Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Активные формы кислорода и механизмы окислительного повреждения макромолекул 9
1.2. Механизмы окислительной модификации белков 17
1.3. Физиологические и биохимические изменения в тканях при зимней спячке 31
1.4. Свободнорадикальные процессы и механизмы их регуляции при зимней спячке 38
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования
2.1. Объект исследования 46
2.2. Постановка опытов 46
2.2.1.Исследование состояния гибернации 46
2.2.2. Исследование индуцированного пробуждения гибернирующих сусликов 47
2.2.3.Искусственное снижение температуры тела 47
2.3. Препаративные методы исследования 47
2.3.1.Получение плазмы крови, эритроцитов и гемолизата 47
2.4. Биохимические методы исследования 48
2.4.1 .Определение содержания белка в плазме крови биуретовым методом 48
2.4.2.Определение окислительной модификации белков плазмы крови 48
2.4.3.Определение общего содержания среднемолекулярных пептидов в плазме крови 50
2.4.4.Определение антиокислительной активности гидрофильных компонентов плазмы крови 51
2.4.5. Опре деление активности супероксиддисмутазы 52
2.4.6.Определение активности каталазы 53
2.4.7.Определение содержания гемоглобина в крови аммиачным методом 54
2.4.8.Количественное определение белка по Лоури 54
2,4.9.Определение содержания мочевой кислоты в плазме крови 55
2.5, Статистическая обработка результатов 55
ГЛАВА III. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Интенсивность окислительной модификации белков и активность антиоксидантов крови в разные сроки спячки сусликов 57
3.1.1 . Изменение содержания белка и среднемолекулярных пептидов в плазме крови в разные сроки зимней спячки 57
3.1.2.Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови сусликов в динамике зимней спячки 60
3.1.3. Состояние антиоксидантной системы крови при зимней спячке 64
3.2. Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови сусликов и активность антиоксидантов в динамике баута спячки 70
3.3. Интенсивность окислительной модификации белков и активность антиоксидантов в ходе спонтанного пробуждения сусликов 76
3.4. Влияние гипотермии на интенсивность окислительной модификации белков и активность антиоксидантов крови 85
Заключение 91
Выводы 100
Литература 102
- Механизмы окислительной модификации белков
- Свободнорадикальные процессы и механизмы их регуляции при зимней спячке
- Изменение содержания белка и среднемолекулярных пептидов в плазме крови в разные сроки зимней спячки
- Состояние антиоксидантной системы крови при зимней спячке
Введение к работе
Актуальность проблемы. Зимняя спячка является уникальной моделью природной адаптации млекопитающих к низкой температуре тела (Калабу-хов, 1985; Boyer, Barnes, 1999; Storey, 2001). Гибернация сопровождается резким снижением температуры тела, потребления кислорода, сердечных ритмов, метаболического уровня и других физиологических и биохимических процессов в тканях (Wang, Lee, 1996; Geiser, 2004). Однако при низкой температуре тела работа органов и систем организма гибернантов не тормозится, а перестраивается так, что поддерживается определённый гомеостаз (Карманова, 1995).
Зимняя спячка мелких грызунов является прерывистым процессом: в течение всего периода гибернации суслик просыпается 10-15 раз и бодрствует в течение 2-20 часов (Игнатьев и др., 2001; Wang, Lee, 1996). При входе в зимнюю спячку и выходе из неё происходит резкая смена одного метаболического уровня на другой (Toien et al., 2001). Это касается, прежде всего, потребления кислорода, скорости кровотока, перфузии тканей и интенсивности метаболических процессов (Hermes-Lima, Zenteno-Savin, 2002; Storey, Storey, 2004). В результате в тканях зимоспящих животных интенсифицируются процессы образования активных форм кислорода (Toien et al., 2001).
В условиях оксидативного стресса окислительной модификации подвергаются важнейшие биомолекулы клетки, и в первую очередь белки, которые выполняют сигнальную роль, участвуя в регуляторных процессах (Дубинина, 2001; Турпаев, 2002; Boyer, Barnes, 1999).
Однако, несмотря на потенциальную возможность активации процессов образования активных форм кислорода, в тканях зимоспящих животных не возникают патологические изменения (Frerichs et al,, 1994; Frerichs, Hallenbeck, 1998). Можно предположить, что у гибернантов существуют защитные механизмы, направленные на устранение негативных эффектов активных форм кислорода. Вместе с тем, в настоящее время не вполне понятно,
каким образом осуществляется регуляция свободно-радикальных процессов в тканях гетеротермных животных в период зимней спячки.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение интенсивности окислительной модификации белков плазмы крови сусликов и механизмов её регуляции на разных этапах зимней спячки и искусственной гипотермии.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи, Изучить в динамике зимней спячки, в ходе баута спячки, при индуцированном пробуждении от гибериации и при искусственной гипотермии в плазме крови сусликов:
1, Интенсивность окислительной модификации белков по анализу кар
бонильных групп.
2. Содержание белка и среднемолекулярных пептидов.
3, Активность ключевых антиоксидантных ферментов - супероксид-
дисмутазы и каталазы эритроцитов, а также общую антиокислительную ак
тивность гидрофильных компонентов.
4. Содержание мочевой кислоты в плазме крови сусликов.
Основные положения, выносимые на защиту.
Интенсивность процессов окислительной модификации белков плазмы крови сусликов меняется в динамике зимней спячки и баута.
В процессе принудительного пробуждения сусликов от глубокой зимней спячки ускоряются процессы окислительной модификации белков.
При искусственной гипотермии бодрствующих летом сусликов, как и при зимней спячке, наблюдается устойчивость белков плазмы крови сусликов к окислительной модификации,
В механизме защиты компонентов крови от окислительной модификации как при зимней спячке, так и при искусственной гипотермии основную роль выполняют гидрофильные антиоксид анты.
Научная новизна. Впервые установлено, что одной из важнейших составляющих адаптации зимоспящих животных к снижению температуры те-
7 ла является повышение устойчивости белков плазмы крови сусликов к свободно-радикальному окислению.
Получены результаты, свидетельствующие о том, что индуцированное пробуждение сусликов стимулирует образование активных форм кислорода, что в свою очередь способствует окислительной модификации белков плазмы крови.
Обнаружено, что важнейшую роль в защите белков плазмы от окислительной модификации при зимней спячке, последующем пробуждении и искусственной гипотермии выполняют гидрофильные антиоксиданты плазмы и каталаза эритроцитов.
Теоретическая и практическая значимость. Выявленные в работе закономерности изменения процессов окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермических состояниях различной глубины и длительности у сусликов представляют интерес для понимания молекулярных механизмов устойчивости гетеротермных животных к низким температурам тела как в условиях зимней спячки, так и при искусственной гипотермии.
Практическая значимость данной работы определяется перспективностью использования ряда изученных показателей крови для оценки и коррекции искусственных гипометаболических состояний в медицине. Результаты работы указывают на возможность повышения устойчивости гомоиотермных животных к низким температурам тела путем повышения емкости антиокси-дантной системы.
Материалы, полученные при выполнении данной диссертационной работы, используются в учебном процессе на кафедрах биохимии и биофизики Дагестанского государственного университета и Махачкалинского филиала Ростовского государственного университета при чтении ряда спецкурсов.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на Всероссийской научно-практической конференции «Химия в технологии и медицине» (Махачкала, 2001), на Международном научном семинаре вузов Северо-Кавказского региона «Циклы» (Ставрополь,
8 2002), на 6-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - Наука XXI века» (Пушино, 2002), на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на 57-й научной конференции молодых учёных и студентов (Махачкала, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них одна в реферируемом журнале.
Механизмы окислительной модификации белков
Скорость образования АФК тесно связана со скоростью потребления кислорода и пропорциональна количеству митохондрий в клетках. В печени крыс и сердце свиньи при физиологической концентрации 02 около 1-4% потреблённого кислорода превращается в 02 и Н202 (Лущак, 2001; Storey, 1996).
Действие АФК в организме фактически направлено на 3 типа клеточных мишеней: белки, нуклеиновые кислоты и липиды. В норме они активно участвуют в их метаболизме, а при патологических состояниях - в их окислительной деструкции. Окислительная модификация белков, нуклеиновых кислот и липидов при участии АФК постоянно наблюдается в тканях и играет важную роль в распаде этих соединений. Это один из этапов обновления химического состава тканей (Дубинина, 1998).
Кроме того, АФК участвуют в регуляции различных процессов в тканях, включая рост клеток, апоптоз, клеточную адгезию. Оксиданты, выступая в качестве вторичных мессенджеров, стимулируют фосфорилирование белков. АФК стимулируют накопление в клетке вторичных посредников - ци-клонуклеотидов (цАМФ и цГМФ), при этом последний образуется в результате активации NO (но не другими АФК) гиалоплазматической гуанилцик-лазы. АФК вызывают накопление ионов Ca2i в цитозоле и стимуляцию фос-форилирования белков в результате активации протеинкиназ (особенно про 15 теинкиназы С) и протеинтирозинкиназ и ингибирования протеинфосфатаз; активируют белок Ras, играющий важную роль в передаче сигналов в ядро клетки (Турпаев, 2002; Droge, 2002).
АФК и гидроперекиси липидов в низких субтоксических концентрациях индуцируют такие процессы, как экспрессия генов (в том числе генов раннего ответа и других протоонкогенов) и деление клеток. Н202, накапливающаяся при инвазии вирусов и бактерий, активирует транскрипционный фактор NF-кВ (Турпаев, 2002; Desagher, Martinou, 2000), что приводит к индукции ряда цитокинов и иммунных рецепторов и, в результате, к иммунным и воспалительным ответам, а также к индукции белков острой фазы и адгезии, что способствует выходу лейкоцитов в ткани, что важно при воспалении (Forman et al., 2004).
Коллагеназа может высвобождаться из её скрытой формы посредством окисления гипохлорной кислотой и 02 (Griffiths, 2000). Также обнаружено, что 02 увеличивает активность Са++- и фосфолипидзависимой протеинкина-зы Є. Действие оксидантов связывают с регуляторным доменом фермента, в состав которого входят тиолы (Дубинина, 1998).
Таким образом, АФК играют важную роль в регуляции физиологических функций в тканях, вызывая стимуляцию различных сигнальных транс-дукционных процессов. В нормально функционирующем организме АФК следует рассматривать с позиций их биологической значимости. С одной стороны - это продукты нормально протекающих окислительно- восстановительных реакций, с другой - это специфические регуляторы метаболических процессов (Дубинина, 1998).
Токсическое действие АФК проявляется при состояниях оксидативного стресса, который сопровождается усилением свободнорадикальных процессов в тканях.
Для оксидативного стресса в первую очередь характерно нарушение в соотношении анти- и прооксидантной систем в сторону повышения последней, отсутствие мобилизации активности антиоксидантной защиты и нарушение сбалансированности самих компонентов системы. Начальные этапы запуска реакции генерации АФК при различных патологических состояниях могут отличаться, но уже на следующих этапах направленность и интенсивность свободнорадикальных процессов теряют свою специфичность и зависят от состояния и степени мобилизации систем антиоксидантной защиты (Лущак,2001).
Так, при ишемии основным источником АФК являются митохондрии. Нарушение системы дыхательных ферментов приводит к накоплению субстратов, коферментов, флавин- и гемсодержащих соединений в восстановленном состоянии. В этих условиях может происходить утечка единичных электронов, сопряжённая с одноэлектронньш восстановлением 02 и образованием 02 . При ишемии нарушается синтез АТФ, наблюдается частичная деполяризация мембран и перераспределение в тканях ионов Са2+, что приводит к повышению их уровня в цитозоле. Са2+ активирует протеазы, которые превращают ксантиндегидрогеназу в ксантиноксидазу, продуктами реакции которой являются 02 и Н2О2 (Lee et al., 2000).
При патологических состояниях на фоне интенсивной генерации радикальных продуктов снижается АОЗ. АФК ингибируют активность ферментов - антиоксиданте в. Н202 тормозит активность СОД, а 02 - активность ката-лазы (Арчаков, Мохосоев, 1989; Дубинина, 1989). ONOO- способен окислять NH- и SH-группы белков (Murphy, 1999), что приводит к инактивации оср ингибитора протеиназ, Mn-СОД и Fe-СОД. В присутствии ONOO или продуктов его распада образуются тиольяые радикалы глутатиона, в результате чего последний из аитиоксиданта превращается в прооксидант, инициирующий ПОЛ (Меныцикова и др., 2000).
При состоянии оксидативного стресса возрастает восстановительный потенциал клеток, что приводит к снижению рН в очагах ишемии до 5,0. Это создаёт условия для повышения пула «активных форм» металлов переменной валентности, которые могут участвовать в образовании радикальных продуктов и при взаимодействии с некоторыми антиоксидантами. Так, в присутствии Fe /Си и 02 аскорбиновая кислота является источником семигидроас-корбат-радикала, ОН и И202 (May, 1999; Naidu, 2003).
Повышение уровня АФК сопряжено с интенсификацией процессов окислительной деструкции липидов, белков, нуклеиновых кислот, углеводов. Именно интенсификация этих процессов является основной причиной поражения тканей. Окислительная деструкция белков приводит к инактивации ряда ферментов, нарушению структуры и функций клеточной мембраны, её рецепторного аппарата, ионных каналов (Дубинина, 1998). Так, 02 участвует в инактивации ацетилхолинэстеразы, гемоглобина, глутатионпероксидазы (Арчаков, Мохосоев, 1989; Kono, Fridovich, 1982; Shimizu et al., 1984). H202 вызывает деградацию цитохрома с и некоторых гликопротеидов (Zhangs et al,, 1990). Многие ферменты (карбоксипептидаза А, папаин, СОД, рибонуклеаза) инактивируются под действием гидроксильных радикалов (Zhangs et al., 1990).
Полиненасыщенные жирные кислоты (арахидоновая кислота) особенно чувствительны к радикальной атаке. Дегидрирование за счёт атаки радикалами приводит к возникновению С-центральных радикалов липидов (конъюги-рованные диены), которые затем реагируют с 02, формируя пероксилрадика-лы (гидроперекиси липидов) (Storey, 1996). Пероксидация ненасыщенных жирных кислот сопровождается образованием высокотоксических промежуточных соединений, оказывающих разрушительное действие на окружающие ткани. Это группа токсических альдегидов (4-гидроксиноненаль, 4,5- дигид-рооксидесеналь), которые ингибируют синтез белков, активность многих ферментов. Присутствие гидропероксидов липидов в мембране нарушает их функции за счёт изменения текучести и приводит к утечке ионов (Са2+) через мембрану; это активирует фосфолипазу, что приводит к окончательному разрушению мембраны (Halliwell, 1989).
Свободнорадикальные процессы и механизмы их регуляции при зимней спячке
Разогревание до нормальной температуры тела во время пробуждения из спячки происходит за 2-2,5 часа. При этом резко увеличивается температура тела, потребление кислорода, интенсивность метаболизма и скорость кровотока.
Драматические изменения, происходящие во время цикла оцепенение-пробуждение у гибернирующих животных, могут увеличивать риск окислительного стресса. Этому способствуют следующие факторы: 1) высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот (Калабу-хов, 1985; Лапинский, Невретдинова, 1987), которые легко подвергаются пе-рекисному окислению, что ведёт к самоподдерживающимся цепным реакциям между полиненасыщенными жирными кислотами и активными формами кислорода, продуцируя высокий уровень липидных гидроперекисей, в том числе и токсичных для клеток; 2) глубокие изменения в токе крови, происходящие во время входа в оцепенение и пробуждения до эутермии, которые могут индуцировать ише-мию/реперфузию в чувствительных тканях (Carey et al., 2000). Кроме того, при низких температурах тела возникает вероятность ише-мических повреждений органов и тканей. Причины их следующие: 1) сама низкая температура тела - органы «ядра» большинства млекопитающих проявляют метаболические нарушения при t 25C; 2) ишемия - перерыв в снабжении кислородом и субстратами, что приводит к энергетическому кризису; 3) реперфузионные повреждения - при возобновлении снабжения кислородом возникает опасность окислительного стресса; 4) отёк - недостаток АТФ и влияние низкой температуры на активность ионных насосов через ионные каналы, что приводит к внутриклеточному накоплению Na+ и С1 ; 5) автолиз - снижение разницы мембранного потенциала приводит к открытию Са" -каналов и неконтролируемому росту цитозольного Са (Storey, 2004). Гибернирующие суслики переживают более чем 50-кратное увеличение в потреблении 02 во время выхода из оцепенения (Boyer, Barnes, 1999). Увеличение метаболического уровня во время разогревания (в течение 2-3 ч) приводит к состоянию сверхгенерации АФК (Toien et al., 2001; Drew et al., 2002). Опасность окислительного стресса состоит в том, что АФК могут привести к интенсификации процессов ПОЛ и окислительной модификации белков, нуклеиновых кислот (Zwart et al., 1999). Диеновые конъюгаты продуцируются в начальной стадии перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот, и их присутствие в тканях живых организмов отражает оксидативный стресс. По данным Кери (Carey et al., 2000) содержание диеновых коиъюгатов значительно выше при входе в гибернацию и в коротком бауте оцепенения, чем у летних активных сусликов, а у гибернирующих животных их уровень в целом выше, чем летом. Ла-пинский А.Г. и Невретдинова З.Г. (1987) показали, что уже до начала гибер-национного периода содержание продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) в липидной фракции мембран эритроцитов увеличивается и остаётся высоким в течение всего периода гибернации. Значительное сокращение метаболизма в глубоком оцепенении сокращает степень оксидативного стресса. B.C. Шугалей (1992) показала, что в мозге и печени спящих сусликов исходный уровень малонового диальдегида низкий, способность к ПОЛ также невысокая. Кроме того, она установила, что активность пероксидазы в тканях зимнеспящих сусликов значительно выше, чем у бодрствующих животных. Исследования Э.З. Эмирбекова (Эмирбеков и др., 1991) выявили, что при подготовке к зимней спячке исходный уровень интенсивности ПОЛ в мозге сусликов очень низкий, в то же время потенциальная активность ПОЛ почти в 2 раза выше, чем у летних активных животных. Во время зимней спячки и перед пробуждением устанавливается одинаковый, но повышенный почти в 2 раза, исходный уровень малонового диальдегида в мозге, в то время как потенциальная активность ПОЛ стабильно снижается, что, как считают авторы, является компенсаторно-приспособительным механизмом для стабилизации мембран тканей мозга в условиях низкой температуры тела. Кери с сотр. (Carey et al., 2000) показала, что кумулятивные повреждения клеточных липидов активными формами кислорода могут происходить при низких температурах тела, тогда как компоненты системы антиокислительных ферментов могут быть неактивными в этих условиях. Это может приводить к потенциальному повреждению клеточных липидов и других макромолекул через оксидативный стресс. Дрю и сотр. (Drew et al 1999) обнаружили значительное увеличение концентрации аскорбата в цереброспинальной жидкости у арктического суслика и 3-4-кратное увеличение аскорбата в плазме у арктического и тринадцатиполосного сусликов. После пробуждения содержание аскорбата падает до прегибернационного уровня. Аскорбат - наиболее значимый водорастворимый антиоксидант, функция которого состоит в удалении активных форм кислорода в крови и других тканях. Увеличение циркулирующего аскорбата, встречающееся у гиберни-рующих сусликов, может предотвращать окислительные повреждения эндо-телиальных клеток и окружающих тканей (Drew et al., 1999; Ma et al., 2004). Накопление аскорбата в плазме во время гибернации обусловлено уменьшением его утилизации, что в свою очередь связано с глубоким сокращением потребления 02.
При спонтанном пробуждении аскорбат перераспределяется к метаболически активным тканям, включая мозг, когда необходима защита против окислительного стресса (Rice, 2000). При пробуждении от гибернации максимум уменьшения аскорбата совпадает с пиком потребления Ог, и, следовательно, с генерацией АФК, и с пиком накопления мочевой кислоты в плазме (Toienetal.,2001). Мочевая кислота - продукт метаболизма пуринов, катализируемого ксантиноксидазой. Ксантиноксидаза транспортирует электроны к Съ, генерируя супероксиданион, Н202 и мочевую кислоту (Lee et al., 2000; Li, Jackson, 2002). Временное увеличение в плазме содержания мочевой кислоты может быть свидетельством увеличения генерации АФК. В то же время мочевая кислота обеспечивает дополнительную антиоксидантную защиту при состоянии окислительного стресса (Toien et al., 2001; Drew et al., 2002).
Lлyтaтиoн - главный тиолдисульфидный антиоксидант в клетках и важный компонент антиоксидантной защиты. Отношение восстановленного GSH к его окисленной форме GSSG, которое является индексом окислительного стресса, 5-кратно снижено у гибернирующих сусликов по сравнению с летними, что обусловлено увеличением концентрации GSSG у гибернантов (Blagojevic et al., 1998; Carey et al., 2003). Во время гибернации общий уровень GSH ниже у сусликов после пробуждения и выше во время межбаутиого пробуждения. Гибернация уменьшает активность GSH-редуктазы кишечника на 50%, но не влияет на активность глутатионпероксидазы (Carey et al, 2003). Уровень же глутатиона в плазме остаётся относительно постоянным, в нервной ткани его содержание или стабильно, или незначительно увеличено во время гибернации, отражая сильный гомеостаз антиокислительной системы мозга (Drew et al., 1999).
Изменение содержания белка и среднемолекулярных пептидов в плазме крови в разные сроки зимней спячки
Таким образом, в период спячки в плазме крови сусликов поддерживается достаточно высокий уровень антиоксидантов.
Наиболее важными гидрофильными антиоксидантами в плазме крови, которые снижают степень ишемических повреждений, являются аскорбиновая кислота (Ma et al., 2004) и глутатион (Carey et al., 2003). Эти антиокси-данты имеют сходство и различие в выполняемых функциях. Аскорбиновая кислота и глутатион эффективно восстанавливают пероксильные и гидро-ксильные радикалы, супероксиданион и синглетный кислород (Meister, 1992). Восстановленный глутатион принимает участие в ферментативных реакциях, опосредованных глутатион-пероксидазой (Meister, 1992; Young, Woodside, 2001; Storey, 2004). Окисленный глутатион восстанавливается глутатионре-дуктазой, тогда как аскорбат восстанавливается за счёт глутатиона и дегид-роаскорбатредуктазы (Rice, 1999).
Увеличение антиокислительной активности в торпидном состоянии сусликов может быть обусловлено накоплением аскорбата в плазме, что связано с уменьшением его утилизации из-за глубокого сокращения потребления кислорода. Согласно литературным данным, в торпидном состоянии содержание аскорбата в плазме крови арктического и тринадцатиполосного суслика увеличивается в 3-4 раза (Drew et al., 1999).
Эндотелиальные клетки кровеносных сосудов содержат индуцибель-ную форму NO-синтетазы, которая принимает участие в синтезе оксида азота. Оксид азота при гибернации модулирует высвобождение нейротрансмит-теров, регулирует кровоток, участвует в переводе «циркадианных часов», в механизмах сна и пробуждения (Онуфриев и др., 2002). Оксид азота при взаимодействии с супер оксид анионрадик ал ом образует токсичный продукт -пероксинитрит, который частично попадает в кровоток и может вызывать окислительные повреждения и самих эндотелиальных клеток, и окружающих тканей (Меныцикова и др., 1997; Bomzon, Ljubuncic, 2001). Увеличение аскорбата в плазме крови у спящих сусликов препятствует таким окислительным повреждениям (Drew et al., 1999; Ma et al., 2004). По данным Дрю и сотр. (Drew et al., 1999) содержание глутатиона в плазме поддерживается на уровне летнего контроля.
Анализ ферментативного звена антиоксидантиой защиты крови при спячке показал, что активность каталазы перед впадением в спячку увеличивается на 30,5% относительно летнего контроля (табл. 5, рис. 6). Кратковременная спячка приводит к некоторому снижению активности каталазы, но, тем не менее, она остаётся выше контроля на 17,5% (рис. 6). Спячка в течение одного месяца ведёт к увеличению активности этого фермента на 21,3%, однако при 2-хмесячной спячке активность каталазы приближается к уровню контрольных животных. После 6 месяцев спячки активность каталазы практически равна активности у бодрствующих летом животных (табл. 5, рис. 6).
Таким образом, в течение гибернации поддерживается высокий уровень каталазы в эритроцитах.
Увеличение активности каталазы в эритроцитах сусликов связано с необходимостью снизить концентрацию перекиси водорода в период гибернации. Перекись водорода генерируется митохондриями эндотелиальных клеток и выполняет сосудорасширяющую функцию, как и нитрорадикал (Gaetani et al., 1994; Liu et al., 2003), поэтому его концентрация в крови достаточно высока (Halliwell et al., 2000). Как известно, спячка сопровождается ацидозом (Desagher et al,, 1996; Hochachka, Somero, 2002). Закисление среды приводит к высвобождению металлов переменной валентности из металлопротеинов. (церулоплазмин, трансферрин и др.), которые при взаимодействии с перекисью водорода способствуют образованию гидроксильного радикала в реакции Фентона, Кроме того, перекись водорода, как продукт дисмутации су-пероксиданионрадикала в эритроцитах и плазме крови, представляет опасность для гемоглобина из-за содержания в составе гема железа (Mueller et al., 1997; JeneyetaL, 2002).
В отличие от каталазы, активность другого ключевого антирадикального фермента - супероксиддисмутазы перед впадением в спячку снижается на 27% относительно контрольных животных (табл. 5, рис. 6). Впадение животных в спячку приводит к резкому снижению активности супероксиддисмутазы. В этот период активность СОД составляет 41,5% от её активности у контрольных животных. В течение первого месяца спячки активность СОД про 69 должает снижаться (рис. 6). После двух месяцев спячки активность СОД эритроцитов постепенно возрастает и к окончанию спячки (6 месяцев) её активность превышает контрольный уровень на 11,6%.
Низкая активность СОД в эритроцитах крови в первые месяцы зимней спячки, видимо, связана со снижением генерации супероксидного радикала в процессе транспорта кислорода гемоглобином (Misra, Fridovich, 1972). Регуляция активности СОД в разные сроки зимней спячки, возможно, связана с конформационными изменениями в молекуле фермента под действием окси-дантов (Shull et al.,1991; Brame et al., 2004). Под действием оксидантов в молекуле фермента может изменяться соотношение -SH/SS групп (Hoshino et al., 1985); происходить нитрирование аминокислотных остатков (Forman et al., 2004). Под действием оксидантов может изменяться соотношение числа активных и неактивных молекул СОД в обратимых процессах димеризации, тетрамеризации (Наглер и др., 1991; Ji, Bennett, 2003).
Полученные результаты свидетельствуют о важнейшей защитной роли каталазы эритроцитов при спячке. В целом, антиоксидантную защиту крови выполняют гидрофильные аитиоксиданты и каталаза.
Состояние антиоксидантной системы крови при зимней спячке
Гибернация, или зимняя спячка, представляет собой форму адаптации животных к действию неблагоприятных условий обитания: низкой температуре окружающей среды, отсутствию пищи и др. (Калабухов, 1985). Она затрагивает все уровни организации от биохимического до поведенческого и заключается в реализации генетических программ, запускаемых при действии соответствующих внешних (укорочение фотопериода, понижение температуры тела, бескормица и т.д.) и внутренних (цирканнуалвные ритмы ней-ромедиаторов, пептидов, гормонов) факторов (Buck, Barnes, 2000; Storey, 2004).
Зимняя спячка мелких грызунов представляет собой чередование состояния торпидности и бодрствования. Резкие изменения метаболизма в цикле пробуждение - повторное засвшание создают условия для генерации АФК (Toien et al., 2001), в то же время до конца не ввіяснена роль этих процессов в окислении важнейших биомолекул. В связи с этим нами была исследована интенсивность окислительной модификации плазменных белков, а также активность антиоксиданте в у сусликов в динамике зимней спячки. В торпидном состоянии значительно снижается скорость всех процессов в организме: дыхание сокращается от 100-200 до 4-6 дыхательных движений/мин, частота сердцебиений падает от нормальных 200-300 до 3-5 уд/мин (Carey et al., 2003; Storey, 2004), кровяное давление снижается от 130/80 мм. рт. ст. до 90-30 мм. рт. ст. (Wang, Lee, 1996). Во время торпидного состояния замедляются и синтетические процессы, и процессы деградации. Так, по нашим данным, содержание белка в плазме крови сусликов снижалось по мере увеличения продолжительности зимней спячки. Содержание среди ем олекулярных пептидов - маркеров деградации окисленных белков снижалось в динамике зимней спячки, но увеличивалось к весеннему выходу из спячки и достигало максимальных значений. Вместе с этим следует отметить, что при гибернации сохраняется активная регуляция дыхания митохондрий и возможность его усиления в случае выхода температуры тела за пределы зоны комфорта спячки (Buck, Barnes, 2000; Hashimoto et al,, 2002), что обуславливает возможность генерации АФК и в торпидном состоянии. Поскольку скорость свободнорадикаль-ных процессов слабо зависит от температуры (Белоус, Бондаренко, 1982), то образование АФК даже во время глубокой спячки представляет опасность для важнейших биомолекул клетки. Как показали полученные нами данные, по мере углубления зимней спячки содержание карбонильных групп в плазменных белках сусликов увеличивалось, однако перед весенним выходом из спячки количество карбонильных групп в белках оказывалось ниже контрольных значений. Несмотря на потенциальную возможность активации процессов образования АФК, в тканях зимоспящих животных не возникают патологические изменения (Frerichs et al., 1994; Frerichs, Hallenbeck, 1998). Следовательно, в организме зимоспящих животных существуют защитные механизмы, направленные на устранение негативных эффектов АФК. Как показали наши данные, важную роль в защите организма от окислительного стресса играют низкомолекулярные гидрофильные антиоксидан-ты. Накопление гидрофильных антиоксидантов происходит ещё осенью при подготовке к зимней спячке. Особенно важен для организма процесс перераспределения и накопления аскорбата, синтез которого осуществляется только в печени, а защитная роль выявлена во всех тканях (Rice, 2000; Toien et al., 2001). Изменение активности гидрофильных антиоксидантов по мере углубления зимней спячки (рис. 16) коррелирует с изменением содержания карбонильных групп в белках плазмы крови сусликов (г = 0,91, р = 0,012), что указывает на их защитную функцию по отношению к белкам плазмы крови. Кроме того, окисленные белки сами способны выступать в качестве источника свободных радикалов и истощать запасы клеточных антиоксидантов, та 93 ких как аскорбиновая кислота и глутатитон (Губский и др., 2005). % 1 Дополнительную защиту тканей при гибернации обеспечивает катала-за. Зимняя спячка сопровождается ацидозом (Desagher et al., 1996; Hochachka, Somero, 2002). Дыхательный ацидоз, возникающий в результате задержки выведения СОа в тканях в торпидном состоянии, во время пробуждения животного сменяется на ацидоз, вызванный накоплением молочной кислоты (Frerichs et al., 1994; Frerichs, Hallenbeck, 1998). Закисление среды может привести к высвобождению металлов переменной валентности, которые могут участвовать в реакциях Фентона и Хабера-Вейса, приводя к образованию ОН (Hermes-Lima, Zenteno-Savin, 2002; Rice, 2002). Кроме этого, при гибернации, особенно в ходе пробуждения, активируются пути, приводящие к образованию Н202 (Drew et al., 1999). Нейтрализация Н2Ог каталазой позволяет избежать образования самого реакционноспособного гидроксильного радикала. Активность же супероксиддисмутазы в первые месяцы зимней спячки оказывается сниженной, что, возможно, обусловлено снижением генерации супероксидного радикала при транспорте кислорода гемоглобином (Misra, Fridovich, 1972). Динамика изменения активности СОД по мере углубления зимней спячки может быть связана с конформационными изменениями в молекуле фермента под действием оксидантов. Длительность периодов торпидности, или баутов спячки, меняется в динамике зимней спячки: в начале и в конце спячки продолжительность бау-та меньше, чем в середине гибернации. Вход в баут спячки и выход из него являются критическими периодами для гибернирующих животных.
В торпидном состоянии у спящих животных замедляются не только процессы синтеза, но и процессы деградации различных веществ. Так, согласно нашим данным, при входе в баут после очередного спонтанного пробуждения снижается и содержание белка, и содержание СМП - маркеров протеолиза белков. В то время как межбаутное пробуждение приводит к росту содержания и белка, и СМП. Процессы синтеза белка в состоянии оцепенения замедляются за счёт дезагрегации полисом (Жегунов и др., 1993; Van Breukelen, Martin, 2001), а также подавления процессов трансляции (Zhegunov et al, 1988) и снижения активности рибосомальных белков (Frerichs et al, 1998).
