленной формы этого кофермента при А,=340 нм. Активность рассчитывали по є0 = 6,22-106 М см л и выражали в международных единицах на мг общего белка [ME / мг белка].
Активность карбоксилэстеразы, гидролизующей карбоксильные сложноэфирные связи, определяли колориметрическим способом с субстратом сс-нафтилацетатом (Временные методические указания ..., 1987). Метод основан на определении в реакции азосочетания а-нафтола, выделяющегося при ферментативном гидролизе субстрата. Активность фермента рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в международных единицах на мг белка [ME / мг белка].
Активность ацетилэстеразы, гидролизующей ацетильные сложноэфирные связи, определяли фотометрическим способом с субстратом п-нитрофенилацетатом (Покровский, Арчаков, 1968). Метод основан на фотометрическом определении «-нитрофенола, выделяющегося при ферментативном гидролизе субстрата. Активность фермента рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в милли международных единицах на мг общего белка [мМЕ / мг белка].
Количество общего белка определяли методом Лоури (Lowry et.al.,1951) Метод основан на образовании окрашенных продуктов в реакции ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Количество белка рассчитывали по калибровочному графику, построенному по альбумину, и выражали в мг на мл пробы [мг/мл].
Статистическая обработка полученных результатов Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработке (Лакин, 1973). Рассчитывали среднее арифметическое значение ряда М и среднеквадратичное отклонение т. Средние значения сравнивали по t-критерию Стьюдента для малых выборок, оценивая резко отклоняющиеся варианты по критерию Шовене (Кокунин, 1975). Различия между двумя выборками считали достоверными при р 0,05.
Интенсификация сельского хозяйства неразрывно связана с созданием и применением разнообразных химических средств защиты растений -пестицидов. Несмотря на огромную экономическую пользу, их применение неизбежно связано с негативными экологическими последствиями -загрязнением окружающей среды. Многократно показано (Niimi, Whittle, 1994; Kidd et.al., 1995; Ракитский, 1997), что пестициды способны аккумулироваться в живых организмах и передаваться по трофическим цепям. Изучение влияния пестицидов на метаболические процессы в живых организмах является необходимым условием их регламентирования в окружающей среде, в том числе, в воде рыбохозяйственных водоемах.
В существующей научной литературе практически нет сведений о потенциальной опасности и биологической активности новых поколений пестицидов. Тем не менее, они могут попадать в водоемы и представлять опасность для водных сообществ и, в конечном итоге, для человека.
Рядом исследований показано, что пестицидная интоксикация сопровождается активацией свободнорадикальных процессов, что приводит к изменению интенсивности ПОЛ и систем его регуляции (Леоненко, 1996; Кесельман, 1997; Москвичев, 2000, Левина, 2002). Однако в этой области остается много неисследованного - не до конца изучены закономерности этих процессов у представителей различных групп гидробионтов, в том числе связь между процессами ПОЛ, состоянием антиоксидантной системы и активностью системы детоксикации у водных организмов. Кроме того, исследование механизмов действия пестицидов имеет и фундаментальное значение - изучение общих закономерностей токсических воздействий.
Интенсивность процесса ПОЛ у гидробионтов
Как из нее следует, в печени активность каталазы в среднем составила 12,16 МЕ/мг белка (контроль I - 12,19 и 11,89 МЕ/мг белка; контроль II 58 12,37 и 12,17 МЕ/мг белка). Фуроре, не влияя на активность фермента на 1-е сутки, снижал ее на 2-4-е сутки (9,64 и 10,38 МЕ/мг белка). Фюзилад, напротив, активировал фермент на 1-2-е сутки (16,51 и 16,11 МЕ/мг белка). Тиазоловые пестициды не влияли на активность каталазы, в одном случае зафиксирована активация (15,92 МЕ/мг белка) при действии тиаклоприда на 2-е сутки. что и в печени. Фуроре ингибировал фермент на 2-4-е сутки (0,41 и 0,29 МЕ/мг белка); а фюзилад - активировал каталазу на 1-2-е сутки (0,98 и 0,83 МЕ/мг белка). Тиазолы практически не влияли на активность фермента. Таким образом, сравнение удельной активности каталазы свидетельствует о том, что она максимальна у головастика (21,53 МЕ/мг белка), примерно вдвое ниже - в печени карпа (12,16 МЕ/мг белка). Значительно ниже она в организме моллюсков - 3,20 МЕ/мг белка; и минимальна - в жабрах карпа (0,67 МЕ/мг белка). Динамика каталазы показана на рис. 4. У головастика шпорцевой лягушки фуроре и фюзилад ингибировали фермент на 1-е сутки (-15% и -14%), а затем активность поднималась до показателей нормы. Тиазолы, напротив, не влияли на активность каталазы на 1-е сутки, зато активировали фермент на 2-4-е (+15...+31%). Для воздействия пестицидов на моллюсков характерна активация каталазы, выраженная в разной степени в разные сроки эксперимента. Наиболее сильно она проявилась при действии фюзилада (+16...+22%), а актара вообще не влияла на активность каталазы. Весьма сложны изменения активности каталазы в органах карпа. В печени карпа фуроре ингибировал фермент на 2-4-е сутки (-21...-15%). Фюзилад, напротив, активировал каталазу на 1-2-е сутки (+39...+36%). При действии тиаклоприда зафиксирована активация на 2-е сутки (+31%), а актара не влияла на фермент. В жабрах карпа картина изменений была идентичной динамике фермента в печени, разве что изменения выражены сильнее: фюзилад и тиаклоприд активировали каталазу, фуроре ингибировал его, а актара не оказывала никакого эффекта. Анализ литературных данных позволил обнаружить разнородную информацию. В ряде исследований были получены "классические" результаты: токсическое воздействие сопровождалось усилением ПОЛ и активацией антиоксидантных ферментов. К примеру, введение крысам линдана сопровождалось приростом МДА в сыворотке и активацией СОД и каталазы в эритроцитах (Ahmed et.al, 2001). В уже упомянутых выше работах обнаружено, что малатион вызывал повышение уровня МДА и активности СОД и каталазы в эритроцитах и печени крыс (Akhgari et.al, 2003), а у личинок рыб Atherina hepsetus усиление загрязнения водной среды сопровождалось приростом МДА и повышением активности СОД и каталазы. В некоторых работах обнаружен дисбаланс изменения активности этих ферментов-синергистов. Так, загрязнение полихлорбифенилами вызывало у рыб Ameiurus nebulosus активацию СОД в печени и ингибирование каталазы в почках (Otto, Moon, 1996). Пиретроид фенвалерат активировал СОД, но не влиял на активность каталазы и содержание МДА у рыб Oreochromis niloticus (Огас et.al, 2003). Любопытны данные по влиянию аминотриазола на два вида лягушек: показано, что степень ингибирования каталазы зависит от концентрации токсиканта и видовой принадлежности (Лущак и др., 2003). Таким образом, полученные нами данные о сложных изменениях активности (с преимущественным активированием) антиоксидантных ферментов СОД и каталазы имеют подтверждения в литературе. Анализ результатов исследования воздействия пестицидов на антиоксидантные ферменты свидетельствует о следующем. Воздействие всех пестицидов на головастика вызывало ингибирование СОД и каталазы на 1-е сутки, а затем активность ферментов повышалась. У моллюсков пестицидная интоксикация сопровождалась активацией обоих ферментов, причем фуроре и фюзилад вызывали усиливающуюся во времени активацию. В тканях карпа только в печени зафиксирована следующая картина: активация СОД на 1-2-е сутки, а к 4-м активность приходит к нормальным значениям. Активность СОД в жабрах, а также каталазы в печени и жабрах карпа, преимущественно, возрастали, однако в большинстве случаев отчетливой динамики изменений не выявлено. Целью данного этапа исследований была оценка состояния глутатионовой системы в организмах гидробионтов при пестицидном воздействии. Были определены содержание глутатиона GSH, а также активность ферментов ГСТ и ГР. Результаты исследования представлены в таблицах 13-21. Динамика содержания GSH у головастиков представлены в табл. 13. Как из нее следует, среднее значение уровня GSH в норме составило 14,61, при этом в контроле I оно равнялось 16,50, а в контроле II - 12,72. Воздействие фуроре и фюзилада, не проявившись на 1-е сутки, на 2-4-е повышало уровень GSH до величин 22,67 - 33,84 мкМ/мг белка. Воздействие актары и тиаклоприда на 1-е сутки снизило содержание GSH (11,03 и 8,05 мкМ/мг белка), на 2-е оно повысилось до контрольных значений, а на 4-е -превысило контроль до величин 15,96 и 15,06 мкМ/мг белка.
