Введение к работе
Актуальность проблемы. Зимняя спячка млекопитающих-уникальное биологическое явление, при котором естественным путем резко снижаются метаболизм и функции организма (Пантелеев, 1983).
В динамике зимней спячки механизмы терморегуляции сохраняются, но они поддерживают телшературу тела на более низком уровне. При этом биохимические процессы, работа органов и систем организма гибернантов перестраиваются так, что даже при очень низкой температуре тела поддерживается определенный гомеостаз (Карманова, 1995).
При спячке, несмотря на низкую телшературу тела, в головном мозгу происходят весьма сложные специфические биохимические процессы, и протекание этих процессов обеспечивается функционированием мембранных структур и ферментативного аппарата клетки, в котором белки мозга играют существенную роль. Нервная ткань зимоспящих обладает высокой толерантностью к низким температурам (Демин и др., 1988; Шугалей, 1992). Существенную роль в приспособлении клеток гетеротермных животных к функционированию в различных температурных условиях может играть процесс синтеза новых, или модификация структуры и функции имеющихся в клетке белков (Велик, 1962; Жегунов и др., 1991). Зимняя спячка мелких грызунов -прерывистый процесс, сопровождающийся периодическими пробуждениями с разогревом тела до 37С.
Знание нейрохимических изменений в течении зимней спячки прокладывает мост к практическому использованию этого уникального состояния организма - гипобиоза. Полученные данные могут быть положены в основу разработки методов создания, управляемого при помощи естественных механизмов, гипотермии, что чрезвычайно важно для клиники, когда требуется поддержать организм более или менее длительное время в состоянии значительно сниженных физиологических функций (Демин и др., 1988; Карманова, 1995).
Возможность длительного обратимого изменения физиологического
статуса организма и проблема управляемого гипобиоза имеют глубокий
теоретический и практический интерес. В природных условиях эти задачи
естественным путем решаются у гибернирующих животных, в тканях и
плазме которых содержатся низкомолекулярные биологически активные
вещества, способствующие как снижению активности различных систем
организма при погружении животного в спячку, так и быстрой активации
их до исходного уровня при пробуждении животных (Ашмарин и др.,
1999). .
Особенности регуляций >метаболизмальуд Зимоспящих связаны с повышением регуляторной нагрузМ-' продуктов {деградации белков -
03 2»j)7*'f«' 1
пептидов, производных аминокислот и мочевины. Мишенью для регуляторных воздействий служат клеточные и субклеточные мембраны, которые обладают уникальной способностью сохранять свою целостность при резком изменении температуры тела (Шортанова и др., 1986; Демин и др., 1988).
Активность лизосомальных ферментов может служить чувствительным тестом уровня метаболизма организма.
Нарушение сложной системы внутриклеточного протеолиза является причиной многих заболеваний и патологий (Wichnew, 1999).
Из лизосомальных ферментов нервных структур особый интерес представляют протеолитические ферменты, с функционированием которых связаны как образование, так и инактивация многих биологически активных пептидов.
Одной из основных лизосомальных протеиназ мозга является кислая протеиназа (катепсин Д, КФ 3.4.23.5), отличающаяся широким спектром действия и играющая важную роль в метаболизме различных белков и пептидов, в том числе кортикотропина, (3-липотропина, р-эндорфина, соматостатина, люлиберина, ангиотензиногена, вещества Р и других пептидов.
Накапливаются данные о внелизосомных, специфических функциях катепсина Д. В мозге катепсин Д в основном локализован в нейронах. Естественно предположить важную роль катепсина Д в выполнении информационной функции.
Высказывается гипотеза, что катепсин Д может участвовать в ремоделинге синаптических контактов уже после завершения синаптогенеза (Suopanki et al., 2000).
В динамике зимней спячки в мозге суслика периоды биосинтетического молчания сменяются интенсивным биосинтезом макромолекул, который должен сопровождаться соответствующим распадом. В связи с изложенным выше, представляется весьма актуальным исследовать изменения активности катепсина Д в мозге суслика в ходе зимней спячки. Эти изменения должны отражать процессы регуляции биохимических процессов в мозге при переходе от гипобиоза к интенсивной физиологической и биосинтетической активности.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение температурной зависимости активности катепсина Д из мозга суслика в период бодрствования и в динамике зимней спячки.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить температурную зависимость автолитической и протеолитической активности гомогенатов тканей мозга и печени сусликов: осенью, перед вхождением в спячку и весной, в период пробуждения.
-
Исследовать температурную зависимость активности катепсина Д в гомогенатах мозга суслика в период летнего бодрствования.
-
Изучить температурную зависимость активности катепсина Д в различных отделах мозга (больших полушариях, среднем мозге и мозжечке) суслика на этапах гибернационного периода: подготовки к спячке, пробуждения после баута спячки, выхода из длительной спячки.
-
Выяснить влияние зимней спячки у сусликов на седаментируемую и неседаментируемую активность катепсина Д.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
У сусликов, перенесших зимнюю спячку, как в мозге, так и в печени происходит значительное повышение автолиза. Однако протеолитическая активность катепсина Д возрастает лишь в мозгу у пробудившихся от зимней спячки сусликов.
-
Температурная зависимость активности катепсина Д из мозга суслика и из мозга крысы отличается только в режиме инкубации 30 и 37С.
-
Температурная зависимость активности катепсина Д, выраженная в координатах Аррениуса, в больших полушариях мозга суслика при подготовке к спячке в условиях инкубации 20С имеет излом, а при пробуждении от зимней спячки - плато, при температурах инкубации 10-30С.
Значительные изменения в больших полушариях и мозжечке мозга суслика наблюдаются при пробуждении после баута спячки, в то время как в среднем мозге таких изменений на этапах зимней спячки не обнаруживается.
4. Выявлена отрицательная температурная зависимость активности
катепсина Д в неседиментируемой фракции мозга при 5С инкубации при
пробуждении после баута спячки и при полном пробуждении от зимней
спячки.
5. Установлена связь между сезоном года и температурной
зависимостью активности катепсина Д из мозга суслика: весной, при
пробуждении от зимней спячки активность фермента выше, чем осенью
при всех исследованных температурах инкубации (5,10,20,30 и 37С).
На температурную зависимость активности катепсина Д из печени суслика сезон года не влияет.
Научная новизна. В данной работе впервые исследована температурная зависимость пептидгидролазной активности в мозге сусликов на разных этапах погружения в зимнюю спячку, при глубокой зимней спячке и выходе из нее.
Измеренна температурная зависимость катепсина Д из мозга крысы и суслика в норме.
Установлена связь между сезоном года и температурной
зависимостью активности катепсина Д мозга зимоспящего животного как для экзогенного, так и для эндогенного субстрата.
Выявлен факт изменения активности катепсина Д в больших полушариях мозга и мозжечке и изменения распределения солюбилизированной и несолюбилизированной форм данного фермента в динамике зимней спячки.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов регуляции зимней спячки, расширяют наши представления о роли катепсина Д во внутриклеточном обмене белков и контроле за состоянием белков в динамике зимней спячки. Выявленные температурные зависимости активности катепсина Д в разные периоды спячки в больших полушариях мозга и мозжечке могут быть использованы для контроля состояния гомойотермного животного при искусственной гипотермии и постгипотермическом состоянии.
Результаты и методические разработки данного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии Дагестанского государственного университета, при чтении курсов «Энзимология», «Экологическая биохимия» и «Эволюционная биохимия» и проведении биохимических практикумов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на Всероссийской научно-практической конференции «Химия в технологии и медицине» (Махачкала, 2002; 2003), 7-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003).
Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 5 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 112 отечественные и 93 иностранные источники. Работа изложена на 121 стр. машинописного текста. Содержит 7 табл., З^диагр. и 11 рис.
