Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о патохимии сахарного диабета 1 типа и роль свободнорадикальных процессов в развитии его поздних осложнений (обзор литературы). 12
Глава 2. Материалы и методы исследования 34
2.1 Характеристика обследованных контингентов 34
2.2 Биохимические методы исследования 41
2.2.1. Изучение липидного спектра плазмы крови и оценка вторично модифицированных липопротеидов 41
2.2.2. Определение продуктов перекисного окисления липидов..43
2.2.3. Изучение системы антиоксидантной защиты 44
2.3. Методы статистической обработки 44
Глава 3. Результаты исследования 46
3.1. Разработка методологии лабораторного изучения липопротеидного распределения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови человека 46
3.2. Состояние системы «перекисное окисление липидов -антиоксидантная защита» и липопротеидное распределение продуктов перекисного окисления у больных с сосудистыми осложнениями сахарного диабета 1 типа 54
3.3. Неферментное гликозилирование ЛПВП и выраженность дислипидемических расстройств у больных с сосудистыми осложнениями сахарного диабета 1 типа 66
Глава 4. Обсуждение полученных результатов .73
5. Выводы 84
Список литературы 86
- Характеристика обследованных контингентов
- Изучение липидного спектра плазмы крови и оценка вторично модифицированных липопротеидов
- Разработка методологии лабораторного изучения липопротеидного распределения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови человека
- Неферментное гликозилирование ЛПВП и выраженность дислипидемических расстройств у больных с сосудистыми осложнениями сахарного диабета 1 типа
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Проблема сахарного диабета относится к числу наиболее важных медико-социальных проблем современного общества. В первую очередь это касается сахарного диабета первого типа (СД 1). СД 1 чаще всего дебютирует в детском возрасте, протекает хронически и к | моменту достижения зрелого трудоспособного возраста становится причиной многочисленных поздних осложнений (Балаболкин М.И., 1994; Мазовецкий А.Г., Велихов В.К., 1987; Самохвалова М.А. и соавт., 1976;RobbenH., 1979). 1 Невзирая на очевидные успехи в развитии заместительной инсулинотерапии при СД 1, данная нозологическая форма продолжает оставаться источником клинически значимых поздних осложнений (Балаболкин М.И., 1997; Богданович В.Л., 1997; Дедов И.И., Фадеев В.В., 1998; Bertrams J., 1983). Поздние осложнения СД 1 носят системный характер, т.е одновременно поражают различные органы и
Ь ткани. Это касается диабетических поражений глаз, периферической и центральной нервной системы, желудочно-кишечного тракта, ' мочеполовой системы, опорно-двигательного аппарата, кожных покров и т.д. (Ефимов А.С., 1988; Федорова П.И., 1985; Дедов И.И., Фадеев В.В., 1998; Bibergeil Н., MicheelisD., 1983; ParvingH.H. et al., 1985).
Системный характер органной патологии у больных СД 1 во многом связан с таким стереотипным процессом, как диабетические ангиопатии, которые затрагивают как магистральные резистивные сосуды (диабетические макроангиопатии), так и микрососуды обменного сектора (диабетические микроангиопатии) (Долгов В.В., 1983; Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Чазова Т.Е., 1998; Andrew R. et al., 2001; Ksizaek К., 2001). В настоящее время сложилось устойчивое мнение, что для больных СД 1 наиболее типичным является развитие микроангиопатии, в то время как макроангиопатии наиболее характерны для больных сахарным диабетом второго типа (СД 2) (Ефимов А.С., 1988; Эрдманис Д.С., 1986; LundbaekK., und and., 1971а). ь Развитие диабетических макроангиопатии при СД 2 принято рассматривать как следствие вторичных дислипидемических расстройств и ускоренного атерогенеза в связи с неферментными ковалентными модификациями апо-липопротеинов (Куприянов В.В. и i^ соавт., 1993; Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Boylanger СМ. et al., 1992; Erkelens D.W., 1998; KesavuluM.M. et al., 2001). Следует подчеркнуть, что подобные модификации апо-липопротеинов могут возникать и у больных СД 1. Не удивительно, что при СД 1 достаточно часто отмечается развитие макроагиопатии, приводящих к развитию ишемического инсульта и острого инфаркта миокарда у | больных относительно молодого возраста (Долгов В.В., 1983;
Балаболкин М.И., Чернышова Т.Е., 1989, Денисенко Т.В., 1990; і Соколов Е.И., 1996; Mezetti et al., 2000). В связи с этим особого внимания заслуживает концепция единого механизма развития диабетических ангиопатий, который касается патогенеза как микро-так и макроангиопатии (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 2000).
Представления о стереотипном механизме развития ангиопатических поражений связаны с универсальным пато-
Ь химическим механизмом поражения сосудистой стенки (интимы и медии) и ковалентной модификацией циркулирующих липопротеинов (СпесивцеваВ.Г. и соавт., 1982; LundbaekK., 1971). Установлено, что этот стереотипный механизм обусловлен двумя главными моментами. Во-первых, неферментативным гликозилированием белков и во-вторых, активацией свободнорадикального (перекисного) окисления липидов (ПОЛ) (Балаболкин М.И., Креминская В.М., 1999; Вербовая Н.И., Лебедева Е.А., 1997; Davison G.W. et al., 2002). Следует подчеркнуть, что гликозилирование липопротеинов является фактором, значительно увеличивающим их чувствительность к ПОЛ-индуцирующим воздействиям (Ефимов А.С., Науменко В.Г., 1985; Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995).
Опираясь на универсальное значение ПОЛ в развитии диабетических ангиопатий и современные клинико-биохимические возможности оценки различных категорий липопероксидов в одной пробе (Волчегорский И.А. и соавт., 1989, 2000), представляеся актуальным разработать лабораторный алгоритм верификации характера ангиопатических поражений у больных СД 1. Создание такого алгоритма может способствовать раннему, доклиническому выявлению диабетических микро- и макроангиопатий с опережающим назначением соответствующей терапии.
Цель работы.
Исходя из вышеизложенного, в работе была поставлена цель: изучить показатели системы «перекисное окисление липидов -антиоксидантная защита» в сопоставлении с выраженностью дислипидемических расстройств и клиническими проявлениями ангиопатических осложнений у больных сахарным диабетом 1 типа.
Задачи исследования.
Для достижения данной цели было необходимо решить следующие задачи:
Оценить сдвиги содержания продуктов ПОЛ в крови больных СД 1 по мере развития диабетических ангиопатий.
Оценить динамику ПОЛ-зависимой модификации липротеиновых фракций плазмы крови в сопоставлении с развитием дислипидемических расстройств у больных с сосудистыми осложнениями СД 1.
Выявить категории продуктов ПОЛ, являющихся наиболее информативными маркерами перекисной модификации различных фракций липопротеинов.
Провести сопоставительный анализ уровня продуктов ПОЛ и ПОЛ-зависимой модификации липопротеинов плазмы крови в зависимости от наличия и характера ангиопатий у больных СД 1.
Провести сопоставительный анализ концентрации а-токоферола и церулоплазмина в зависимости от наличия ангиопатического процесса у больных СД 1.
Научная новизна.
Впервые проведен сопоставительный анализ показателей системы «ПОЛ-АОЗ» у больных с диабетическими микро- и макроангиопатиями. Установлен факт существенной активации ПОЛ у больных СД 1 без сосудистых осложнений. Впервые продемонстрировано относительное снижение интенсивности ПОЛ по мере развития диабетических микроангиопатий. Показано, что наиболее существенное накопление продуктов ПОЛ в крови отмечается у больных с диабетическими макроангиопатиями.
Установлено, что активация ПОЛ у больных с сосудистыми осложнениями СД 1 сопровождается угнетением системы АОЗ. Впервые показано, что наиболее существенное угнетение АОЗ отмечается у больных СД 1 с диабетическими макроангиопатиями.
Продемонстрировано, что активация ПОЛ у больных с сосудистыми осложнениями СД 1 сопровождается ПОЛ-зависимой модификацией как ЛПВП, так и суммарной фракции атерогенных липопротеинов (ЛПНП+ЛПОНП). Продемонстрирована связь между ПОЛ-зависимой модификацией циркулирующих липопротеинов и развитием вторичных дислипидемических расстройств у больных с сосудистыми осложнениями СД 1.
Установлено, что диабетические макроангиопатии у больных СД 1 сопровождаются более выраженным дисбалансом в системе «ПОЛ-АОЗ» в сочетании с более выраженными атерогенными сдвигами липидограмм по сравнению с больными, страдающими микроангиопатиями.
Практическая значимость.
В процессе выполнения диссертационного исследования был разработан лабораторный метод дифференциальной оценки содержания продуктов ПОЛ в ЛПВП и суммарной фракции атерогенных липопротеинов (ЛПНП+ЛПОНП).
Полученные результаты могут быть использованы для лабораторного выявления латентно протекающих ангиопатических процессов у больных СД и выделения групп риска по преимущественному развитию микро- и макроангиопатии среди больных СД 1.
Структура и объем диссертации.
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, содержащей результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 11 таблиц и 4 рисунка. Список литературы включает 239 цитируемых источников, из них 136 - на русском языке, 103 - иностранных источника.
Результаты внедрения в практику.
Результаты исследования внедрены в практику отделений клинической лабораторной диагностики МУЗ ГКБ №1 г. Челябинска и Областной клинической больницы №1.
Апробация диссертации и публикации.
Материалы исследования доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия» (Москва, 2002г.), на IV Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002г.) и на совместном заседании кафедр биоорганической химии и фармакологии Челябинской государственной медицинской академии (2004 г.)
Материалы диссертационного исследования опубликованы в пяти печатных работах, представленных на страницах центральных изданий.
Положения, выносимые на защиту.
1. Развитие сосудистых осложнений СД 1 типа сопровождается признаками дисбаланса в системе «ПОЛ-АОЗ».
Активация ПОЛ и угнетение АОЗ у больных СД 1 сопровождается развитием вторичных дислипидемических расстройств и наиболее ярко проявляется на фоне развития диабетических макроангиопатий.
Развитие диабетических микроангиопатий сопровождается относительным снижением содержания продуктов ПОЛ в плазме крови и менее выраженным угнетением АОЗ по сравнению с диабетическими макроангиопатиями.
Гептан-экстрагируемые продукты ПОЛ являются информативными маркерами ПОЛ-зависимой модификации ЛПВП при СД 1. Изопропанол-растворимые продукты ПОЛ являются наиболее информативными маркерами ПОЛ-зависимой модификации атерогенных липопротеинов.
Характеристика обследованных контингентов
Еще в начале 70-х годов прошлого века было показано, что малоновый диальдегид, считавшийся основным ТБК-хромогенным продуктом ПОЛ, вносит лишь 2%-ный вклад в развитие соответствующей цветной реакции (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972). Большая часть ТБК-хромогенных веществ образуется в процессе проведения самого ТБК-теста, постановка которого связана с нагреванием биологического материала, помещенного в кислую среду. Помимо этого, 2-ТБК легко формирует окрашенные комплексы с биогенными веществами нелипидной природы. К числу таких веществ относятся: глюкоза, нуклеиновые, сиаловые кислоты и т.д. Изложенные обстоятельства делают применение ТБК-теста некорректным (по крайней мере в виде единственного метода) для изучения процессов ПОЛ in vivo. Вместе с тем следует признать, что ТБК-тест является удобным, доступным и информативным подходом к оценке липопероксидации, индуцируемой в модельных системах in vitro (Коган В.Е. и соавт., 1986). Более трудоемким и вместе с тем более оправданным подходом к изучению липопероксидации являются экстракционно-спектрофотометрические методы определения конъюгированных двойных связей в переокисляющихся жирных ацилах. Известно, что перегруппировка двойных связей в диеновые конъюгаты при переокислении полиеновых ацилов сопровождается изменением спектра поглощения липидов в УФ-области, что ведет к появлению нового достоверно четко ограниченного максимума при 232-238 нм. Это обстоятельство позволяет судить о содержании гидроперекисей в липидном экстракте по величине его оптической плотности при этих длинах волн (Bolland J.L., Koch Н.Р., 1945; Watson B.D. et al., 1984; Halliwell В., Gutteridge J.M.S., 1985). Окислительная деструкция липидных гидроперекисей сопровождается появлением еще одного максимума в спектре поглощения, границы этого максимума более расплывчаты и по данным разных авторов колеблются в диапазоне 260-290 нм. (Klein R.A., 1970; Watson B.D. et al., 1984). Показатель оптической плотности в данном диапазоне рассматривается как мера содержания разнородной совокупности вторичных (карбонильных) продуктов липопероксидации (Watson В.D. et al., 1984). Данные особенности изменения липидного спектра в процессе ПОЛ позволяют осуществлять параллельную регистрацию как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ. Данный аналитический принцип широко используется для регистрации продуктов ПОЛ в гептан-изопропаноловых экстрактах биологического материала. К сожалению, соответствующие методы, являющиеся модификацией оригинальной методики З.Плацер и соавт. (1970), имеют однотипный недостаток: так, в методике В.В. Гаврилова и Н.И. Мишкорудной (1983), конъюгированные диены регистрируются только в гептановой фазе липидного экстракта, которая содержит триглицериды, этерифицированный холестерин и свободные жирные кислоты. Метод В.А. Костюка и соавт., наоборот, предусматривает регистрацию диеновых конъюгатов в изопропанольной фазе липидного экстракта, который извлекает преимущественно фосфолипиды.
Отмеченная неполнота экстракционно-спектрофотометрических методов была преодолена в методике И.А. Волчегорского и соавт. (1989, 2000), которая предусматривает параллельную регистрацию продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта после очистки этих фаз от нелипидных примесей. Применение этого подхода позволило регистрировать разнонаправленные сдвиги содержания гептан- и изопропанол-растворимых липопероксидов при различных ПОЛ-индуцирующих воздействиях. При этом установлено, что глубокая свободнорадикальная деструкция фосфолипидов сопровождается снижением уровня изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ с одновременным нарастанием гептан-растворимых липопероксидов (Волчегорский И.А. и соавт., 2003; Львовская, 1998). Такая разнонаправленность сдвигов позволяет считать, что нарастание гептан-экстрагируемых липопероксидов обусловлено «вырезанием» переокисленных ацилов из структуры фосфолипидов фосфолипазой А2 с последующим перераспределением их в гептановую фазу липидного экстракта (Волчегорский И.А. и соавт., 2003). В специальных исследованиях было установлено, что применение метода И.А. Волчегорского и соавт. (1989, 2000) для определения продуктов ПОЛ позволило продемонстрировать маркерное значение липопероксидов в диагностике хронической сердечной недостаточности (Волчегорский И.А. и соавт., 2003а), выявлении групп риска по инфекционно-воспалительным осложнениям эндоурологических вмешательств (Волчегорский И.А., Попов А.Н., 2000), а также в определении объективизации тяжести состояния больных с глубокими и обширными термическими ожогами (Волчегорский И.А. и соавт., 1989). Стоит добавить, что совокупность показателей ПОЛ, определенных методом Волчегорского И.А. и соавт. (1989, 2000), хорошо отражает особенности иммунного и психологического статуса здорового человека (Волчегорский И.А. и соавт., 20036; Волчегорский И.А., Хребтова А.Ю., 2004).
Углубленное методологически корректное изучение процессов липопероксидации не представляется возможным без параллельной оценки системы антиоксидантной защиты (АОЗ). С позиций биохимического раздела клинико-лабораторной диагностики, основным объектом исследования которой является жидкая часть периферической крови (плазма или сыворотка), достаточно подробную информацию о состоянии АОЗ можно получить путем регистрации как минимум двух показателей: а-токоферола (а-ТК) и церулоплазмина (ЦП). Следует подчеркнуть, что собственно антиокислительный потенциал плазмы крови зависит от содержания в ней церулоплазмина (Санина О.Л., Берлинских Н.К., 1986). В то же время токоферол плазмы крови не имеет отношения к ее антиокислительному потенциалу, но отражает степень удовлетворенности потребности организма в витамине Е (Надиров Н.К., 1991; Je H.D. et al., 2001). Следует отдельно подчеркнуть, что показатели АОЗ являются более информативными маркерами функционального класса сердечной недостаточности (Волчегорский И.А. и соавт, 2003а) и интеллектуальных возможностей человека (Волчегорский И.А., Хребтова А.Ю., 2004), чем продукты перекисного окисления липидов.
Взаимоотношения между показателями ПОЛ и АОЗ не столь однозначны, как это может показаться на первый взгляд (Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г., 1985; Журавлева Т.Д. и соавт., 2003). Установлено, в частности, что высокая антиокислительная активность плазмы крови связана с относительно высоким содержанием первичных изопропанол-растворимых продуктов липопероксидации (Волчегорский И.А., Хребтова А.Ю., 2004). Обсуждая подоплеку этой взаимосвязи, авторы высказали предположение о том, что сывороточные антиоксиданты препятствуют окислительной деструкции первичных молекулярных продуктов ПОЛ и их переходу во вторичные (цитотоксичные) липопероксиды.
Изучение липидного спектра плазмы крови и оценка вторично модифицированных липопротеидов
Нами был предпринят сравнительный анализ результатов определения липопротеидного распределения продуктов ПОЛ с помощью трех различных систем осаждения апо-В-содержащих липопротеидов. Изучены образцы сыворотки крови, полученной натощак у 10 человек (5 мужчин и 5 женщин) без нарушений липидного обмена и клинических проявлений атеросклероза. Каждый образец сыворотки делили на 3 порции, в которых проводили фракционирование ЛП с помощью 3-х различных систем осаждения апо-В-содержащих ЛП. В качестве осаждающих реактивов использовали стандартную смесь фосорновольфрамовой кислоты и MgCb из наборов «HLD-CHOL-250 Е» (LACHEMA, Bio-Laest, Чехия). МпСЬ и гепарин (Камышников B.C., 2000) , а также СаСЬ и гепарин (Колб В.Г., Камышников B.C., 1976). В последнем случае для более полного осаждения атерогенных ЛП длительность инкубации сыворотки в присутствии Са и гепарина была увеличена до 5 минут. В остальных случаях осаждение проводилось в точном соответствии с общепринятыми методами (Камышников B.C., 2000). Полученные суспензии разделяли центрифугированием на ЛПВП-содержащий супернатант и осадок апо-В-содержащих ЛП. Осадок однократно промывали 0,9 % NaCl и затем суспендировали в 0,5 мл 0,9 % NaCl. Определение продуктов ПОЛ в ЛПВП-содержащей надосадочной жидкости и суспендированном преципитате апо-В-содержащих ЛП проводили спектрофотометрически с раздельной регистрацией липопероксидов гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта (Волчегорский И.А. и соавт., 1989; Волчегорский И.А. и соавт., 2000). Помимо фракционного определения продуктов ПОЛ исследовали содержание ХС в ЛПВП, выделенных с помощью изученных систем осаждения общее содержание ХС (ХСобщ.) и ТГ сыворотки крови. На основании полученных данных рассчитывали коэффициент атерогенности (КА). Дополнительно оценивали степень гликозилирования ЛПВП, выделенных с помощью каждой из полученных систем осаждения. Для этого регистрировали содержание фруктозамина в расчете на 1 грамм белкового компонента ЛПВП (Викторова Л.Н., Городецкий Д.Г., 1990; Камышников B.C., 2000; Меньшиков В.В. и соавт., 1987). В результате проведенного исследования было установлено, что характер системы осаждения практически не влияет на показатели содержания продуктов ПОЛ во фракциях ЛП. Прежде всего это касается гепарин-кальциевого осадителя и смеси фосфорновольфрамовой кислоты с MgCte, между которыми не удалось выявить значимых различий ни по одному из изученных показателей (табл. 4). Использование гепарин -марганцевого осадителя привело к статистически достоверному приросту уровня изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ в суммарной фракции атерогенных ЛП, а также изопропанол-растворимых ДК и гептан-экстрагируемых КД и СТ во фракции ЛПВП. Несмотря на статистически значимый характер повышения уровня липопероксидов, выраженность этого прироста составила лишь 4,8 % от соответствующих величин, полученных с использованием других осадителей. Скорее всего, этот феномен может быть следствием ПОЛ-индуцирующего действия Мп , который относится к d-элементам таблицы Менделеева, так же как железо и медь, прооксидантная активность которых общеизвестна (Биленко М.В., 1989; Владимиров Ю.А., Арчаков P.M., 1972; Камышников B.C., 2000). Как видно (табл.5), содержание ЛПВП -ассоциированного фруктозамина при использовании гепарин -марганцевого осадителя оказалось на 35-48 % выше соответствующих показателей, полученных с использованием двух других систем осаждения. Вполне возможно, что ионы Мп обусловливают также увеличение скорости восстановления НТС в присутствии фруктозамина, что приводит к ошибке завышения при определении гликозилированных ЛПВП.
Использование гепарин - марганцевого осадителя считается предпочтительным подходом к фракционированию ЛП для определения ХС-ЛПВП (КейтсМ., 1975; Камышников B.C., 2000). Справедливость этого положения проявилась в достоверном повышении величин ХС-ЛПВП, полученных с использованием гепарин-Мп2+ системы осаждения, по сравнению с аналогичным показателем на фоне применения смеси фосфорновольфрамовой кислоты с Mg (табл.5).
Разработка методологии лабораторного изучения липопротеидного распределения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови человека
Диабетические ангиопатии являются широко распространенными поздними осложнениями сахарного диабета (Балаболкин М.И., 2000; Дедов И.И. и соавт., 1998; Geiss L.S., Herman W.H., Smith P.J., 1995). Невзирая на современные представления о стереотипном комбинированном характере поражения резистивнои части сосудистого сектора при сахарном диабете, ангиопатии традиционно подразделяют на микроангиопатии и макроангиопатии (Ефимов А.С., 1989; Балаболкин М.И., Креминская В.М., 1999а; Von Heine F., 1987; Report of a WHO Consultation, 1999).
Микроангиопатии рассматриваются главным образом как сосудистые осложнения СД 1 типа, в то время как макроангиопатии считаются следствием ускоренного атерогенеза, преимущественно у больных СД2 типа (Ефимов А.С., 1989; Балаболкин М.И., Чурмантаева Г.Х., 1989; Левина Л.И., 1989; Seiler S., Zeichen R., 1985).
Вместе с тем, СД 1 типа также характеризуется существенным ускорением атерогенеза, клинические проявления которого нередко отмечаются у 30-40-летних больных СД 1 типа (Зелинский Б.А., 1984; Bertams J., 1983; Bibergeil Н., MicheelisD, 1983). Показано также, что развитие вторичной дислипидемии, весьма характерной для СД, вносит существенный вклад не только в атеросклеротическое поражение крупных магистральных артерий, но и в развитие микроангиопатии при СД (Балаболкин М.И., 2000; Дедов И.И. и соавт. 1998; OberdisseK, Irmscherk К., 1985; Verdejo С. et al., 1999; Miyata Т., 2003). В настоящее время не вызывает сомнения причастность так называемого оксидативного стресса к развитию вторичных дислипидемий и атерогенеза (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; ЗенковН.В., ЛанкинВ.З., Меньшикова Е.Б., 2001; Fein E.F., 1986; GurlerB., 2003). При этом полиненасыщенные жирнокислотные остатки проявляют наибольшую уязвимость к свободнорадикальной атаке, в результате которой формируются молекулярные продукты перекисного окисления липидов (Владимиров Ю.А., Арчаков P.M., 1972; Бергельсон Л.Д., 1975; ЛанкинВ.З., и соавт., 2001; DescoM.C, 2002).
Процесс липопероксидации достаточно хорошо отражает выраженность оксидативного стресса. Особенно информативным является одновременная регистрация содержания продуктов ПОЛ и показателей системы антиоксидантной защиты (Волчегорский И.А. и соавт., 1998; Волчегорский И.А., Харченкова Н.В., 2003). Оксидативный стресс при сахарном диабете во многом связан с неферментным гликозилированием липопротеидов (Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Шергин СМ., 1993). Неферментное гликозилирование апо-липопротеинов оказывает разнонаправленное влияние на обмен антиатерогенных липопротеидов (ЛПВП) и атерогенных липопротеидов фракции ЛПНП + ЛПОНП. Показано, что гликозилированные ЛПВП характеризуются большей активностью катаболизма, в то время как гликированные атерогенные липопротеины характеризуются замедленным катаболизмом (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995). В доступной литературе отсутствуют сведения о том, как эти различия отражаются на ПОЛ-зависимой модификации ЛПВП и атерогенных ЛП. Неизвестно также, каким образом отражается ПОЛ 75 зависимая модификация антиатерогенных и атерогенных ЛП на общем содержании продуктов ПОЛ в сыворотке крови. Кроме того, неясно, в какой степени ПОЛ -зависимая модификация различных липопротеидных фракций отражает развитие дислипидемических и сопутствующих ангиопатических расстройств при СД 1. В связи с изложенным, в данной работе была поставлена цель -изучение показателей системы «перекисное окисление липидов— антиоксидантная защита» в сопоставлении с выраженностью дислипидемических расстройств и клиническими проявлениями ангиопатических осложнений у больных сахарным диабетом 1 типа. Достижение поставленной цели требовало выбора оптимальной методологии определения продуктов ПОЛ в плазме крови и липопротеидных фракциях. В связи с этим наше внимание привлекла экстракционно-спектрофотометрическая методика (Волчегорс-кий И.А. и соавт; 1998, 2000), позволяющая осуществлять одновременную регистрацию продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта. Целесообразность применения данного подхода обусловлена тем, что гептановая фракция содержит этерифицированный холестерин и свободные жирные кислоты, в то время как изопропанольная фаза липидного экстракта содержит основную часть фосфолипидов (Косухин А.Б., Ахметова Б.С., 1987; Плацер 3. и соавт., 1970). Таким образом, применяя методический подход Волчегорского И.А. и соавт., можно проводить параллельную регистрацию продуктов переокисления полиеновых ацилов в составе этерифицированного холестерина, атерогенная роль которого общеизвестна, и продуктов переокисления глицерофосфолипидов. Важно добавить, что полиеновые жирнокислотные ацилы, подвергшиеся перекисной модификации в составе изопропанол-растворимых фосфолипидов, «вырезаются» фосфолипазой А2 и становятся гептан-растворимыми (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Волчегорский И.А. и соавт., 2002). Таким образом, осуществляя одновременную регистрацию продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта, можно оценивать не только общее интегральное содержание липопероксидов, но и «глубину» свободнорадикальной деструкции фосфолипидов. Важно подчеркнуть, что при выраженном оксидативном стрессе высокий темп деструкции фосфолипидов может привести к увеличению содержания продуктов ПОЛ в гептановой фазе липидного экстракта и параллельному падению уровня изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ (Волчегорский И.А. и соавт., 2003). Не менее важной отдельной задачей исследования явилась разработка оптимальной методологии лабораторного исследования липопротеидного распределения продуктов ПОЛ. Для решения этой задачи мы совместили три различных преципитационных технологии фракционирования липопротеидов, применяемые для оценки липопротеидного определения холестерина (Колб В.Г., Камышников B.C., 1976), с регистрацией продуктов ПОЛ в полученных фракциях. В результате было установлено, что характер системы осаждения практически не влияет на уровень липопероксидов в атерогенных (ЛПНП + ЛПОНП) и антиатерогенных (ЛПВП) липопротеидных фракциях (табл. 4). В первую очередь это касается классического гепарин-кальциевого осадителя Бурштейна-Самай и смеси фосфорновольфрамовой кислоты с хлоридом магния, между которыми не удалось выявить значимых различий ни по одному из, регистрируемых показателей липопероксидации. Использование гепарин-марганцевого осадителя, считающегося «золотым стандартом» для определения липопротеидного распределения холестерина (Титов В.Н., 1993, 1997), привело к статистически достоверному приросту продуктов ПОЛ как в суммарной фракции атерогенных ЛП, так и во фракции ЛПВП. Скорее всего, данный феномен является следствием ПОЛ- индуцированного действия ионов Mn2+ , который относится к d-элементам таблицы Менделеева, так же как железо и медь, прооксидантная активность которых общеизвестна. Таким образом, полученные результаты позволили нам остановить свой выбор на классической технологии Бурштейна-Самай, фракционирование с помощью которой дает такие же показатели липопротеидного распределения продуктов ПОЛ, как и современный фосфорновольфрамовый осадитель. В результате проведенного корреляционного анализа удалось установить, что уровень изопропанол-растворимых липопероксидов, выделенных из атерогенных фракций липопротеидов, является достоверным маркером триглицеридемии, но не отражает уровень холестеринемии. Вместе с тем было продемонстрировано, что уровень ЛПВП-ассоциированных гептан-растворимых вторичных продуктов ПОЛ прямо коррелирует с показателями коэффициента атерогенности, т.е может рассматриваться в качестве потенциального маркера атерогенной опасности.
Неферментное гликозилирование ЛПВП и выраженность дислипидемических расстройств у больных с сосудистыми осложнениями сахарного диабета 1 типа
В группе больных СД 1 без сосудистых осложнений наряду с повышением изопропанол-растворимых КД и СТ во фракции атерогенных ЛП наблюдалось параллельное снижение содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ. При присоединении микроангиопатий содержание гептан-растворимых КД и СТ нарастало и достигало максимума у больных с клиническими проявлениями атеросклероза (макроангиопатиями). Важно заметить, что эти изменения развились на фоне относительно низкого содержания диеновых конъюгатов. Вполне возможно, что преимущественное нарастание вторичных продуктов ПОЛ во фракции атерогенных ЛП обусловлено окислительной деструкцией первичных липопероксидов (диеновых конъюгатов) с их последующей конверсией во вторичные интермедиаты липопероксидации (КД и СТ). В целом изучение липопротеидного распределения продуктов ПОЛ продемонстрировало, что анализ уровня гептан-растворимых ЛПВП-ассоциированных продуктов ПОЛ и изопропанол-растворимых КД и СТ во фракции атерогенных ЛП является эффективным клинико-биохимическим подходом к верификации характера сосудистых осложнеий при СД 1.
Еще более информативным подходом к лабораторной верификации преимущественного характера диабетических ангиопатий оказалось лабораторное изучение показателей антиоксидантной защиты. Прежде всего это касается концентрации а-ТК в плазме крови. В результате проведенных исследований было установлено, что данный показатель достоверно снижается (хотя и не выходит за нижнюю границу нормы) уже в группе больных без сосудистых осложнений (табл.7). У больных с диабетическими микроангиопатиями было отмечено еще более выраженное снижение уровня а-ТК, средние показатели которого практически соответствовали нижней границе нормы. Наиболее выраженная гипотокоферолемия наблюдалась у больных с клиническими проявлениями атеросклероза (диабетическими макроангиопатиями). В данной группе концентрация а-ТК оказалась достоверно ниже не только соответствующей величины контроля, но и показателя токоферолемиии у больных без сосудистых осложнений. Важно подчеркнуть, что именно у больных с клиническими проявлениями макроангипатий средний показатель концентрации а-ТК в плазме крови оказался ниже общепринятой границы нормы (Надиров Н.К., 1991; Журавлев А.И., 1982)
Менее информативным оказался анализ зависимости концентрации церулоплазмина от характера ангиопатических осложнений у больных СД1. Больные СД1 без сосудистых осложнений и с микроангиопатиями характеризовались неизменной концентрацией церулоплазмина по сравнению со здоровыми лицами контрольной группы (табл.7). Однако на фоне диабетических макроангиопатий отмечалось достоверное снижение содержания церулоплазмина в плазме крови как по сравнению с показателем контроля, так и с больными СД 1 без сосудистых осложнений. Вместе с тем, среднее значение концентрации ЦП в данной группе не выходило за пределы нормального диапазона, что не позволяет говорить о развитии гипоцерулоплазминемии при диабетических макроангиопатиях.
В целом резульОтаты изучения показателей АОЗ продемонстрировали ее наиболее выраженный дефицит у больных СД1, осложненном макроангиопатиями. Именно в этой группе больных средний уровень токоферола позволяет констатировать гипотокоферолемию. По-видимому, снижение обеспеченности больных СД 1 а-ТК связано с состоянием хронической циркуляторной гипоксии. Аналогичная закономерность была установлена ранее у больных с кардиомиопатиями, осложненными хронической сердечной недостаточностью (Алексеев Е.Н., 2002; Волчегорский И.А. и соавт., 2003; Baudas G.et al., 2002). Следует заметить, что содержание токоферола в плазме крови оказалось наиболее информативным показателем АОЗ.
Установленные особенности липопротеидного распределения продуктов ПОЛ и состояния АОЗ соответствовали не только характеру диабетических ангиопатий, но и выраженности вторичных дислипидемических расстройств. Наиболее выраженный дефицит АОЗ и перекисная модификация липопротеидов сочетались с наибольшими величинами холестеринемии и коэффициента атерогенности при диабетических макроангиопатиях (табл.11). Интересно заметить, что в данной группе больных отмечалось достоверное снижение содержания неэтерифицированных жирных кислот по сравнению с группой СД 1 без сосудистых осложнений. По-видимому, данный факт свидетельствует об усиленном расходе СЖК на синтез холестерина и триглицеридов в печени больных СД 1 с макроангиопатиями. Правомерность данного предположения иллюстрируется результатами корреляционного анализа (глава 3.3).
В целом полученные результаты свидетельствуют о том, что лабораторное изучение системы «ПОЛ-АОЗ» является информативным дополнением к методам клинико-липидологического обследования больных СД 1 и может быть использовано для лабораторной верификации характера диабетических ангиопатий.
