Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Активные формы кислорода. Основные источники их генерации в организме 10
1.2. Биологическая и токсическая роль активных форм кислорода 15
1.3. Антиоксидантная система плазмы крови организма 18
1.4. Окислительная модификация белков 25
1.5. Окислительный стресс и токсическое действие АФК 31
1.6. Окислительный стресс и особенности антиоксидантной защиты в нервной ткани 34
1.7. Метаболические процессы в мозговой ткани при старении 38
1.8. Нейродегенеративные расстройства в старческом возрасте 43
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 47
1. Исследование прооксидантной системы организма 48
1.1. Окислительная модификация белков плазмы крови 48
1.2. Методика определения железо-зависимого образования битирозина и окисления триптофана в плазме крови 50
1.3. Анализ надосадочной жидкости 52
1.4. Электрофорез 52
2. Исследование антиоксидантного статуса организма 52
2.1. Определение ферментативной и неферментативной способности плазмы и эритроцитов крови к дисмутации Ог 52
2.2. Определение способности плазмы и эритроцитов к расщеплению Н202 57
2.3. Определение активности глутатионпероксидазы с использованием гидроперекиси трет-бутила 60
2.4. Определение активности глутатионредуктазы 63
-3-
2.5. Определение восстановленного и окисленного глутатиона 64
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 67
1. Прооксидантная система организма 67
1.1. Спонтанная окислительная модификация белков 67
1.2. Металл-катализируемое окисление белков 68
1.3. Спектрофлуориметрическая регистрация окисления триптофана
и образования битирозина 70
1.4. Анализ надосадочной жидкости окисленных белков 72
1.5. Электрофорез 76
2. Антиоксидантная система организма 79
2.1. Общая (ферментативная и неферментативная) способность плазмы крови к дисмутации 02* 79
2.2. Ферментативное и неферментативное расщепление Н202 в плазме крови 80
2.3. Определение активности супероксиддисмутазы эритроцитов крови...88
2.4. Определение активности каталазы эритроцитов крови 88
2.5. Определение активности компонентов глутатионового цикла в крови 90
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 98
ВЫВОДЫ 110
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112
- Активные формы кислорода. Основные источники их генерации в организме
- Исследование прооксидантной системы организма
- Прооксидантная система организма
Введение к работе
Актуальность проблемы исследования.
Процессы метаболизма кислорода в организме связаны с образованием активных кислородных соединений, обладающих выраженной реакционной способностью, к которым относятся: 02 , Н2О2, ОН. В нормально функционирующем организме количество генерируемых оксидантов, необходимое для жизненно важных биологических процессов в клетке, регулируется антиоксидантной системой (АОС). Избыток образующихся реакционных молекул оказывает токсическое влияние, которое проявляется в окислении белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот.
Старение организма связывают с нарастанием молекулярных повреждений мембран и генетического аппарата клетки, вызванных свободными радикалами и снижением функций защитных механизмов. В настоящее время проведено большое количество экспериментальных исследований на животных, подтверждающих свободнорадикальную теорию старения, впервые выдвинутую Харманом Д. [103, 104, 105]. В экспериментах на животных показано, что с возрастом увеличивается скорость пероксидации белков, липидов, нуклеиновых кислот, что является причиной необратимых повреждений тканей, в частности, нервной ткани. Установлена связь процессов старения и окислительнолй модификации белков в экспериментах на эритроцитах, фибробластах и гепатоцитах [55, 162, 164].
В последнее время активно обсуждаются механизмы окисления белков (спонтанного и металл-катализируемого) на модельных системах и в тканях. Окисление белков является более надежным маркером окислительных повреждений по сравнению с окислением липидов, так как образование карбонильных производных происходит быстрее, и они являются более стабильными [135]. Окислительная модификация белков - один из ранних индикаторов поражения тканей при свободнорадикальной патологии. В процессе старения организма повышается чувствительность многих белков к окислению и накоплению в тканях их окисленных форм. Известно, что количество окисляющихся белков в клетке обусловлено генетически, и является ее постоянной фенотипической характеристикой.
Старение организма и развитие нейродегенеративных изменений протекает на фоне окислительного стресса (ОС) [157, 161, 170]. Окислительный стресс характеризуется нарушением баланса анти- и прооксидантной систем в сторону повышения последней, что выражается в избыточном образовании свободных радикалов и отсутствии мобилизации АОС, а также нарушении сбалансированности защитных компонентов [119]. В настоящее время в литературе активно обсуждается роль ОС в развитии различных нейродегенеративных заболеваний в старческом возрасте: при амиотрофическом латеральном склерозе, параличе, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера [19, 20, 42, 53, 77]. Не исключено, что ОС может являться одним из патогенетических факторов, определяющих вероятность развития сосудистой деменции. Однако, до настоящего времени вопросы комплексного анализа про- и антиоксидантной систем человека в процессе старения остаются малоизученными, а роль ОС в развитии сосудистой деменции в литературе практически не освещена. Поэтому исследование интенсивности ОС по состоянию АОС и металл-зависимой окислительной деструкции белков плазмы крови при нейродегенеративных изменениях у больных старческого возраста, является одним из актуальных вопросов современной биологии и медицины.
Цель и задачи исследования.
Целью данного исследования являлось изучение интенсивности ОС с использованием комплекса биохимических показателей крови, отражающих состояние АОС и степень окислительной модификации белка, у пожилых людей в процессе старения и при развитии сосудистой деменции.
Выполнение поставленной цели достигалось решением следующих задач:
1. Исследовать состояние прооксидантной системы на примере спонтанного и металл-катализируемого окисления (МКО) белков в нативной плазме, используя метод определения карбонильных производных аминокислотных остатков и по степени окисления триптофана и тирозина у людей среднего возраста и пожилых с и без психических расстройств.
2. Определить характер изменения структуры (агрегация, фрагментация) окисленных белков плазмы крови во всех исследуемых группах людей с помощью электрофореза и по уровню образования кислоторастворимых низкомолекулярных пептидов в надосадочной жидкости.
3. Исследовать состояние АОС по активности ее ферментативных и неферментативных компонентов, направленных на дисмутацию ( и разрушение Н202 в эритроцитах и плазме крови у исследуемых групп людей.
Провести исследование одного из основных звеньев антиоксидантной защиты - компонентов глутатионового цикла (глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, окисленного и восстановленного глутатиона) в плазме и эритроцитах крови пожилых людей с и без психических расстройств и у доноров.
Провести сравнительный анализ состояния анти- и прооксидантной систем с целью оценки ОС в процессе старения организма и при развитии сосудистой деменции. Показать значение комплексного исследования биохимических показателей крови человека, характеризующих интенсивность свободно-радикальных процессов, для прогнозирования и профилактики сосудистой деменции.
Научная новизна исследования.
Впервые был проведен всесторонний анализ интенсивности окислительной деструкции белков плазмы крови, позволяющий судить об изменениях не только их первичной структуры, но и об их пространственной ориентации (по агрегации и фрагментации) у пожилых людей с и без психических расстройств.
Впервые выявлена корреляционная зависимость между металл-катализируемой окислительной модификацией белков и степенью нейродегенеративных нарушений мозга при сосудистой деменции у больных старческого возраста. Низкий уровень карбонильных производных белков плазмы крови рассматривается в качестве «специфического маркера» степени сосудистой деменции.
Впервые проведено комплексное исследование основных показателей антиоксидантной системы (ферментативная и неферментативная дисмутация О2 , ферментативное и неферментативное расщепление Н2О2), включая глутатионовый цикл, с использованием биологического материала - плазмы и эритроцитов крови здоровых людей в возрасте 30-40 лет, здоровых пожилых людей и больных с разной степенью деменции, позволяющее характеризовать состояние АОС в процессе старения организма и выяснить и при развитии сосудистой деменции).
Впервые показано нарушение в соотношении активностей компонентов глутатионовой системы (глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза) у пожилых людей с сосудистой деменцией. Выявлена корреляционная зависимость между активностью глутатионредуктазы и степенью выраженности сосудистой деменции.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Сравнительный анализ про- и антиоксидантной систем является основной характеристикой ОС, позволяющей оценить его интенсивность в процессе старения и при развитии различных патологических состояний у людей среднего возраста и пожилых людей.
2. Окислительная модификация белков (спонтанная и металл- катализируемая) отражает деструктивные изменения организма, связанные с окислительным стрессом, у пожилых людей с и без деменции. Интенсивность металл-зависимого окисления белков является «специфическим маркером» степени нейродегенеративных изменений при сосудистой деменции.
Научно-практическая значимость.
Разработан комплекс биохимических показателей крови, отражающих состояние про- и антиоксидантной систем, для оценки степени выраженности ОС у пожилых людей и пациентов с разной степенью сосудистой деменции. Данные проведенного комплексного исследования вносят существенный вклад в дальнейшее изучение окислительного стресса и обоснование его роли в процессах старения и развития характерных старческих заболеваний. Показатели интенсивности МКО белков плазмы крови и степени выраженности дисбаланса в глутатионовой системе, в частности, повышение активности глутатионредуктазы могут быть использованы в клинической практике для прогнозирования течения сосудистой деменции, а также в качестве маркеров степени выраженности этого заболевания у больных старческого возраста. Полученные результаты могут быть использованы в учебных целях и учтены при разработке критериев прогнозирования и профилактики деменции у людей пожилого возраста.
Апробация работы.
Положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийских и международных конференциях: VIII Biennial Meeting International Society for Free Radical Research (Барселона, Испания, 1 -5 октября 1996); на конференции, посвященной 150-летию клинического отдела ВМА "Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения" (7-8 апреля Санкт-Петербург, 1997); на II съезде биохимического общества РАН (19-23 мая Москва, 1997); 13th Congress of Pathological and Clinical Physiology (Брно, 1998); UNESCO Society for Free Radical Research (Europe) Regulation of Biological Processes by Free Radicals: Role of Antioxidants, Free Radical Scavengers and Chelators (Россия, Москва -Ярославль, 10-13 мая 1998); International Conference on "Superoxide Dismutases: Recent Advances and Clinical Applications" на международной конференции (Франция, Париж, Институт Пастера, 14-15 мая, 1998); Second Internat.Conference on Natural Antioxidants and Anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease (Финляндия, Хельсинки, 24-27 июня 1998); на научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им.акад. И.П. Павлова. «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии» (Россия, Санкт-Петербург, 15-17 октября, 1998); на международной конференции «Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Россия, Санкт-Петербург, 8-10 сентября 1999).
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы 1 - обзор литературы, главы 2 - материалы и методы исследования, главы 3 - результаты собственных исследований, главы 4 - обсуждение результатов, выводы, научно-практических рекомендаций и списка литературы, который включает в себя 38 отечественных и 145 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 9 таблицами.
Активные формы кислорода. Основные источники их генерации в организме
Процессы метаболизма кислорода в организме связаны с образованием активных форм кислорода (АФК), обладающих выраженной реакционной способностью. "Активные формы кислорода" - это понятие собирательное, объединяющие такие соединения, как молекулы - Н2О2, ионы - Н02", свободные радикалы - ОН2, НО , ион-радикалы - 02 , синглетный кислород Общим для всех этих соединений является их высокая реакционная способность и то, что родоначальником их является кислород.
Кислород в основном состоянии - бирадикал, два неспаренных электрона которого с параллельными спинами располагаются на разрыхляющих молекулярных тс-орбиталях. Наличие двух неспаренных электронов с параллельными спинами существенно ограничивает реакционную способность кислорода [21, 35, 37]. Молекулярный кислород, для участия в биохимических реакциях, должен активироваться, то есть восстановиться. В живых системах в процессе эволюции выработались специализированные ферментативные системы восстановления молекулярного кислорода посредством переноса на него одного, двух или четырех электронов [100, 139]. В процессе биологического окисления по ходу ферментативных или спонтанных реакций аутоокисления субстратов может происходить постепенное восстановление кислорода с образованием его радикальных продуктов. Полное восстановление кислорода происходит в процессе тканевого дыхания в митохондриях.
Присоединение одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии приводит к образованию супероксидного анион-радикала (02"), который при взаимодействии с протоном переходит в гидроперекисный радикал (Н02) представляющий собой слабую кислоту [21, 97]. Супероксидный анион-радикал обладает наименьшей реакционной способностью и во многих биологических системах выступает в качестве донора электронов, восстанавливая ряд соединений [84, 85, 96]. Но, все же, 02 является более сильным окислителем, чем кислород, и может непосредственно реагировать с незаменимыми полиненасыщенными жирными кислотами (линолевой, линоленовой и арахидоновой), входящими в состав клеточных мембран, образуя гидроперекисные соединения [82, 83], инициировать пероксидацию липопротеинов низкой плотности [37]. Проникновение 02" через мембрану затруднено и требует наличия анионных каналов, которые обнаружены пока в эритроцитарной мембране [176]. Хотя не исключено, что такого типа каналы могут существовать в эндотелиальных клетках сосудов.
Исследование прооксидантной системы организма
Метод оценки окислительной модификации белков Р. Левина [116] основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрируют спектрофотометрически.
Этот метод является особенно информативным при анализе металл-катализируемого окисления белков.
Для исследования окислительной модификации белков плазмы крови по уровню карбонильных производных методом Р. Левина в модификации Е. Дубининой с соавторами [16] требовались следующие реактивы:
1. Фосфатный буфер 1/15 М (рН 7,4) (для приготовления буфера использовались: КН2Р04; Na2HP04 х 2Н20)
2. FeS04 4хЮ"3М
3. ЭДТА 1x10"3 М ("Reanal" Венгрия)
4. Перекись водорода ЗхЮ М
5. 2,4ДНФГ 0,01М(растворяютв2ЫНС1)
6. НС1 2N
7. ТХУ 20%
8. Этиловый спирт и этилацетат в соотношении 1:1
9. Мочевина 8 М
Ход анализа:
Для анализа использовали плазму крови, разбавленную физиологическим раствором в соотношении 1:10. Спонтанная и металл-зависимая окислительная модификация белков анализировались одновременно. Для каждой пробы использовали свой контроль.
При анализе спонтанной окислительной модификации белков контрольная и опытная пробы содержали: 0,05 мл подготовленной плазмы и 0,95 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 7,4). При проведении МКО белков в контрольную и опытную пробы к 0,05 мл подготовленной плазмы приливали 0,75 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 7,4), 0,1 мл смеси 4x10"3 М FeS04 и 1x10"3 М ЭДТА (1:1) и 0,1 мл 3x10"4 М Н202. Общий объем каждой пробы был 1,0 мл. После 15-минутной инкубации при t=37C на водяной бане в опытные пробы приливали по 1,0 мл 0,01 М 2,4ДНФГ, растворенного в 2 N НС1. В контрольные пробы вместо 2,4ДНФГ добавляли равный объем 2 N НС1. Для осаждения белков в каждую пробу вносили 1 мл 20% ТХУ. Пробы инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут. Далее осадок 2 раза промывали смесью этилового спирта и этилацетата (1:1). При этом происходила экстракция липидов и 2,4ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Полученный осадок подсушивали на воздухе, а затем растворяли в 8 М растворе мочевины. Мочевину приливали к осадку в объеме 3,0 мл. Для лучшего растворения осадка добавляли одну каплю 2 N НС1.
В результате окислительной модификации белков наблюдалось появление карбонильных производных, которые в присутствии 2,4ДНФГ образовывали 2,4-динитрофенилгидразоны. Оптическую плотность образовавшихся 2,4-динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре СФ-46 при длинах волн: А, 274 нм и X 363 нм. Уровень окисленной модификации белков выражали в единицах оптической плотности, отнесенных на 1 г белка или мл плазмы.
Прооксидантная система организма
При анализе спонтанной окислительной модификации белков (ОМБ) были получены следующие результаты. Статистически достоверные различия при длине волны X 270 нм выявлены только между группами здоровых людей среднего возраста и группой пожилых людей с психическими расстройствами. Уровень карбонильных группировок возрастает в группе пожилых людей с сосудистой деменцией при расчете на 1 мл плазмы крови и на 1 мг белка соответственно. Разделение больных на группы в зависимости от степени тяжести заболевания показало, что повышение ОМБ сохраняется только на начальных стадиях психоорганического синдрома, но полученные значения не достоверны.
Данные, полученные при общепринятой длине волны А, 363 нм, не обнаружили никаких различий во всех обследованных группах: уровень образовавшихся 2,4-динитрофенилгидразонов плазмы крови у пожилых людей с и без деменции не отличался от такового у здоровых людей 30-40 лет. В группах с разной степенью деменции также не было выявлено никаких различий в уровне образования карбонильных производных в зависимости от тяжести заболевания. (Табл.1)
Металл-катализируемое окисление белков.
Статистически достоверные изменения при обеих длинах волн были выявлены при анализе металл-катализируемого окисления (МКО) белков плазмы крови.
При длине волны X 270 нм зарегистировано статистически достоверное повышение продуктов МКО белков в группах пожилых людей с сосудистой деменцией и без по сравнению с контрольной группой людей среднего возраста при расчете на 1 мл плазмы и 1 мг белка. В группе пожилых людей с деменцией показано достоверное снижение продуктов МКО белков плазмы по сравнению с пожилыми здоровыми при расчете на мл плазмы и на мг белка.
В группах с разными степенями сосудистой деменции не было обнаружено каких-либо достоверных различий в уровне образования 2,4-динитрофенилгидразонов плазмы крови в зависимости от стадии заболевания.
Сравнительный анализ данных, полученных при длине волны А, 363 нм, также выявил статистически достоверное повышение уровня образовавшихся 2,4-динитрофенилгидразонов в группах пожилых людей с деменцией и без по отношению к группе здоровых людей среднего возраста при расчете на мл плазмы и на мг белка. В группе пожилых людей с деменцией отмечено достоверное снижение продуктов МКО белков плазмы крови по сравнению с пожилыми людьми без психических расстройств.
