Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 8
1.1. Основные этапы развития инсулин-зависимого сахарного диабета 8
1.2. Особенности эндокринного статуса в условиях ИЗСД 16
1.3. Метаболические расстройства и осложнения при ИЗСД 24
1.4. Оксидативный стресс при ИЗСД 27
1.5. Активация ГГАС и снижение стрессорной реактивности при ИЗСД 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Моделирование изучаемых состояний 33
2.2 Методы анализа изучаемых явлений 35
Глава 3. Влияние анксиогенного стресса на устойчивость к действию аллоксана и толерантность к глюкозе 39
3.1. Усугубление предварительными стрессорными воздействиями аллоксан-зависимых поведенческих расстройств 40
3.2. Дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными системами при анксиогенном стрессе и при действии продиабетогенного фактора... 50
Обсуждение 72
Заключение 84
Выводы 92
Список литературы 93
- Основные этапы развития инсулин-зависимого сахарного диабета
- Особенности эндокринного статуса в условиях ИЗСД
- Моделирование изучаемых состояний
- Усугубление предварительными стрессорными воздействиями аллоксан-зависимых поведенческих расстройств
Введение к работе
В настоящее время отмечен неуклонный рост заболеваемости сахарным диабетом. Ожидается, что к 2010 году количество больных на планете может составить около 215 миллионов человек. Сахарный диабет характеризуется высоким риском развития осложнений в виде ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, гипертонической болезни, атеросклероза, нефропатий, гангрены нижних конечностей и.т.д. Перечисленные осложнения в конечном итоге приводят к развитию инвалидности и преждевременной смерти. Поэтому возникла объективная необходимость в расширении исследований касающихся этиологических и патогенетических факторов обуславливающих развитие сахарного диабета.
Среди механизмов, способствующих развитию
инсулинозависимого сахарного диабета (ИЗСД), основное внимание исследователей сфокусировано на аутоиммунном поражении В-клеток островков Лангерганса. Среди этиологических факторов, обуславливающих развитие аутоиммунного инсулита, основное внимание уделяется вирусам и токсинам. К сожалению недостаточно внимания уделяется факторам, провоцирующим развитие эмоционального стресса. Между тем, доказана патогенетическая роль стресса в развитии аутоиммунных заболеваний. Глюкокортикоиды являются важнейшими регуляторами численности популяции тимоцитов и процесса позитивной и негативной селекции клонов Th-2 лимфоцитов. Следовательно, эмоциональные стрессы «повседневной жизни» могут существенно модулировать динамику ИЗСД. Кроме того, данные диабетогенные факторы могут вызывать нарушения регуляторных механизмов в пределах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГАС) по механизму отрицательной обратной связи и снижать стрессорную реактивность.
Продиабетогенный фактор аллоксан, достаточно часто применяемый для экспериментального моделирования ИЗСД, является индуктором оксидативного стресса. В настоящее время хорошо изучено влияние аллоксана на уровень перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантних ферментных систем во внутренних органах. Кроме того, доказана взаимосвязь между уровнем оксидативного стресса во внутренних органах и гипергликемизирующим действием диабетогенного фактора. Но отсутствуют данные о влиянии предварительных стрессорных воздействий анксиогенной направленности на чувствительность организма к продиабетогенному действию аллоксана. Между тем, данный тип стрессорных воздействий характеризуется десенситизациеи к глюкокортикоидам, сопровождающейся активацией МАО - Б и усилением ПОЛ во внутренних органах (Волчегорский И.А. и соавт.,2003). Можно предположить, что стрессогенные изменения чувствительности к глюкокортикоидам, сопряжённые с усилением процессов свободно-радикального окисления отразятся на чувствительности организма к действию продиабетогенного фактора аллоксана. Однако, невозможно a.priori предсказать произойдёт усугубление или ограничение аллоксан-зависимых изменений уровня гликемии и показателей ПОЛ во внутренних органах. Цель исследования
Изучить влияние иммобилизационного стресса, имеющего анксиогенный характер, на аллоксанзависимые изменения уровня гликемии и соотношение между прооксидантными и антиоксидантными системами внутренних органов.
Задачи исследования
Изучить влияние предшествующего анксиогенного стресса на гипергликемизирующий эффект аллоксана.
Изучить влияние анксиогенного стресса на уровень циркулирующего кортикостерона, чувствительность к глюкокортикоидам и соотношение между уровнем активности МАО-Б и содержанием молекулярных продуктов ПОЛ во внутренних органах.
Изучить активность глю ко корти ко ид - метаболизирующей изоформы цитохрома Р450 CYP3A при введении аллоксана и ее ассоциированность с выраженностью воспалительных изменений в печени.
Изучить влияние продиабетогенного фактора аллоксана на выраженность поведенческих расстройств, активность церебральной МАО-Б и содержание молекулярных продуктов ПОЛ в головном мозге.
Изучить влияние предшествующего анксиогенного стресса на панкреотропные эффекты аллоксана.
Изучить влияние предшествующего анксиогенного стресса на гепатотропные эффекты аллоксана.
Научная новизна
Установлено, что действие продиабетогенного фактора аллоксана сопровождается снижением поведенческой активности крыс в "открытом поле" на фоне увеличения церебральной активности МАО-Б. Предшествующий анксиогенный стресс усугубляет аллоксан -индуцированный прирост церебральной активности МАО-Б и сопутствующие нарушения поведения крыс, а также потенцирует гипергликемизирующий эффект аллоксана. Установлено, что развитие аллоксан - индуцированной гипергликемии сопровождается индукцией изоформы цитохрома Р450 CYP3A, осуществляющей терминальную
6
биотрансформацию глюкокортикоидов, и лейкоцитарной
инфильтрацией печени. Обнаружены гомологичные изменения церебральной активности МАО-Б и содержания молекулярных продуктов ПОЛ в головном мозге стрессированных и нестрессированных животных после введения аллоксана. Обнаружено, что предварительный анксиогенный стресс ограничивает панкреотоксическое действие аллоксана и усугубляет гепатотоксическое. Теоретическое значение
Обнаружен панкреонезависимый механизм усугубления предварительным анксиогенным стрессом гипергликемизирующего действия аллоксана. Практическое значение
Результаты исследования свидетельствуют о целесообразности включения анксиолитической терапии в схему лечения ИЗСД Положения, выносимые на защиту
Анксиогенный стресс, характеризующийся сниженной чувствительностью к глюкокортикоидам, усугубляет гипергликемизирующее действие аллоксана и аллоксан -зависимые поведенческие расстройства.
Угнетение поведенческой активности при введении аллоксана стрессированным животным ассоциируется с ограничением ПОЛ в головном мозге и печени.
Поведенческая депрессия при повторных стрессорных воздействиях и при введении продиабетогенного фактора аллоксана сопровождается активацией церебральной МАО-Б и повышением содержания молекулярных продуктов ПОЛ в головном мозге.
7 Апробация работы
Основные положения работы изложены и представлены на 12th
International Congress of Immunology (Montreal, Canada, 2004),
межрегиональной научно - практической конференции «Новая
идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины»
(Самара, 2005), научно - практической конференции с
международным участием. «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), 5th international congress of pathophysiology, (Beijing, China, 2006.), 16th European Congress of immunology(Paris, 2006) Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 -
в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ
(Проблемы эндокринологии, №6, 2002; Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины №1, 2005;
Экспериментальная и клиническая фармакология №1, 2005; Вестник Российской академии медицинских наук, №8, 2005). Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 223 источника: 120 - на русском языке и 103 - иностранных. Работа содержит 10 таблиц, 10 рисунков.
Основные этапы развития инсулин-зависимого сахарного диабета
Ключевым звеном патогенеза ИЗСД является гибель В-клеток панкреатических островков, которая спровоцирована вирусными и/или химическими диабетогенами и реализуется по механизму аутоиммунной альтерации (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 1999). Трактовка данного недуга как аутоиммунного заболевания позволила выделить 6 стадий развития ИЗСД.
1.Стадия генетической предрасположенности. Характеризуется наличием генетических маркёров повышенного риска ИЗСД и отсутствием как нарушений углеводного обмена, так и аутоиммунных расстройств. Генетический анализ показал, что первично с предрасположенностью к ИЗСД связаны аллели главного комплекса гистосовмести класса II. Наибольший риск развития ИЗСД имеется у гетерозигот HLA DR3/DR4 по сравнению с гомозиготами. Напротив экспрессия антигена DR2 у больных сахарным диабетом 1 типа практически не встречается. Этот антиген, а также его субвариант DPw15 является основным HLA маркёром резистентности к болезни. В физиологических условиях экспрессия молекул II класса HLA D/DR происходит только на эндотелиальных клетках, некоторых эпителиальных клеток, Т-лимфоцитах. В дальнейшем этот процесс приводит к развитию аутоиммунного процесса с последующей деструкцией В - клеток.
2. Провоцирующее событие. В этом качестве могут выступать как сравнительно кратковременная инфекция, так и воздействие какого -либо химического диабетогенного фактора. Учитывая, что манифестации ИЗСД нередко предшествует вирусная инфекция, лицам с повышенным риском развития заболевания предлагается проведение практической иммунизации против вирусов, считающихся диабетогенными. К ним относятся вирусы кокосаки, гриппа, краснухи, эпидемического паротита. Среди химических диабетогенов можно выделить нитрозамины, которые способны провоцировать деструкцию В-клеток. Так, сезонное употребление копчённых- продуктов, содержащих нитрозамины сопровождалось подъемом заболеваемости у детей в Исландии. Также существует связь между абсолютной инсулиновой. недостаточностью и употреблением продуктов, содержащих пищевые цианиды (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 2001). К развитию ИЗСД может привести воздействие высоких доз токсинов, таких как пентамидин, стрептозотоцин и родентицид Вакор (Дедов И.И. и соавт., 1998).
Основным метаболитом аллоксана, с которым по большейчасти и связан его токсический эффект, являются активные формы кислорода. В островках, где в В - клетках накапливается большое количество аллоксана, возникает высокая концентрация пероксида, супероксид-анион радикала, гидоксилых радикалов, что ведет к активации процессов свободно-радикального окисления. Активные формы кислорода генерируются в циклической реакции в присутствии глутатиона. Источник АФК - аутоокисление метаболита аллоксана, диалуровой кислоты (Lenzen S., 2008). С одной стороны, это приводит к нарушению целостности клеточных мембран и снижению эффективности окислительного фосфориллирования в митохондриях, а с другой — к точечным мутациям ДНК в виде ковалентной модификации пуриновых оснований и возникновению N-7-метилгуанина, О-6-метилгуанина и 3-метиладенина(СаесІіпаІ J.W., Allan D.J., 1999). Следствием повреждения ДНК становится активация систем репарации. Одним из ключевых ферментов, обеспечивающим репарацию при точечных мутациях, является поли (АДФ-рибозо) полимераза (ПАРП), которая формирует разрывы нити ДНК и замещает дефектное основание хвостом из поли-АДФ-рибозы. Этот процесс энергозависим и происходит с расходом НАД, что при огромном количестве мутаций, вызванном АФК, ведет к истощению клеточного пула НАД и некрозу клетки. При этом трансгенные линии мышей с дефицитом ПАРП устойчивы к действию диабетогенных факторов. Исследования последних лет показали, что ПАРП является ключевым фактором, участвующем в гибели В-клеток и активируется вне зависимости от того, вызвано ли повреждение ДНК действием химических факторов (стрептозотоцин, аллоксан), - факторами воспаления (оксид азота, цитокины, активные формы кислорода) или В-цитотропными вирусами.
Процессы апоптоза при аллоксан-индуцируемой гибели В-клеток оказываются также блокироваными из-за полного истощения внутриклеточных запасов АТФ и НАД.
Генерация АФК ответственна как за инициацию, так и за развитие сахарного диабета, обусловленного как действием вирусов и токсических веществ, так и аутоиммунным ответом. В многочисленных работах показано, что цитокины, такие как IL-1 в иммунокомпетентных и эндокринных клетках панкреатических островков вызывают экспрессию индуцируемой формы синтазы оксида азота (иНОС), которая продуцирует значительные количества этого медиатора и тем самым обуславливает гибель В-клеток.
Таким образом, аллоксан активирует те же патогенетические механизмы (угнетение глюкозного окисления, мутации ДНК, истощение запасов НАД), что и другие В-цитотоксические яды и вирусы, а ключевыми агентами, реализующими эти процессы, вне зависимости от повреждающего фактора, являются АФК и ПАРП. Исходя из вышеизложенного, следует заключить, что аллоксановая модель диабета этиологически и патогенетически в значительной степени близка диабету 1 типа у человека(Орловский М.А., 2006).
При введении аллоксана возникает определённая последовательность реакций: а) острая гипергликемия, которую считают следствием гиперадреналинемии б) гипогликемия, отражающая быстрый выброс запасов инсулина в кровь в) хроническая гипергликемия развивающаяся в результате необратимого повреждения В - клеток. В течение длительного времени господствовало представление об избирательном действии аллоксана на В-клетки. В дальнейшем было показано, что при введении аллоксана крысам быстро развивается поражение других органов, например печени и почек. Однако действие аллоксана в них транзиторно, тогда как химическое воздействие на В - клетки необратимо (Тепперман Дж., Тепперман X., 1989; Волчегорский И.А. и соавт., 1995).
3. Стадия явных иммунных аномалий. Длится от 2-3 месяцев до 2-3 лет и заключается в развитии смешанной аутоиммунной реакции против В - клеток, опосредованной как аутореактивными CD8+ лимфоцитами так и циркулирующими аутоантителами. До сих пор не идентифицирована природа антигена, имеющего высокую степень гомологии с неким компонентом
Особенности эндокринного статуса в условиях ИЗСД
Начиная с 4 стадии развития, общая направленность изменений эндокринного статуса отчётливо смещается в сторону контринсулярных гормонов. Известно, что при ИЗСД наблюдается увеличение концентрации глюкагона, сомато стати на, кортиколиберина, вазопрессина, окситоцина, АКТГ и глюкокортикоидов (Колесник Ю.М.и др., 2005). Поэтому эндокринные и метаболические сдвиги в условиях ИЗСД гомологичны сдвигам, наблюдаемым при голодании, а также в ходе первой, гиперкатаболической фазы стресса, но имеющие при этом иную амплитуду. Все перечисленные гормоны так или иначе противодействуют инсулину. В частности катехоламны стимулируют глюконеогенез, гликогенолиз, липолиз, подавляя через (3 адренорецепторы утилизацию глюкозы тканями. Среди контринсулярных гормонов особую позицию занимают глюкокортикоиды. Известно множество ситуаций, когда глюкокортикоиды выступают в роли антагонистов инсулина. Разнонаправленное влияние этих гормонов не ограничивается содержанием глюкозы крови, но и распространяется на глюконеогенез, транспорт глюкозы, синтез белков, аппетит, липолиз и.т.д. (Sapolski R. et al., 2000). Кроме того, глюкокортикоиды эффективно блокируют развитие инсулин - зависимой гипогликемии. Кортикостероиды могут вызывать инсулинорезистентность, за счёт уменьшения количества Glut 4 в инсулино - зависимых тканях. Кроме того, инсулино - резистентность может быть вызвана и опосредовано, за счёт увеличения уровня циркулирующего глюкагона или СЖК (Flier J.S. et al.,1989). На модели стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета продемонстрирована фатальная роль глюкокортикоидов связанная с чрезмерным потенцированием глюконеогенеза, липолиза, протеолиза. Недавно было установлено, что дексаметазон способен вызывать апоптоз В клеток островков Лангерганса. При этом, у трансгенных мышей по пролактину наблюдалась повышенная устойчивость В - клеток к проапоптогенному эффекту дексаметазона. Установлено, что протективный эффект пролактина реализуется через активацию JAK2/STAT5 сигнального пути (FujinakaYu et al., 2007). Но вместе с тем, следует отметить, что при определённых условиях глюкокортикоиды могут оказывать и позитивное влияние на течение ИЗСД. После того, как была обнаружена аутоиммунная природа ИЗСД и обоснована роль инсулита в развитии недостаточности островковых В-клеток, стала очевидным позитивная роль этих гормонов на ранних фазах развития ИЗСД. Прежде всего, активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы можно, рассматривать как один из механизмов сдерживания аутоиммунной эндокринопатии. Это может быть частным случаем антивоспалительных эффектов глюкокортикоидов. В свою очередь, противовоспалительное действие кортикостероидов реализуется по нескольким механизмам. Во - первых, глюкокортикоиды являются ингибиторами продукции и секреции цитокинов (Falashi Р et al.,1995). Кроме того, глюкокортикоиды ограничивают продукцию комплемента и гистамина. За счёт ингибирования активности фосфолипазы А2 происходит глюкокортикоид-зависимое снижение содержания простагландинов и лейкотриенов (Kapcala L.P et.al.,1995). В связи с этим заслуживают внимания данные об улучшении функции поджелудочной железы при назначении короткого курса преднизолона в дозе 1мг/кг в сутки в течении 10 дней или 0,3 мг/кг в сутки в течении 50 дней (Кураєва Т.П., 1991). Существенным элементом в инсулит-ограничивающем действии глюкокортикоидов являются их проапоптогенное действие на ряд иммунокомпетентных клеток и подавление цитокиновой секреции. Иммуносупрессивное действие кортикостероидов может реализоваться благодаря гл ю ко корти кои д-зависимой супрессии транскрипционного фактора NF-kB. Известно, что NF-KB является фактором, одновременно усиливающим пролиферацию в грануло-моноцитарном и лимфоидном ряду гемопоэза, в ответ на цитокиновую стимуляцию. NF-KB влияет на различные гены, задействованные в иммунном, острофазовом и воспалительном ответах. Сюда относятся гены IL-1(3, TNFa, IL-2, IL-6, IL-12, IL-8 и других хемокинов, индуцибельных ферментов (iNOS, Сох-2), молекул адгезивных контактов (ICAM-1, VCAM-1, Е-селектин), главного комплекса гистосовместимости (MHC-I, MHC-II), белков комплемента (В, СЗ, С4), факторов, контролирующих клеточный цикл (р53, циклин D1 и др.), ингибиторов и активаторов апоптоза (C-IAP1, с-IAP2, FasL, Bcl-2, TRAF-1, TRAF-2 и др.) Глюкокортикоиды ограничивают эффекты NF-kB за счёт индукции гена IkB, обладающего способностью связываться с NF-kB с образованием неактивного гетеродимерного комплекса (Sheinman R.I ., et all 1995., Auphan N et ail 1995). Через обозначенный механизм кортикостероиды могут реализовать иммуносупрессивное действие по отношению к лимфоидным и моноцитарным клеткам.
Существует гипотеза о глюкокортикоид-зависимом ограничении чрезмерных катаболических эффектов, вызванных активацией иммунной системы. Известно, что провоспалительные цитокины могут активировать протеолитические и липолитические процессы и угнетать глюконеогенез. В случае IL-6 это проявляется в угнетении активности ключевого фермента глюконеогенеза фосфоенолпируваткарбоксикиназы. Поэтому в условиях ИЗСД на фоне ограничения транспорта глюкозы в инсулино-зависимые ткани ограничение глюконеогенеза может усугубить негативные последствия дефицита инсулина. Как уже ранее упоминалось, цитокины усиливают процессы свободно - радикального окисления и при ИЗСД они могут дополнительно потенцировать оксидативный стресс не только в островках Лангерганса. Способность цитокинов оказывать гипогликемическое действие не способствует компенсации ИЗСД, поскольку транспорт глюкозы идёт в инсулино-независимые ткани с последующим усилением образования гликозилированных белков. Эффективно компенсируя гиперцитокинемию на начальных этапах развития ИЗСД, адаптивный характер действия глюкокортикоидных гормонов утрачивается по мере развития инсулинового дефицита. Следует отметить, что циркулирующие цитокины могут сами по себе усиливать секрецию ГГАС.
Так, секретируемые лейкоцитарными клетками IL-1, IL-6, IL-2, ФНО проникают из циркулирующей крови в ЦНС вследствие увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера. Кроме того, поступление цитокинов из циркуляции в головной мозг может проходить через фенестрированный эндотелий organicum vasculosus и lamina terminalis (Katsnura J., e. a., 1989; Strober W. e. a., 1988; Sternberg E. e. a., 1995; Kapkala L e. a., 1995; De Souza E., 1993; Lightman A. e. a., 1993). В иммунных механизмах активации гипоталамо-гипофизарно - надпочечниковой системы заметную роль играет 1L-1. Причём IL1J3 как цитокин, находящийся в циркуляции, привносит в стимуляцию ГГАС гораздо более заметный вклад, чем IL-1а, который является мембрано-ассоциированным цитокином (Kapcala L. е. а., 1995).
Моделирование изучаемых состояний
Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках при комнатной температуре при питании натуральным кормом в количестве, соответствующем суточным нормам. За 24 часа до опыта животным прекращали подачу пищи при неограниченном доступе к воде.
Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами, и рекомндациями по гуманизации работы с лабораторными животными (Кополадзе Р.А.1998), отражёнными в "Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" (Страсбург, 1985). Эвтаназию грызунов осуществляли цервикальной дислокацией. Моделирование иммобилизационного стресса Хронический стресс воспроизводился 1-часовыми иммобилизациями, которые осуществлялись путём фиксации животного за конечности на спине с применением для этих целей прямоугольных планшет из фанеры (Волчегорский И.А. и соавт 2000). Был использован режим четырёхкратной иммобилизации. Для этого режима повторных стрессорных воздействий характерно доминирование резистентной стратегии адаптации и наличие поведенческих расстройств, тревожно-депрессивного характера (Волчегорский И.А. 2002). Его воспроизводили одночасовыми иммобилизациями, с интервалом 72 часа между отдельными стрессорными эпизодами. Всего животные четырежды подвергались 1 часовому имобилизационному стрессу. Данную модель анксиогенного стресса можно рассматривать как модификацию классической модели повторных стрессорных воздействий по R.Kvetnansky (Kvetnansky R., 1970), связанную с сокращением в 2 раза количества эпизодов 1 часового иммобилизационного стресса и увеличения промежутков между отдельными иммобилизациями. Увеличение временного интервала между отдельными стрессорными эпизодами затрудняет развитие габитуации и каждое новое воздействие на животное содержит определённый элемент внезапности. Поэтому данный режим иммобилизационного стресса гомологичен «стрессу повседневной жизни».
Через 24 часа после завершения повторных иммобилизаций стрессированные животные были подвергнуты дополнительным воздействиям (введение продиабетогенного фактора аллоксана). Временной интервал между последним стрессорным эпизодом и последующим введением продиабетогенного препарата мотивируется следующими соображениями. Дополнительное воздействие экстремальным фактором через 24 часа после завершения периодических воздействий является «золотым стандартом» при экспериментальном моделировании адаптационных реакций организма (Меерсон Ф.З. 1993., Волчегорский И.А. и соавт. 2000). Исторически подобная ситуация сформировалась из-за того, что ранние работы по изучению механизмов «адаптации к стрессу», были выполнены на модели ежедневных иммобилизаций (стресс по R. Kvetnansky). Предложенная Ф.З.Меерсоном (Меерсон Ф.З. и соавт.) модификация этой модели заключалась в однократном действии более мощного стрессогенного фактора в последние сутки хронического эксперимента. Например, через сутки после завершения ежедневных 1 часовых иммобилизаций в течение двух недель животные подвергались Эти часовому иммобилизационному стрессу. Таким образом, выбранный нами временной интервал между завершением стрессорных эпизодов и дополнительным воздействием позволяет корректно сопоставлять полученные результаты с данными других лабораторий. Моделирование инсулино-зависимого сахарного диабета.
Сахарный диабет первого типа вызывали путём внутрибрюшинного введения 4% раствора аллоксана тригидрата (La Chema, Чехия) в дозе 200мг/кг животным, лишённым пищи за сутки до постановки эксперимента. Контрольным животным вводили эквиобъёмное количество хлорида натрия. Умерщвление животных проводили через 72 часа после инъекции аллоксана, когда уровень гликемии в 5-6 раз превышал контрольные значения. 2.2 Методы анализа изучаемых явлений Биохимические методы Энзимологические методы
В сыворотке крови определяли активность следующих ферментов: аспартаттрансаминазы (ACT, К.Ф. 2.6.1.1.), аланинтрансаминазы (АЛТ, К.Ф. 2.6.1.2.), Активность ферментов определяли на биохимическом анализаторе фирмы "KONE" (Финляндия). В тканях головного мозга и печени определяли активность моноаминоксидазы (МАО, аминкислородоксидоредуктазы (дезаминирующей, флавинсодержащей), К.Ф. 1.4.3.4.). Применяли модифицированный Волчегорским И.А. и др. (1991) метод. Источником фермента являлся цельный гомогенат, приготовленный на 0.25 М сахарозе в 0.0627 М Na-фосфатном буфере.
Усугубление предварительными стрессорными воздействиями аллоксан-зависимых поведенческих расстройств
Изученный режим иммобилизационного стресса вызывал уменьшение локомоции, груминга и исследовательского поведения крыс в «открытом поле» (рисунок 3.1). Так, на 42 % снизилась горизонтальная двигательная активность при одновременном снижении на 70% числа актов самоочистки животных.
Для обсуждения вероятных причин усугубления предварительными стрессорными воздействиями аллоксан зависимых поведенческих расстройств необходимо проанализировать отличие аллоксановои депрессии от анксиогенных расстройств поведения у крыс во второй серии тестирования. Как видно из представленных рисунков, повторное тестирование контрольных крыс в «открытом поле» сопровождалось уменьшением их исследовательской, ориентировочной и двигательной активности. Такой феномен обычно трактуется как проявление габитуации, т.е. адаптации к условиям актографа. Однако это предположение неприменимо к схеме эксперимента, использованной в нашем исследовании. Это связано с амнезирующим действием эфирного наркоза, на фоне которого проводились внутрибрюшинные инъекции сразу после I серии тестирования в «открытом поле». Кроме того, повторное исследование крыс в актографе было отделено от I тестирования большим промежутком времени. Вероятно, поведенческую депрессию во II серии тестирования можно рассматривать как следствие анксиогенного стресса, вызванного у контрольных крыс ингаляцией эфира и инъекцией 0,9% раствора NaCI. В пользу этого свидетельствует прирост анксиогенной дефекации во второй серии тестирования по сравнению с первой. Предварительные стрессорные воздействия увеличили ориентировочную реакцию по сравнению со II серией контроля, что соответствует данным о сверхбдительности при тревожно-депрессивных расстройствах. Таким образом, повторные иммобилизации вызывают расстройства поведения качественно противоположные аллоксан зависимым поведенческим расстройствам. Симптоматика поведенческих расстройств при введении аллоксана стрессированным животным отражает тяжесть локального воспалительного процесса, и в данном случае, по-видимому, связана с развитием аллоксан - зависимого инсулита или гепатита. Наблюдаемые при воспалительной патологии поведенческие расстройства соответствуют симптоматике «sickness behavior» или «поведению болезни». Известно, что их развитие цитокин - зависимо. Изучение содержания циркулирующих цитокинов выявило отсутствие значимого влияния анксиогенного стресса на концентрации IL-1, IL 2,11_-12и TNF. Концентрация IL-4, синтез, которого стимулируется глюкокортикоидами, снижается под влиянием редко чередующихся иммобилизаций, а содержание IL-6, напротив, возрастает. Известно, что IL - 4 ограничивает тканевые эффекты ГКГ [Bamberger, СМ., 1995], а "эндокринный цитокин" IL - 6 активирует гипоталамо-гипофизарно надпочечниковую систему [Гриневич В. В., 1999.].
Вполне возможно, что развитие этого феномена обусловлено IL-6 опосредованной активацией ГГАС. Важно отметить, что редко чередующиеся иммобилизации сами по себе сопровождались развитием гипергликемии через 24 часа после завершения последнего стрессорного эпизода (контроль 3,59±0,31 ммоль/л (п=23) стресс 4,11+0,28 (п=24) Р 0,05 (ТКФ)). Последнее может характеризовать превалирование контринсулярных гормонов.
Связь между стрессогенными изменениями поведения и углеводным обменом особенно ярко проявилась на фоне введения аллоксана. Введение В - цитотоксического агента предварительно стрессированным крысам усугубляло поведенческую депрессию. Кроме того, предварительный стресс потенцировал гипергликемизирующее действие аллоксана. Так, через 72 часа после инъекции аллоксана, у животных наблюдалось развитие выраженной гипергликемии, что проявилось более чем пятикратным увеличением концентрации глюкозы. Предварительные стрессорные воздействия вызвали ещё более выраженный прирост гликемии. У животных группы «стресс + аллоксан» концентрация глюкозы была на 17% выше, чем у животных группы «аллоксан» (рисунок 3.5).
Контроль Стресс Аллоксан Стрес с Аллоксан Парадоксально, что анксиогенный стресс сам по себе вызывал увеличение толерантности крыс к глюкозе, что отражает нарушение баланса между эффектами контринсулярных гормонов и инсулином в пользу последнего.
Последнее обстоятельство хорошо согласуется с данными нашей лаборатории о сниженной чувствительности к глюкокортикоидам при анксиогенном стрессе. В частности, было показано, что через 96 часов после завершения иммобилизаций анксиогенные расстройства поведения сопровождались приростом церебральной активности моноаминоксидазы. Наши исследования показали, что этот феномен получил развитие и в более ранние сроки после завершения повторных иммобилизаций. Введение аллоксана и анксиогенный стресс увеличивали активность фермента в нервной ткани, а предварительная четырехкратная иммобилизация потенцировала аллоксаниндуцированный прирост активности МАО в мозге. При этом активность МАО в мозге крыс, получавших аллокеан после стресса, отрицательно коррелировала с двигательной активностью во II серии тестирования (rs = - 0,67, Р 0,05). Данная зависимость свидетельствует в пользу предположения И.А. Волчегорского и соавторов (2003) об увеличении активности церебральной МАО как о нейрохимической основе поведенческой депрессии при изученных состояниях. Причём, использованный нами метод позволяет определить активность одной из изоформ фермента, МАО-Б. ГКГ стимулируют экспрессию МАО-Б в нервной ткани [Carlo Р., 1996] и одновременно проявляют ингибиторный эффект в отношении предшествующих молекул фермента [Parvez Н., 1973]. Возможно, выявленное нарастание активности МАО-Б в мозге связано с первоначальным стероидзависимым усилением синтеза фермента и последующим ослаблением МАО - ингибиторного действия кортикостероидов из-за тахифилаксии к ГКГ. Не исключено, что увеличение церебральной активности МАО при аллоксановом диабете так же, как при анксиогенном стрессе, отражает снижение ГКГ - чувствительности.
