Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. CLASS Обзор литератур CLASS ы
1.1. Активные формы кислорода и механизмы окислительной модификации белков 10
1.2. Интенсификация свободно-радикального окисления при низких температурах тела и его химическая коррекция 33
ГЛАВА И. Экспериментальная часть
2.1. Обоснование выбора объекта исследования 43
2.2. Постановка экспериментов 43
2.2.1. Искусственное охлаждение животных 43
2.3. Методика инъекций животным 44
2.4. Препаративные методы исследования 44
2.4Л. Получение плазмы и сыворотки крови 44
2.4.2. Получение гемолизатов 45
2.5. Биохимические методы исследования 45
2.5.1. Определение окислительной модификации белков в плазме крови 45
2.5.2. Определение содержания среднемолекулярных пептидов в плазме крови 47
2.5.3. Определение активности супероксиддисмутазы в эриротроцитах 48
2.5-4. Определение активности каталазы в эритроцитах 49
2.5.5. Определение содержания гемоглобина 50
2.5.6. Амперометрический метод определения низкомолекулярных и белковых сульфгидрильных групп 50
2.5.7. Определение дисульфидных связей в белках и низкомолекулярных соединениях крови 52
2.5.8. Электрофоретическое разделение белков плазмы крови 53
Статистическая обработка материала 56
ГЛАВА III. Результаты эксперимента и их обсуждение
3.1. Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина 57
3.2.0кислительно-восстановительное состояние тиоловых групп белков и низкомолекулярных соединений плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина 65
3.3. Электрофоретическое разделение белков плазмы крови при гипотермии и введении даларгина 73
3.4. Содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови при гипотермии и на фоне введения даларгина 78
3.5. Активность СОД при гипотермии и введении даларгина 84
3.6. Активность каталазы при гипотермии и введении даларгина 88
Заключение 91
Выводы 111
Литература 113
- Интенсификация свободно-радикального окисления при низких температурах тела и его химическая коррекция
- Определение активности супероксиддисмутазы в эриротроцитах
- Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина
- Содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови при гипотермии и на фоне введения даларгина
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в различных областях медицины, таких как хирургия, психиатрия, терапия, и в экспериментальной биологии широкое применение нашел метод искусственного снижения температуры тела (Мешалкин, Верещагин, 1985; Эмирбеков, Львова, 1985; Ба-бийчук и др., 1990). Защитным эффектом гипотермии является понижение функций и обменных процессов, приводящих к повышению устойчивости организма к воздействию многих неблагоприятных факторов и, прежде всего тканевой гипоксии, обычно сопутствующих различным видам патологии (Эмирбеков, Львова, 1985; Lei et al., 1994; Ooboshi, et al., 2000).
Как известно, под действием низкой температуры тела и на начальных этапах гипотермии, активируется деятельность организма, повышаются энергозатраты, что стимулирует главный поставляющий энергию процесс - дыхание (Кулинский, Ольховский, 1992; Чуйкин, Вовенко, 1993; Алюхин, 1994). Активация дыхания увеличивает поток электронов по дыхательной цепи - от субстратов дыхания к кислороду, что неизбежно влечет за собой повышение продукции активных форм кислорода (Скулачев, 1998; Cadenas, Davies, 2000).
Усиленное образование активных форм кислорода (АФК) имеет место в начальный период гипотермии гомойотермов, когда температура тела падает на несколько градусов. Об этом свидетельствуют данные по активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) различных тканей при умеренной гипотермии (Василькова, 1988; Львова и др., 1993). Эти исследователи отметили важную роль активации процессов ПОЛ в развитии патологии при гипотермии. Вместе с тем установлено, что под действием АФК окисляются в первую очередь не липиды, а аминокислотные остатки белков, приводящие к их окислительной модификации (Davies, 1987; Дубинина, Шу-
галей, 1993). Интенсивность окислительной модификации белков при гипотермии почти не изучена, а, следовательно, не установлена роль этих процессов в развитии гипотермической патологии. Существуют единичные данные, свидетельствующие об активации окислительной модификации белков (ОМБ) при гипотермии (Халдун, 1998). Однако для оценки роли процессов ОМБ в развитии гипотермических патологии необходимо выяснить, каковы механизмы этих процессов и как они зависят от температуры тела.
Установлено, что синтетический опиоидный пептид, аналог лей-энкефалина, даларгин способен снижать интенсивность процессов ПОЛ при различных стрессорных состояниях. Так, при эмоционально-болевом стрессе введение даларгина заметно понижало процессы ПОЛ в миокарде (Лишма-нов и др., 1991) и в клетках печени (Шлозников и др., 1990; Короткина и др., 1992). И в условиях гипотермии введение даларгина способствует снижению интенсивности процессов ПОЛ в различных тканях (Львова и др., 1993). В связи с вышеизложенным представляется важным изучение возможности регуляции ОМБ плазмы крови даларгином при гипотермии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение зависимости интенсивности свободно-радикального окисления белков плазмы крови и активности антиоксидантных ферментов эритроцитов от глубины и длительности гипотермии, а также возможности коррекции, обнаруженных изменений, путем парентерального введения опиоидного гекса-пептида - даларгина.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови крыс по анализу карбонильных и тиоловых групп;
Исследовать содержание среднемолекулярных пептидов (СМП) в плазме крови;
Анализировать белковый спектр плазмы крови;
Исследовать состояние антиоксидантных ферментов по анализу ак-
тивности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Основные положения., выносимые на защиту.
Установлено, что кратковременная, и особенно пролонгированная 3 ч гипотермия 30 С существенно стимулирует процессы окислительной модификации белков плазмы крови крыс. Пролонгированная 3 ч гипотермия 30С увеличивает также окисляемость плазменных белков. Глубокая гипотермия снижает интенсивность ОМБ плазмы крови. Повышение степени ОМБ стимулирует их деградацию и накопление среднемолекулярных пептидов.
Электрофоретический анализ белков и исследование СМП свидетельствует о том, что гипотермия 30С способствует как агрегации, так и фрагментации плазменных белков.
Интенсификация свободно-радикальных процессов в крови существенно активирует СОД в эритроцитах, но не влияет на активность каталазы.
4. Опиоидный гексапептид даларгин при предварительном внутри-
брюшинном введении оказывает защитный эффект при гипотермии 30С. Это
выражается в снижении ОМБ, нормализации спектра белков плазмы крови,
снижении содержания СМП. Однако при пролонгировании 3 ч гипотермии
30С и гипотермии 20С даларгин не оказывает защитное влияние.
Научная новизна. В настоящей работе впервые проведены систематические исследования интенсивности процессов окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермии.
Установлено, что интенсивность процессов СРО белков зависит от уровня и длительности гипотермии. Умеренная кратковременная и пролонгированная 3 ч гипотермия существенно увеличивает окислительную деструкцию плазменных белков. Выявлена корреляция между интенсивностью ОМБ и содержанием в крови среднемолекулярных пептидов при гипотермии.
Обнаружено, что умеренная гипотермия и её пролонгирование способствует активации СОД крови. При этом активность каталазы остается на
уровне контроля.
Установлено зависимое от температуры изменение содержания сульф-гидрильных и дисульфидных групп в плазме крови в динамике гипотермии.
Установлено, что гипотермия 30С существенно изменяет электрофо-ретическую подвижность белков плазмы крови, способствует их агрегации и фрагментации.
Выявлена возможность коррекции процессов ОМБ плазмы крови на начальных этапах гипотермии путем предварительного внутрибрюшинного введения даларгина.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные а работе данные представляют интерес для понимания молекулярных механизмов холодового повреждения и формирования компенсаторно-приспособительных реакций при снижении температуры тела гомойотермов. Практическая значимость данной работы определяется перспективностью использования ряда изученных показателей крови для оценки состояния организма при различных уровнях гипотермии и её пролонгировании. Результаты работы указывают на возможность применения даларгина в качестве препарата, участвующего в регуляции свободно-радикальных процессов в крови на начальных этапах гипотермии.
Материалы, полученные при выполнении данной диссертационной работы, используются в учебном процессе, осуществляемом кафедрой биохимии Дагестанского госуниверситета и Махачкалинского филиала Ростовского госуниверситета. Методические элементы работы включены в учебное пособие «Практикум по биохимии» (Ростов-на-Дону, 2001).
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговой научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Дагестанского госуниверситета (Махачкала, 2001), 2-м международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1998), международной конференции, посвящен-
ной 50-летию ДНЦ РАН (Махачкала, 1999), международной конференции «Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), 38-й международной конференции, посвященной 100-летию основателя Сибирского отделения РАН М.А. Лаврентьева (Новосибирск, 2000), Всероссийской научно-практической конференции «Химия в технологии и медицине» (Махачкала, 2001), международном научном семинаре вузов Северо-Кавказского региона «Циклы» (Ставрополь, 2002), 5-й и 6-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2001, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Интенсификация свободно-радикального окисления при низких температурах тела и его химическая коррекция
В настоящее время не вызывает сомнение, что процессы свободно-радикального окисления (СРО) играют важную роль в жизнедеятельности клеток. Это связано с двумя моментами: с одной стороны, реакции СРО являются необходимым этапом различных метаболических процессов, а с другой стороны, повышенная интенсивность СРО во многих случаях является либо следствием, либо причиной тех или иных патологических изменений в клетках и тканях (Зайцева, Закревский, 1998).
Установлено, что при стрессе резко усиливаются процессы СРО (Ме-ерсон, 1981). Охлаждение организма является типичным стрессорным раздражителем, приводящим к активации гилоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (Гурин, 1989; Кулинский, Ольховский, 1992). Интенсивно образующиеся при этом свободные радикалы атакуют важнейшие биомолекулы клетки. Наиболее изучены при воздействии гипотермии процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ).
По данным А.П. Шепелева а П.М. Юфит (Шепелев, Юфит, 1974; Шепелев, Юфит, 1975) первичной реакцией на кратковременное действие холода (без снижения температуры тела) является повышение содержания гидроперекисей и диеновых конъюгатов в липидах миокарда, скелетных мышцах, головного мозга и снижение их уровня в печени. Длительное же воздействие холода приводит к дальнейшей активации процессов ПОЛ в различных тканях (Куликов и др., 1988). Е.А. Бородин с сотр. (Бородин и др., 1992) обнаружили, что при ежедневном воздействии холода (-15С) на крыс в течение 3 часов на протяжении от 7 суток до 3 месяцев в мембранах эритроцитов уровень продуктов ПОЛ изменяется с определенной цикличностью: содержание диеновых конъюгатов и гидроперекисей липидов увеличивается к концу первой, а МДА - к концу второй недели, все показатели снижаются к концу третьей и повторно увеличиваются к концу четвертой недели действия холода, С данными, полученными авторами, на эритроцитах, согласуются результаты измерения содержания продуктов ПОЛ в легких, печени и сердце, причем изменения в большей степени выражены в легких и значительно меньше - в сердце.
Таким образом, при воздействии холода на организм процессы перок-сидации липидов усиливаются, при чем при длительном воздействии холода уровень ПОЛ изменяется циклично.
Иная динамика процессов ПОЛ в тканях наблюдается в случае снижения температуры тела гомоиотермов. Анализ интенсивности процессов ПОЛ в головном мозге крыс в динамике гипотермии показал усиление их интенсивности при умеренной (30С) гипотермии и последующее снижение при более низкой (20С) температуре тела (Эмирбеков и др., 1991; Эмирбеков и др., 1995). Инкубация проб в течение 30 минут при 37С гомогенатов мозга животных приводила к увеличению ПОЛ на всех этапах гипотермии. Значительная интенсификация ПОЛ в мозге наблюдалась при пролонгировании (1 и 3 часа) умеренной гипотермии (Львова и др., 1993). СП. Львова с сотр. (1993) обнаружили в печени крыс при умеренной (30С) гипотермии небольшое повышение МДА, а в икроножной мышце — достоверное снижение (в 2 раза) содержания МДА. В то же время АЛ. Шкестерс с сотр. (Шкестерс и др., 1991) обнаружили ингибирующее влияние умеренной гипотермии на процессы ПОЛ в миокарде. По их данным содержание МДА в миокарде крыс при гипотермии 30С снижается более чем на 30%. При дальнейшем снижении температуры тела (20С) содержание МДА повышается до исходного уровня.
А.П. Шепелев и П.М. Юфит (Шепелев, Юфит, 1975; Шепелев, 1978) обнаружили, что в случае снижения температуры тела у собак до 28С и у крыс до 18DC интенсивность ПОЛ в исследуемых тканях (миокарде, скелетных мышцах) снижалась, кроме головного мозга. При атональной гипотермии, у собак (15-18С) и у крыс (9-И С) активность ПОЛ возрастала ещё в большей степени в мозге, а также увеличивалась в печени, легких, миокарде.
Интенсивность процессов ПОЛ в крови крыс в динамике гипотермии была исследована Т.В. Васильковой с сотрудниками (Василькова, Кухта, 1988; Василькова, 1988; Василькова и др., 1990). По результатам этих работ выяснилось, что в эритроцитах крыс содержание диеновых конъюгатов возрастает на начальном этапе действия низкой температуры (33-34С), резко увеличивается при дальнейшем снижении температуры тела (24-25 С) и возвращается к исходному уровню при глубокой (15-16 С) гипотермии. При этом содержание МДА в эритроцитах на всех этапах гипотермии остаётся без изменений. Повышение содержания диеновых конъюгатов в мембранах эритроцитов крыс при гипотермии было обнаружено также А.А. Линчевской, Л.А. Кондратьевой (1989).
При глубокой гипотермии происходит активация процессов ПОЛ и в плазме крови крыс (Утно и др,, 1989).
Гипотермия помимо процессов ПОЛ стимулирует также процессы окислительной модификации белков. У.А. Халдун (1998) установил, что при умеренной гипотермии содержание карбонильных групп в сывороточных белках возрастает на 51%. С углублением гипотермии повышенный на предыдущем этапе уровень карбонильных групп снижается, но остается на 22% выше контроля. Однако нет данных об интенсивности процессов ОМБ плазмы крови при пролонгированных формах гипотермии. Кроме того, не исследована скорость окисления белков в присутствии прооксидантов и изменение этих процессов при гипотермии.
В соответствии с фазовыми изменениями интенсивности ПОЛ и ОМБ в динамике гипотермии изменяется и активность ключевых антиоксидантных ферментов. Максимальная интенсификация ПОЛ и ОМБ при гипотермии 30 С приводит к повышению антиокислительной активности (АОА) плазмы, а дальнейшее снижение окислительных процессов при гипотермии 20С сопровождается снижением активности компонентов антиокислительной активности крови (Кличханов, 2001). Оказалось, что при умеренной гипотермии повышается в основном активность гидрофильных антиоксидантов. Это, очевидно, связано с возрастанием количества глутатиона (Бекбосынова, Долгова, 1983), цистеина и аргинина (Абдуллаев, 1982) в сыворотке крови.
Наряду с антиоксидантами в регуляции уровня АФК в тканях играют антиоксидантные ферменты. В этой связи были исследованы активность ключевых антиоксидантных ферментов в тканях при гипотермии. По данным Т.У. Васильковой (Василькова, 1988; Василькова, Кухта, 1988; Василькова и др., 1990) в эритроцитах крови крыс активность СОД, каталазы, глутатион-пероксидазы, глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы достоверно возрастает при гипотермии 33-34С, значительно снижается при гипотермии 24-25С и частично возвращается к контрольному уровню при глубокой (15-16С) гипотермии. Подобная закономерность для каталазы крови крыс была обнаружена З.Я. Долговой (1981) при гипотермии 30С и 20С.
В отличие от эритроцитов, в печени крыс, подвергнутых острому (глубокому (18-19 С)) охлаждению, существенно возрастает активность глутати-онпероксидазы и каталазы, активность глутатионредуктазы увеличивается в меньшей степени (Шепелев, Костромина, 1979). Активность СОД при этом практически не отличалась от показателей у контрольных животных.
Определение активности супероксиддисмутазы в эриротроцитах
Об активности супероксиддисмутазы (СОД) судили по ее способности ингибировать процесс восстановления тетразолиевого нитросинего (ТНС) и феназинметасульфата (ФМС) в условиях генерации супероксидного анион-радикала (Fried, 1975; Дубинина и др., 1988).
Перед опытом исходный 10%-ный гемолизат разбавляли до 1%-го и использовали для определения активности СОД.
Для осаждения гемоглобина и частичной очистки СОД к 1 мл разбавленного гемолизата добавляли 0,3 мл 96% этанола и 0,15 мл хлороформа. Смесь перемешивали на магнитной мешалке на холоду (2-4С) 15 мин, затем столько же времени оставляли на холоду, периодически встряхивая. Хлоро-форм-этанольную смесь центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин, отбирали верхний слой и использовали в качестве источника фермента.
Непосредственно перед определением активности фермента готовили инкубационную смесь следующего состава: 1 мл 26,9 мкМ ЭДТА, 1 мл 4,04 мМ ТНС, 1 мл 65 мкМ ФМС, 1 мг желатина, 26 мл 1/15 фосфатного буфера (рН 7,8).
В пробирки разливали по 2,85 мл инкубационной смеси и прогревали их 5 мин при 25С. Затем добавляли 0,1 мл супернатанта и 0,1 мл 1мМ НАД Н. В контрольную пробу вместо супернатанта вносили 0,05 мл фосфатного буфера. Инкубацию проводили в течение 10 мин в термостате при 25 С в аэробных условиях в темноте. Реакцию останавливали освещением проб. Оптическую плотность проб измеряли при 540 нм против смеси, содержащей все компоненты инкубационной среды, кроме НАД-Н.
Процесс ингибирования скорости восстановления ТНС (Т, %) СОД, рассчитывали по формуле:
Т = ((ЕК-ЕОП)/ЕК)-100%, где Ек и Еоп - экстинкции контрольной и опытной проб.
За одну условную единицу активности СОД принимали 50%-ное торможение процесса восстановления ТНС за время инкубации.
Активность фермента выражали в условных единицах на мг гемоглобина:
Аед/мг нь = (20 Т%) / ((100 - Т%) С),
где 20 - кратность разведения гемолизата; С - концентрация гемоглобина (мг) в 1 мл 1%-иого гемолизата.
Об активности каталазы судили по скорости убыли перекиси водорода в среде инкубации. Концентрацию перекиси водорода определяли по реакции с молибдатом аммония, который дает стойкий окрашенный комплекс (Коро-люки др., 1988).
Перед работой исходный 10%-ный гемолизат разбавляли в 25 раз и использовали в качестве источника фермента.
Реакцию запускали добавлением 0,05 мл разбавленного гемолизата к 2 мл 0,034% Н2О2. В контрольную пробу вместо гемолизата вносили 0,05 мл воды. Пробы инкубировали в течение 2 мин при 25С. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 4% раствора молибдата аммония. Оптическую плотность проб измеряли при 450 нм. Об активности катапазы судили по степени уменьшения экстинкции в опытных пробах (Еоп) по сравнению с контролем (Ек):
где 34 - молекулярная масса Н202; 2 - время инкубации, мин; С - концентрация гемоглобина в пробе, мг; К - коэффициент перевода значений оптической плотности в мг перекиси водорода (рассчитывается по калибровочному графику).
Содержание гемоглобина определяли аммиачным методом (Лопатина и ДР. 1976).
Для определения содержания общего гемоглобина к 4,9 мл 0,04% -го раствора аммиака прибавляли 0,1 мл полученного гемолизата. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 540 нм. Содержание гемоглобина рассчитывали по калибровочному графику.
Содержание тиоловых групп определяли методом амперометрического титрования с использованием азотнокислого серебра (Соколовский, 1962).
Плазма крови. Для определения суммарного (содержащиеся как в белках, так и низкомолекулярных соединениях) количества SH-rpynn к 0,2 мл плазмы добавляли 1 мл 1%-ного раствора додецилсульфата натрия (ДЦС) и выдерживали 5 мин при 37С, периодически перемешивая. Затем общий объем пробы доводили аммиачным буфером до 20 мл и титровали.
При определении содержания тиоловых групп низкомолекулярных соединений к 0,5 мл плазмы добавляли 0,7 мл дистиллированной воды и 0,8 мл 6%-ного сульфосалициловой кислоты. Через 10 мин белки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин. Из надосадочной жидкости отбирали 1 мл и к нему добавляли 19 мл аммиачного буфера для титрования. Титрование SH-групп производили на установке (рис. 7), собранной в нашей лаборатории, с использованием 0,001н раствора AgN03.
Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина
По нашим данным в белках плазмы крови интактных крыс содержится 1,50±0,06 нмолей карбонильных групп на 1 мг белка (табл. 2), что согласуется с результатами других исследователей (Дубинина, и др., 1995; Evans et al., 1999; Himmelfarb et al., 2000; Renke et al., 2000; Dalle-Donne et al., 2003). Спонтанное окисление плазменных белков в условиях in vitro увеличивает содержание карбонильных групп в них в 2-3 раза. Стимуляция свободных радикалов кислорода системой Fe2+-H202 приводит к резкому увеличению степени окислительной модификации белков. Так в условиях in vitro в при-сутствии Fe и Н2Ог количество карбонильных групп в белках плазмы возрастает в 38 раз по сравнению с исходным уровнем (табл. 2).
Таким образом, генерация свободных радикалов кислорода в среде инкубации приводит к интенсификации окислительной модификации белков плазмы крови. Это связано с тем, что комплекс Бе2+-ЭДТА в присутствии Н2О2 генерирует один из самых реакционноспособных радикалов - ОН (Stadtman et al., 1990). Гидроксильный радикал, атакуя ближайшие аминокислотные остатки белков, формирует карбонильные группы (Davies, 1987; Дубинина, Шугалей, 1993; Griffiths, 2000; Dalle-Donne et al., 2003).
Как видно по таблице 2, при умеренной гипотермии происходит более чем двукратное повышение содержания карбонильных групп в белках плазмы. Однако при этом не изменяется скорость окисления белков в условиях in vitro (табл. 2, рис. 9). Это свидетельствует, по-видимому, об отсутствии изменений в структуре плазменных белков, соответственно, доступности аминокислотных радикалов для оксидантов.
Повышение окислительной модификации белков плазмы при умеренной гипотермии свидетельствует об активации процессов образования активных форм кислорода.
Более значительно возрастает интенсивность ОМБ при пролонгировании умеренной гипотермии. Так, при пролонгированной 3 ч гипотермии 30С в белках плазмы содержание карбонильных групп увеличивается на 198%, а при спонтанном и Ре2+-зависимом окислении - на 81% и 63% соответственно относительно контроля (табл. 2, рис. 8).
Повышение скорости окисления белков в условиях in vitro при пролонгированной 3 ч гипотермии 30С свидетельствует, по-видимому, об изменении конформации плазменных белков, в результате чего увеличивается доступ к ранее скрытым аминокислотным остаткам для прооксидантов. Таким образом, умеренная гипотермия, и в особенности пролонгированная, существенно ускоряет окислительную модификацию белков плазмы крови.
При действии низкой температуры и на начальных этапах гипотермии активизируется деятельность организма, что направленно на предотвращение падения температуры тела (Майстрах, 1975). При этом повышаются энергозатраты и, стало быть, стимулируется главный поставляющий энергию процесс - дыхание. Действительно, показано, что при умеренной гипотермии существенно увеличивается, как внешнее дыхание, так и дыхание на уровне митохондрий (Чуйкин, Вовенко, 1993). Активизация дыхания увеличивает поток электронов по дыхательной цепи, что неизбежно влечет за собой повышение продукции 02 , а стало быть и ОН" (Скулачев, 1998). Можно подумать, что такая последовательность событий имеет место при умеренной гипотермии и, особенно, при пролонгированной 3 ч гипотермии 30С. Ускорение процессов генерации активных метаболитов кислорода в тканях при гипотермии может способствовать повышению их содержания в плазме.
Полагают, что при гипотермии в тканях возникает гипоксическое состояние (Эмирбеков, Львова, 1985). При этом нарушается окисление субстратов вследствие недостаточного поступления кислорода в ткани, это приводит к накоплению в тканях субстратов, коферментов, флавин- и гемсодержащих компонентов в восстановленном состоянии, повышению восстановительного потенциала. В этих условиях за счет избытка донаторов электронов и протонов может происходить утечка единичных электронов, сопряженная с одно-электронным восстановлением кислорода и образованием супероксидного анион-радикала (Дубинина, 1989). Считается, что при состоянии гипоксии основным источником супероксидного анион-радикала служит ксантинокси-даза (Дубинина, 1989; Меньшикова и др., 1997; Li, Jackson, 2002). Ксанти-ноксидаза в здоровых клетках представлена, в основном, в виде НАДФ-зависимой ксантиндегидрогеназой. При различных патологических процессах этот фермент превращается в оксидантпродуцирующую форму, которая индуцирует оксидантный стресс (Oden, 1991; Peterhans 1997).
Известно, что на начальных этапах гипотермии резко увеличивается синтез и секреция катехоламинов, в результате чего в крови повышается содержание адреналина и норадреналина (Майстрах, 1975; Шкестерс, 1991). Аутоокисление катехоламинов сопровождается образованием супероксидного радикала (Меньшиков и др., 1997).
Еще одним из источников АФК в крови являются эндотелиальные клетки, продуцирующие супероксид анион радикал, пероксид и пероксинит-рит, которые частично попадают в кровоток (Меньшикова и др., 1997; Bomzon, Ljubuncic, 2001).
Содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови при гипотермии и на фоне введения даларгина
Выше было отмечено, что окислительно-модифицированные белки усиленно подвергаются как протеолизу, так и фрагментации. Одним из маркеров этих процессов является обнаружение в плазме крови среднемолеку-лярных пептидов (Галактионов и др., 1983; Владыка и др., 1987). В связи с этим в данной главе приведены данные о содержании СМП в плазме крови при гипотермии. Полученные нами результаты показали, что при гипотермии происходит увеличение содержания среднемолекулярных пептидов в плазме крови крыс. Как видно из таблицы 7 и рисунка 13, умеренная гипотермия на 34% повышает уровень СМП в плазме крови, а её пролонгирование 3 ч привело к дальнейшему увеличению СМП в крови (на 42%). Более значительно (до 70%) увеличивается содержание СМП в плазме при глубокой (20С) гипотермии.
Таким образом, гипотермия в зависимости от глубины и длительности приводит к повышению содержания СМП в плазме крови.
Как известно, основной путь образования СМП - это деградация белков под действием протеолитических ферментов (Гордеева и др., 1986). Надо полагать, что при гипотермии в крови усиливаются протеолитические процессы. Это подтверждают и литературные данные, свидетельствующие об увеличении активности тканевых протеаз при гипотермии (Нурмагомедова и др., 1983). П.М. Нурмагомедова (2001) обнаружила ускорение процессов автолиза и протеолиза белков мозга при гипотермии, что отражает, видимо, как повышение степени модификации белков, так и повышение активности ка-тепсина при низких температурах тела.
Известно, что протеолизу в первую очередь подвергаются модифицированные белки (Дубинина, Шугалей, 1993; Davies, 2001). При различных экстремальных условиях важнейшей причиной модификации белков является их окисление под действием АФК (Дубинина и др., 1995). Изменение содержания СМП в плазме крови коррелирует с изменением степени окислительной модификации плазменных белков при гипотермии (табл. 7, рис. 14).
В опытах in vitro было показано (Дубинина, Шугалей, 1993), что под влиянием свободных радикалов кислорода окислительная модификация белков сопровождается либо их агрегацией с увеличением молекулярной массы, либо фрагментацией с распадом на более низкомолекулярные компоненты. Такие измененные белки, по мнению авторов, становятся более чувствительными к процессам протеолиза.
Таким образом, одна из причин повышения содержания СМП в плазме крови при гипотермии может быть связана с усилением протеолиза белков, модифицированных радикалами кислорода.
Другой возможной причиной повышения уровня "средних молекул" пептидной природы является их поступление из различных тканей в результате повышения проницаемости клеточных мембран под действием низких температур. О такой возможности свидетельствуют данные, в которых показано, что при гипотермии в сыворотке крови крыс существенно увеличивается активность гепато- и кардиоспецифических ферментов (Утно и др., 1989).
СМП нарушают тканевое дыхание, микроциркуляцию и лимфодинами-ку (Владыка и др., 1987; Галактионов и др., 1991). Среднемолекулярные пептиды вызывают разнообразные патофизиологические эффекты, прежде всего в результате нарушения функций форменных элементов крови. Показано, что СМП ингибируют синтез ДНК в лимфоцитах, миграцию лейкоцитов, синтез гемоглобина, гликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, нарушают эритро-поэз, фагоцитоз (Владыка и др., 1987; Ковалевский, Нифантьев, 1989; Галактионов и др., 1991). На эритроцитах человека установлено, что СМП вызывает двух-, трехкратное увеличение натриевой проницаемости и не влияет заметным образом на коэффициент проницаемости калия. При этом примерно вдвое угнетается активность Na, К-АТФазы (Галактионов и др., 1991). Некоторые фракции СМП из крови больных с хронической почечной недостаточностью увеличивали проводимость бимолекулярных фосфолипидных мембран (Садыков и др., 1982).
СМП оказывают влияние на процессы тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования (Тупикова, 1983; Ковалевский, Нифантьев, 1989). Они также играют важную роль в регуляции процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), обладали антиоксидантными свойствами, хотя отдельные фракции обладали и прооксидантными свойствами (Туликова, 1983; Вальдман и др., 1991; Волчегорский и др., 1991).
Установлено, что СМП обладают адаптогенными эффектами, направленность которых определяется их молекулярно-массовым распределением. Так, относительно высокополимерные СМП оказывают иммуностимулими-рующее и стресс-протекторное действие (Волчегорский и др., 1995) и, вместе с тем, снижают устойчивость к физической нагрузке и «инсулиновому» стрессу (Волчегорский и др., 1996). Олигомерные вещества этой группы, наоборот, обладают стресспотенцирующим, иммунодепрессивным и противовоспалительным эффектами и одновременно повышают устойчивость к стрессорам (Волчегорский и др., 1996). Таким образом, эффект СМП зависит от того, какие пептиды преобладают в их составе. Возможно, такие эффекты СМП имеют место и при гипотермии.
