Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Активные формы киислорода: места генерации, химизм и их роль в организме
1.2. Антиоксидантная защита организма 19
1.3. Зимняя спячка млекопитающих и окислительный стресс 26
Глава II. Экспериментальная часть
2.1. Обоснование выбора объекта исследования 36
2.2. Постановка экспериментов 37
2.3. Препаративные методы исследования 37
2.3.1. Приготовление гомогенатов мозга и печени 37
2.3.2. Получение плазмы, эритроцитов и гемолизата 37
2.4. Биохимические методы исследования 38
2.4.1. Определение содержания малонового диальдегида в плазме и крови 38
2.4.2. Определение МДА в эритроцитах 38
2.4.3. Определение интенсивности перекисного окисления липидов в печени и в коре головного мозга. 39
2.4.4. Анализ содержания первичных продуктов ПОЛ в крови, в печени и коре головного мозга 40
2.4.5. Определение антиокислительной активности гидрофильных компонентов мозга, печени и плазмы крови 41
2.4.6. Определение активности супероксиддисмутазы в мозге, печени и крови 41
2.4.7. Определение активности каталазы в мозге, печени и крови 42
2.4.8. Определение содержания гемоглобина 43
2.5. Статистический анализ данных 43
Глава III. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Интенсивность процессов ПОЛ в мозге сусликов в динамике зимней спячки и искусственной гипотермии 44
3.2. Интенсивность процессов ПОЛ в печени сусликов в динамике зимней спячки и искусственной гипотермии 62
3.3. Интенсивность процессов ПОЛ в крови сусликов в динамике зимней спячки и искусственной гипотермии 79
Заключение 93
Выводы 100
Литература 102
- Активные формы киислорода: места генерации, химизм и их роль в организме
- Антиоксидантная защита организма
- Обоснование выбора объекта исследования
- Интенсивность процессов ПОЛ в мозге сусликов в динамике зимней спячки и искусственной гипотермии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Зимняя спячка млекопитающих является природной адаптацией к низким температурам окружающей среды. Гибернация сопровождается значительным снижением температуры тела, сердечных ритмов, потребления кислорода, уровня метаболизма, и других физиологических и биохимических параметров (Wang, Lee, 1996; Geiser, 2004). При этом биохимические процессы в организме зимоспящих животных перестраиваются так, что даже при очень низкой температуре тела поддерживается определенный гомеостаз (Carey et al., 2003)
Зимняя спячка мелких грызунов является прерывистым процессом. Каждые 10-15 дней животные пробуждаются и через короткое время (2-24 ч.) снова входят в спячку (Wang, Lee, 1996). Считают, что вход в спячку и выход из нее являются потенциально опасными периодами (Toien et al., 2001). Именно в эти периоды у животных происходит резкая смена одного метаболического состояния на другое. Изменение физиологического состояния животного в эти периоды сопровождается ишемией, реперфузией, повышением потребления кислорода, интенсификацией работы многих ферментных комплексов (Hermes-Lima, Zenteno-Savin, 2002; Storey, Storey, 2004). В результате этого в тканях зимоспящих животных интенсифицируются процессы образования активных форм кислорода (АФК) (Toien et а)., 2001).
Несмотря на потенциальную возможность активации процессов образования активных форм кислорода, в тканях зимоспящих животных не возникают патологические изменения (Frerichs et al., 1994; Frerichs, Hallenbeck, 1998). Отсюда можно предположить, что ткани гибернирующих животных обладают устойчивостью к свободнорадикальным процессам. Однако, в настоящее время не вполне понятно, каким образом регулируются свободнорадикальные процессы в тканях гетеротермных животных в период зимней спячки.
Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось установление закономерностей изменения интенсивности процессов иерекисного окисления липидов (ПОЛ) и активности компонентов антиоксидантной защиты тканей
6 сусликов при гибернации и искусственной гипотермии.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать содержание изолированных двойных связей, первичных
и промежуточных продуктов ПОЛ в липидах мозга, печени и эритроцитах крови сусликов.
Выявить изменения в интенсивности ферментативного и неферментативного ПОЛ in vitro в исследуемых) тканях.
Определить активность ключевых антиоксидаитных ферментов — су-пероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, а также общую антиокислительную активность (АОА) гидрофильных компонентов в мозге, печени и крови.
Основные положения, выносимые на защиту.
Интенсивность процессов ПОЛ в тканях сусликов зависит от глубины зимней спячки.
Скорость пероксидации липидов при индукции ПОЛ, НАДФН- и Fe +аскорбат- системами в условиях in vitro, мембранных структур мозга и печени снижается при глубокой зимней спячке.
Основную антиоксидантную защиту изучаемых тканей при зимней спячке осуществляют гидрофильные антиоксид анты. В мозге и крови сусликов при этом дополнительную антиоксидантную защиту выполняет каталаза.
При искусственной гипотермии бодрствующих летом сусликов, как и при зимней спячке, исследованные ткани также устойчивы к процессам липо-пероксидации.
Научная новизна.
Впервые установлено, что на протяжении всей зимней спячки в головном мозге и печени сусликов в отличие от крови содержание изолированных двойных связей и первичных продуктов ПОЛ повышено, а уровень МДА возрастает только к концу гибернации. При зимней спячке для крови характерен низкий уровень молекулярных продуктов ПОЛ.
Впервые выявлено существенное снижение индукции ПОЛ in vitro в тка-
нях мозга, печени и эритроцитах сусликов при зимней спячке.
Впервые обнаружено снижение активности СОД и повышение активности каталазы в головном мозге и эритроцитах крови сусликов в динамике зимней спячки и на этапах одного баута. В печени активность исследованных ан-тиоксидантных ферментов значительно снижается.
Впервые показано, что важнейшую роль регуляции процессов ПОЛ в тканях при зимней спячке выполняют гидрофильные антиоксидант.
При искусственной гипотермии бодрствующих летом сусликов впервые обнаружена тканевая специфичность в изменении интенсивности ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов. Общей реакцией тканей на гипотермию является существенное повышение активности гидрофильных антиоксидантов.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярных механизмов устойчивости ге-теротермных животных к низким температурам как в условиях естественного гипобиоза, так и при искусственной гипотермии. Практическая значимость данной работы определяется перспективностью использования ряда изученных показателей тканей для оценки и коррекции искусственных гипометаболиче-ских состояний в медицине. Результаты работы указывают на возможность повышения устойчивости мембранных структур гомойотермных животных к низким температурам тела путем повышения емкости антиоксидантной системы.
Материалы данной диссертации используются в учебном процессе на кафедрах биохимии и биофизики Дагестанского госуниверситета и Махачкалинского филиала Ростовского госуниверситета при чтении ряда спецкурсов и проведении больших практикумов.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на Всероссийской научно-практической конференции «Химия в технологии и медицине» (Махачкала, 2001), на Международном научном семинаре вузов Северо-Кавказского региона «Циклы» (Ставрополь, 2002), на 6-й и 7-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - Наука XXI века»
(Пущино, 2002, 2003), на 3-ем биохимическом съезде (С-Петербург, 2002), на XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», на симпозиуме «Young Physiologist Symposium & Free Radical School» (Leicester, UK 2005).
Активные формы киислорода: места генерации, химизм и их роль в организме
Аэробной жизни присуща очень высокая (в сравнении с анаэробной) эффективность утилизации энергетических субстратов. Причиной тому является использование молекулярного кислорода, весьма активного акцептора электронов. Общепринято, что дыхание клеток служит основным механизмом энергообеспечения человека, животных, аэробных бактерий, а также растений в темный период суток. Однако, как и большинство других биохимических процессов, дыхание полифункционально выполняет также и некоторые другие биологические функции. Именно превосходное качество кислорода, как аісцептора электронов, делает его присутствие небезопасным для живых систем (Fridovich, 1998).
В норме основное количество кислорода (95-98%) расходуется на выработку энергии и окислительный катаболизм субстратов, подвергаясь полному четырехэлектронному восстановлению. Кроме полного четырехэлектронного восстановления кислорода до воды в аэробных клетках до 5% кислорода подвергается 1,2 и 3-х электронному восстановлению с последовательным образованием различных активных форм кислорода (АФК): супероксидный радикал 02 , перекись водорода Н202, гидроксильный радикал НО ( Fridovich, 1999; Cadenas, Davies, 2000). О, 02" +- Н202 НО —V 2Н20А +2W +2И + 4е + 4Ї-Ґ Термин АФК шире, чем «свободные радикалы кислорода», так как кроме последних включает также сииглетный кислород 02, озон 03, гипохлорит НОСІ и пероксинитрит ONOOH (Kowaltowski et al, 2001). АФК генерируются во всех частях клетки: митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, ядрах, перок-сисомах. При этом наибольший вклад вносит дыхательная (электронтранспорт 10 ная) цепь митохондрий (ЭТЦ) особенно при низких концентрациях АДФ (Chance et al., 1979; Turrens, 2003).
Митохондрия — главная дышащая органелла клетки — содержит большое количество активных ферментов и коферментов - переносчиков электронов в дыхательной цепи (Nulton-Persson, Szweda, 2001). Окислительно-восстановительный потенциал тех из них, что образуют начальные и средние участки цепи, часто оказывается отрицательнее, чем - 0,3 В (потенциал пары 02/ 02 ). Это значит, что случайное взаимодействие данных переносчиков электронов с 02 может привести к одноэлектронному восстановлению 02 до 02 (Babior, 1997). ЭТЦ локализована во внутренней митохондриальной мембране, состоит из четырех комплексов. В состав этих комплексов входит НАДН-дегидроге-наза (комплекс I), сукцинатдегидрогеназа (комплекс II), убихинон-цитохром Ь-Ci (комплекс Ш). В генерации 02 в ЭТЦ участвуют комплекс I и III, также в некоторых работах указывается на участие в образовании АФК комплекса II (Genova et al, 2001; Pamplona et al., 2002; St-Pierre et al, 2002).
Основной вклад в образование АФК вносит комплекс Ш (до 80% всего митохондриального 02"). Миграция супероксида, образованного при участии комплекса III, происходит как в матрикс, так и в межмембранное пространство митохондрий. Кроме того в матрикс митохондрии рассеивается 02 , образованный при участии комплекса I и II (Raha et al., 2000; Mo Her, 2001).
Помимо ЭТЦ супероксидный радикал генерируется НАДФН-зависимыми оксидазами фагоцитирующих клеток, альдегидоксидазой, ксантиноксидазой, глюкозооксидазой, флавопротеиндегидрогеназой, микросомальными моноокси-геназами, липооксигеназой, в результате самоокисления флавинов, катехола-минов, гидрохинонов (Babior, 1997).
В отличие от нейтральной молекулы 02, для 02 биологическая мембрана становится ловушкой, так как 02 заряжен и не может пройти сквозь гидрофобный мембранный барьер за исключением тех случаев, когда открываются специфические поры в мембране (Chanock et al., 1994).
Катализируемая СОД реакция утилизации супероксида в межмембранном пространстве и матриксе митохондрий, а также в цитозоле, является одним из главных источников перекиси в клетке независимо от функционального состояния организма и специфики тканей. Установлено (Chance et al., 1979), что в митохондриях 2% от общего потребленного кислорода переходит в пероксид водорода.
Еще одним митохондриальным источником Н202 является моноаминок-сидаза (МАО), которая локализована на внешней митохондриальной мембране и катализирует окислительное дезаминирование биогенных аминов. Скорость образования и концентрация Н202, создаваемая в митохондриях СОД и МАО, различна. Концентрация Нг02, образующейся при работе фермента МАО, на порядок выше чем СОД. Общий вклад митохондрий в образование перекиси в клетке составляет 20-30% при нормальном физиологическом состоянии (Cade-nas, Davies, 2000).
Кроме митохондрий в образовании пероксида водорода участвуют перок-сисомы. 10-30% кислорода, потребляемого пероксисомами печени, переходит в пероксид водорода. При работе таких ферментов, как ацил-КоА-оксидаза, D-аминоацидоксидаза, уратоксидаза в пероксисомах, перекись водорода образуется с константой скорости равной [к=4,5 10D-1071М"J с" ]. р-окисление жирных кислот вносит основной вклад в образование перекиси в пероксисомах. Концентрация перекиси в пероксисомах зависит от специфики органа и уровня метаболизма и в среднем составляет 2,8-10"8М (Mueller et al,, 2002).
Относительно стабильная молекула Н2О2 легко может мигрировать из мест генерации и проникать через мембранные барьеры в клетки, ткани. В процессе образования и миграции супероксида и перекиси в присутствии металлов переменной валентности они могут вступать в реакцию Фентона и Хаббера-Вейса с образованием одного из самого токсичного радикала - гидроксильного (ОН"), который может разрывать любую С-Н- или С-С- связь. Это наиболее ко-роткоживущий радикал (порядка 10"9с), который может диффундировать на расстояние равное нескольким ангстрем (Bomzon, Ljubuncic, 2001).
Антиоксидантная защита организма
В ходе эволюции и по мере накопления в атмосфере 02 в организме образовались защитные системы, которые препятствуют накоплению АФК — нежелательных продуктов аэробного окисления энергетических субстратов. Защита организма от АФК может осуществляться принципиально различными меха 20 низмами: снижением образования первичной АФК - 02 , путем уменьшения концентрации 02 в клетке или более быстрого использования его в условиях выключения фосфорилирующего дыхания. Но основная роль в защите организма от АФК принадлежит антиоксидантной системе (АОС) (Yu, 1994; Benzie, 2000; Zelko et al., 20Ю2). АОС действует по нескольким направлениям: 1) устранение первичных радикалов; 2) устранение вторичных радикалов; 3) устранение третичных радикалов; 4) связывание потенциальных источников радикалов. АОС - сложная многокомпонентная система, в состав которой входят как низкомолекулярные антиоксиданти. - глутатион, аскорбат, ретинолы, токоферолы, мочевая кислота, молочная кислота, каратиноиды, билирубин (Halliwell et al., 1995; Groussard et al., 2000; Muraoka, Miura, 2003), так и антиоксидантные ферменты. Обычно выделяют три линии ферментативной защиты: 1) суперок-сиддисмутаза, 2) селеновая глутатионпероксидаза и каталаза, 3) глутатион-трансфераза, а также фосфолипидглутатионпероксидаза (Babior,1997; Chaudie-re, Ferrari-Ilou, 1999). СОД (КФ 1.15.1.И) является единственным среди известных антиокси-дантных ферментов, непосредственно обеспечивающих обрыв цепей кислород-зависимых реакций в клетках аэробных организмов. СОД осуществляет рекомбинацию радикалов 02 , тем самым защищая от инактивации дегидратазы (аконитаза, 6-фосфоглюконатдегидратаза, фумараза А и Р). Существуют 4 класса СОД: Си,2п-С0Д, Fe-СОД, Мп-СОД, Ni-СОД (Mates et al., 1999; Mates, 2000; Young, Woodside, 2001).
Марганцевая форма СОД (Мп-СОД) содержится в митохондриальном матриксе, а также ассоциирована с внутренней мембраной митохондрий и содержится в бактериях. Содержание Мп-СОД в митохондриях тканей крысы снижается в последовательности сердце почки серое вещество мозга печень (Ibrahim, et al., 1999). Мп-СОД - тетрамер с молекулярной массой 96 кД, со-держащий один атом марганца. Ионы Мп " в ходе дисмутации 02 совершают циклические переходы между состояниями окисления Мп(Ш) и восстановления Мп(И) (Fridovich, 1998).
Митохондрии — один из главных источников Ог в клетке. Концентрация супероксида в митохондриях в 5-10 раз выше, чем в цитозоле и ядерном пространстве. ЭТЦ митохондрий генерирует в матрикс 400 нМ 02 , но в цитозоль диффундирует только 1,5-Ю"3 % 02 /Н02 . Это можно объяснить высоким содержанием в матриксе Mn-СОД- 1,Ы0"3М (Raha et al., 2000; Han et al., 2003).
Мп-СОД играет главную роль в первой линии защиты от СЬ , образующегося при нормальном аэробном дыхании митохондрий. Мелисса и сотр. наблюдали увеличение оксидативных повреждений в митохондриях и в целом в клетке с пониженной активностью Mn-СОД. В митохондриях с пониженной (на 50%) активностью Mn-СОД в десятки раз увеличивается количество 8-ОН-2 -дезоксигуанозина в составе нуклеиновых кислот, карбонильных групп белков, падает активность НАДФ-оксидоредуктазы. Эти изменения предшествуют изменениям ядерного ДНК, когда активируются ферменты проапоптоза (Williams etal., 1998).
Си, Zn-СОД - другая изоформа, сохранившаяся на протяжении эволюции. Обычно она состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 32 кД. Каждая субъединица содержит по одному атому Си и атом Zn. Причем главное значение здесь имеют атомы меди, в то время как атомы цинка играют стабилизирующую роль. Содержание CUjZn-СОД в тканях крысы снижается в последовательности: почки печень легкие сердце кора больших полушарий.
Си, Zn-СОД в основном локализована в цитоплазме, но также обнаружена в межмембранном пространстве митохондрий и ассоциирована с внешней мембраной, где составляет 2,8% от общего количества этого фермента в клетке, ли-зосомах (4-8%), нуклеоплазме, пероксисомах, ассоциирована с мембраной эн-доплазматического ретикулума (Geller, Winge, 1982; Moreno et al., 1997; Liochev, Fridovich, 2000; Zelko et al., 2002).
Cu, Zn-СОД так же, как и Mn-СОД, защищает клеточные компоненты от окислительной модификации под воздействием 02 . В клетках печени 92% Си, Zn-СОД локализовано в цитозоле, а 8% - в митохондриях. Такое распределение фермента в клетке указывает на его роль в защите ферментов и других структурных единиц цитоплазмы как от митохондриального супероксида, так и от источников Ог в самой цитозоле (Han et al., 2001; Han et al., 2003). СОД в межмембранном пространстве митохондрий защищает от действия супероксида ферменты, присутствующие там. (Asayama, Burr, 1985; Fridovich, 1989; Ibrahim et al, 2000; Okado-Matsumoto).
Существуют также никельсодержащая СОД (Ni-СОД) и железосодержащая СОД (Fe-СОД), которые обнаружены у микроорганизмов. Fe-СОД состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярным весом 35(кД) и содержит один атом Fe на молекулу. Ni-СОД состоит из идентичных субъединиц с молекулярной массой 13,4 (кД) (Mates, 2000; Young, Woodside, 2001).
Еще одна изоформа СОД обнаружена во внеклеточном пространстве почти всех органов, известна как экстрацеллюлярная (ЭЦ-СОД). По химическим свойствам и строению она отличается от всех других форм СОД. Это гликопро-теид с молекулярной массой 135 кД, тетрамер состоит из нековалентно связанных субъединиц, содержит один атом Си и один атом Zn. Содержание экстра-целлюлярной СОД снижается в тканях в последовательности: легкие белый жир почки бурый жир семенники (Ookawara et al., 1998).
Синергистом СОД в клетке является каталаза. Каталаза (КФ 1,11,16) -тетрамер, состоит из идентичных субъединиц с молекулярной массой 60 кД„ каждая субъединица содержит гемовую простетическую группу (Fe (II) прото-порфирин (IX)) (Kirkman et al., 1987; Young, Woodside, 2001; Nordberg, Amer, 2001). Каталаза катализирует превращение пероксида водорода в воду и кислород. 2Н202 - 2 Н20 + 02. Константа скорости этой реакции высока и составляет [к= 4,6-107М" с" ].
При низких концентрациях Н202 каталаза может действовать как перок-сидаза. Максимум активности каталазы находится между 25С и 30С при рН 7,6. Так же, как и СОД, каталаза имеет изоформы. Они различаются электрофо 23 ретической подвижностью, оптимумом рН, количеством SH-групп (Deisseroth, Dounce, 1970). Содержание каталазы у млекопитающих особенно велико в эритроцитах, печени и в почках. В клетке каталаза преимущественно локализована в пероксисомах, поэтому пероксисомы являются одним из главных источников Н202 (Mueller et al., 2002). Около 40% общего количества белка перокси-сом из печени крыс составляет каталаза. Каталаза колокализована с Mn-СОД в матриксе митохондрий, где концентрация её составляет 0,72-10"бМ (Rodriguez et al., 2000). Каталаза играет важную роль в эритроцитах, где её концентрация достигает 2-3 нМ (Kirkman et al., 1999). Имеются сведения о локализации каталазы в цитозоле и нуклеоплазме (Radi et al, 1991; Zhou, Kang, 2000).
Обоснование выбора объекта исследования
Эксперименты проведены на 80 малых сусликах (Citellus pygmaeus Pallas) (массой 200-250 г), являющийся типичным представителем зимоспящих животных (Калабухов, 1985). Грызунов отлавливали в районе Буйнакского перевала (Республика Дагестан) в весенний период и до наступления холодов содержали в обычных условиях вивария на смешанном растительно-зерновом рационе. Для индукции зимней спячки сусликов переводили в темное и неотапливаемое помещение.
Известно, что биохимические процессы, происходящие в организме зимоспящих, зависят от глубины и длительности периода спячки (Лапинский, Невретдинова, 1991; Wang, Lee, 1996). В связи с этим исследовали животных в динамике зимней спячки в следующие сроки: 1) перед спячкой в начале октября; 2) кратковременная спячка (температура тела 10-12С); 3) через 1 месяц с момента впадения в спячку (температура тела 5-8С); 4) через 3 месяца с момента впадения в спячку (температура тела 3-4С); 5) через 6 месяцев с момента впадения в спячку (температура тела 14-15С); 6) через 14 дней после окончательного пробуждения от 6-ти месячной зимней спячки. В торпидном состоянии сусликов исследовали в середине баута.
Известно, что гибернация - прерывистый процесс и состоит из б аутов. В промежутках между баутами животные пробуждаются и разогреваются от 1-3С до 33-36С (Калабухов, 1985). Потенциально опасными периодами в динамике баута являются вход и выход из состояния торпидности, так как именно в эти периоды происходит резкая смена метаболических состояний, что может сопровождаться окислительным стрессом (Carey et al., 2003).
В связи с этим после 3-х месячной спячки животных исследовали на от дельные этапах баута: а) начало баута (температура тела 5-8С); б) середина баута (температура тела 3-4С); в) конец баута (температура тела 8-10С); г) межбаутное пробуждение (температура тела 35-36С). Контролем служили бодрствующие в летний период животные. Гипотермию активных в летний период сусликов вызывали в холодовой камере, в рубашке которой циркулировала вода с температурой 4-5С. Температуру тела сусликов снижали до 20С (умеренная гипотермия) и до 10С (глубокая гипотермия).
После декапитации животного быстро извлекали головной мозг, промывали в ледяном 0,9% растворе NaCl, очищали от мозговых оболочек и выделяли серое вещество коры полушарий мозга. Печень перфузировали ледяным 0,9% раствором NaCl, после чего извлекали. Ткань мозга и печени гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в соответствующей буферной среде.
После декапитации животного свободно вытекающую из шейных сосудов кровь собирали в стеклянные центрифужные пробирки с добавлением раствора гепарина (25 ед/мл). Собранную кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Плазму осторожно отбирали и хранили на холоде для дальнейшего анализа.
Эритроциты ресуспендировали в 10,0 мл охлаждённого физиологического раствора, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. Осадок вновь трижды промывали физиологическим раствором. Затем отмытые эритроциты гемолизировали, для чего к 0,3 мл упакованных эритроцитов сильной струей приливали 2,7 мл охлажденной бидистиллированной воды. Стромы эритроцитов осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин. Полученный гемолизат хранили на холоде.
Об интенсивности пероксидации липидов в крови судили по содержанию одного из промежуточных продуктов ПОЛ— малонового диальдегида (МДА).
Количественное определение МДА в плазме крови проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), в результате которой в кислой среде образуется окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 532 нм (Андреева и др., 1988).
Для этого к 0,2 мл плазмы крови добавляли 3,0 мл 1% Н3Р04 и после перемешивания последовательно приливали 1,0 мл 0,6% ТБК и 0,1 мл 0,28% раствора сернокислого железа. Пробы инкубировали на кипящей водяной бане 1 ч и после охлаждения к ним добавляли 4,0 мл бутанола. После центрифугирования измеряли оптическую плотность верхней фазы при 515 и 532 нм против чистого бутанола.
Интенсивность процессов ПОЛ в мозге сусликов в динамике зимней спячки и искусственной гипотермии
Перед залеганием в зимнюю спячку в полярных липидах коры головного мозга сусликов достоверно повышается уровень изолированных двойных связей (табл. 1 и рис.1). Параллельно с повышением ненасыщенности липидов происходит существенное увеличение (на 75%) содержания первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК). Однако это не приводит к повышению уровня промежуточного продукта ПОЛ - МДА.
Кратковременная зимняя спячка сопровождается достоверным падением в головном мозге уровня изолированных двойных связей, одновременно снижается содержание ДК и МДА.
Через месяц после впадения животных в спячку в головном мозге сусликов содержание изолированных двойных связей и МДА снижается, а ДК повышается. При спонтанном пробуждении этой группы животных в головном мозге на фоне несущественного повышения изолированных двойных связей резко возрастает содержание первичных и промежуточных продуктов ПОЛ.
В головном мозге сусликов на всех этапах баута 3-х месячной спячки резко повышается содержание изолированных двойных связей и ДК по сравнению с контрольными животными. При этом содержание МДА в головном мозге существенно не изменяется. Содержание изолированных двойных связей и продуктов ПОЛ в головном мозге сусликов остается высоким и после 6-ти месячной спячки, а также после окончательного пробуждения животных (табл. 1).
Отсутствие прямой зависимости между содержанием изолированных двойных связей, диеновых конъюгатов и МДА в коре головного мозга сусликов в состоянии гибернации и спонтанного пробуждения можно объяснить процессами, сопровождающимися обрывом цепи ПОЛ на его различных участках и соотношением интенсивности образования продуктов ПОЛ и их утилизацией или восстановлением (Косткж, 1985; Antunes et al., 1994).
Другой фактор - методологический, на который указывает ряд авторов. Во многих работах об интенсивности ПОЛ судят по ТБК-реактивному продукту пероксидации арахидоновой и докозагексаеновой кислоты - МДА. А диеновые конъюгаты - продукт пероксидации ненасыщенных жирных кислот, содержащих двойные связи, пероксидация которых может и не сопровождается образованием МДА (Владимиров, Арчаков, 1972; Abuja, Albertini, 2001).
Исследование интенсивности процессов ПОЛ in vitro показало, что у контрольных бодрствующих сусликов интенсивность НАДФ-зависимого (ферментативного) ПОЛ в коре головного мозга сусликов существенно превышает интенсивность аскорбат-зависимого (неферментативного) ПОЛ (табл. 2). Как показывают наши результаты (рис. 2), осенью, перед впадением в зимнюю спячку, в головном мозге сусликов интенсивность ферментативного и неферментативного ПОЛ в условиях in vitro существенно не изменяется. В начале гиберна-ции в мозге интенсивность ферментативного ПОЛ возрастает на 25%, а интенсивность аскорбат-зависимого ПОЛ, наоборот, снижается на 30%. Высокая интенсивность НАДФН-зависимого ПОЛ сохраняется и к месячному сроку спячки. Неферментативное ПОЛ в этот период спячки существенно подавлено и составляет всего 13% от контрольного уровня. Наблюдаемые у этой группы животных изменения в интенсивности ферментативного и неферментативного ПОЛ в торпидном состоянии сохраняются и при спонтанном пробуждении.
Интенсивность ферментативного и неферментативного ПОЛ в головном мозге сусликов на этапах баута 3-х месячной спячки и при межбаутном пробуждении снижается в среднем на 90% и 40% соответственно. Низкая интенсивность ферментативного и не ферментативного ПОЛ в мозге зимоспящих сусликов сохраняется и после окончательного выхода из состояния гибернации.
Кроме того, относительно высокая интенсивность ферментативного ПОЛ в коре больших полушарий мозга бодрствующих, спящих и спонтанно пробудившихся сусликов в начальные периоды спячки указывает на высокую ненасыщенность липидов в микроокружении энзимов, использующихся в качестве донора редуцирующих эквивалентов восстановленного НАДФ и продуцирующих АФК.
Снижение интенсивности ферментативного и неферментативного ПОЛ в коре мозга после 3-х- и 6-ти месячной спячки указывает, с одной стороны, на подавление активности ферментативных систем, генерирующих АФК, с другой, на снижение содержания лабильной арахидоновой кислоты по сравнению с другими ненасыщенными жирными кислотами в мембранных структурах, так как процессы ПОЛ в первую очередь сопровождаются утилизацией именно арахидоновой кислоты (Lokesh et al., 1981; Kubota et al., 1998).
Известно, что в состоянии глубокой спячки, когда температура тела зи-моспящего животного достигает максимально низких значений, для поддержания определенного уровня метаболизма усиливается дыхание (Buck, Barnes, 2000). Видимо, именно с этим процессом связано повышение уровня диеновых конъюгатов, малонового диальдегида и интенсификация процесса фермента тивного ПОЛ в середине баута 3-х месячной зимней спячки относительно других этапов баута (рис. 1,2). Наши наблюдения показали, что к третьему месяцу зимней спячки температура тела спящих животных была самой низкой и составляла около 2С.
Один из факторов инициации неферментативного ПОЛ, в отличие от ферментативного, является присутствие в системе ионов металлов переменной валентности. Известно, что интенсивность неферментативного процесса ПОЛ отражает доступность мембранных липидов для прооксидантов и состояние ан-тиоксидантной системы тканей (Владимиров, Арчаков, 1972). Исходя из этого, можно предположить, что при гибернации мембраны клеток мозга перестраиваются, в результате чего существенно уменьшается доступность жирнокис-лотных радикалов фосфолипидов для АФК, а также возрастает их обеспеченность антиоксидантами.
Низкий уровень МДА в коре больших полушарий мозга сусликов в середине баута месячной спячки соответствует низкой интенсивности неферментативного ПОЛ в данный период (табл 1, 2). Эти изменения невозможно объяснить только с позиции подавления антиоксидантами факторов инициирующих ПОЛ, так как активность антиоксидантов, исследованных нами в этот период, очень низка. Возможно, здесь имеет место усиление процессов восстановления гидроперекисей липидов, и эти изменения связаны с активностью другого ан-тиоксиданта - глутатионпероксидазы (Buzadzic et al., 1990), активность которой может возрастать при увеличении первичных продуктов ПОЛ, как это наблюдается в середине баута первого месяца зимней спячки. В то же время важную роль в интенсивности неферментативного ПОЛ могут играть качественные и количественные изменения липидов и липид-белковых комплексов, содержание которых определяют структурномодификационные изменения в мембранах ге-теротермных животных во время зимней спячки (Харакоз, 2001).
Поскольку зимняя спячка является адаптивной стратегией, то изменения интенсивности процессов ПОЛ следует рассматривать не с позиции их патологической роли, а в контексте их участия в адаптивных механизмах.
