Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. Современные представления о механизме кислородной интоксикации 10
1.2. Изменения в крови при действии кислорода под повышенным давлением 28
Глава 2. Экспериментальная часть 40
2.1. Постановка эксперимента 40
2.2. Получение материалов для биохимического анализа 44
2.3. Методы биохимического анализа 45
2.4. Статистическая обработка результатов 52
Глава 3. Результаты исследования 53
3.1. Экспериментальное изучение металлосодержащих белков плазмы крови животных при разных режимах ГБО 53
3.1.1. Определение металлов и металлосодержащих белков плазмы крови кроликов при гипероксии и в постгипероксический период 53
3.1.2. Изучение гемоглобина и пероксидазной активности в плазме крови крыс при различных режимах гипероксии 66
3.1.3. Определение оксидазной активности церуло-плазмина в плазме крови крыс при различных режимах гипероксии 81
3.1.4. Хемилюминесценция в плазме крови крыс в системе Н2О2-ЛЮМШОЛ в норме и при разных режимах гипероксии 87
3.1.5. Изучение хемилюминесценции в реакциях, катализируемых соединениями железа и меди 91
3.1.6. Биохимическая оценка индивидуальной чувствительности к кислородной интоксикации у кроликов. 106
3.1.7. Биохимические тесты-в плазме крови крыс с аллок-сановым диабетом при различных режимах гипероксии 116
3.2. Апробация тестов степени тяжести кислородной интоксикации в клинике 124
3.2.1. Определение гемоглобина и пероксидазной активности плазмы крови у детей при ГБО-терапии 124
3.2.2. Определение гемоглобина, пероксидазной активности и интенсивности хемилюминесценции в плазме крови беременных женщин с тяжелыми формами сахарного диабета при ГБО-терапии 143
3.2.3. Апробация теста индивидуальной чувствительности к ГБО в клинике 151
Глава 4. Обсуждение результатов 154
Выводы 181
Литература 184
- Современные представления о механизме кислородной интоксикации
- Определение металлов и металлосодержащих белков плазмы крови кроликов при гипероксии и в постгипероксический период
- Определение оксидазной активности церуло-плазмина в плазме крови крыс при различных режимах гипероксии
- Биохимические тесты-в плазме крови крыс с аллок-сановым диабетом при различных режимах гипероксии
Введение к работе
Актуальность исследования. Повышенное давление кислорода находит все более широкое применение в различных областях практической деятельности. Метод гипербарической оксигенации (ГБО) успешно применяется в медицине для предупреждения или ликвидации гипоксических состояний различной этиологии, он эффективен в хирургии при проведении операций с повышенным риском, при анаэробных инфекциях, нарушениях кровоснабжения мозга и сердечной мышцы, при острой кровопотере, в реанимации и токсикологии, в онкологии (Ратнер, 1974; Березин, 1974; Бу-раковский, Бокерия, 1974, 1981; Гинзбург и др., 1975; Петровский, Ефуни, 1976; Ефуни, 1980, 1981; Белокуров, Рыбачков, 1981). Перспективно применение метода ГБО в геронтологии, в профилактике утомления и повышении работоспособности (Батали-на и др., 1980; Крон и др., 1981). Человек подвергается действию гипербарической атмосферы при проведении подводных и кессонных работ.
Однако универсальное токсическое действие избыточных концентраций и давлений кислорода резко ограничивает применение гипероксической среды. Случаи кислородной интоксикации встречаются в практике ГБО-терапии при передозировке кислорода или повышенной индивидуальной чувствительности организма (Петровский, Ефуни,1976). Появление токсичных интермедиатов кислорода может наблюдаться в условиях нормоксии,являясь одним из патогенетических звеньев в развитии ряда патологий и экстремальных состояний, при старении организма (Прайор, 1979; Фри-дович, 1979; Мензель, 1979; Журавлев, 1982; Калмыкова, 1982).
Токсичность избыточных концентраций кислорода ставит за-
дачу поиска надежных биохимических критериев степени тяжести кислородной интоксикации. Эти тесты необходимы для эффективного и безопасного применения метода гипербарической оксиге-нации в клинике (Ефуни, 1980) Существующие физиологические тесты отражают в основном устойчивость нервной системы и малоэффективны для оценки общетоксического действия низких давлений кислорода, наиболее широко применяющихся в клинике. Весьма актуальной является разработка способов прогнозирования вариабельной индивидуальной чувствительности организма к кислородной интоксикации и основанный на этом подбор индивидуальных безопасных режимов оксигенации. Изучение механизмов токсического действия кислорода даст возможность и более направленного повышения резистентности организма к условиям гипероксии.
Принципиальное значение для создания эффективных тестов токсичности кислорода и индивидуальной резистентности к ней имеет установление биохимических изменений в крови. Кровь объединяет все органы и ткани, может отражать протекающие в них изменения и, наоборот, изменения в крови могут активно влиять на другие ткани. При гипероксии именно в крови вслед за легкими создается максимальное напряжение кислорода. Значительная концентрация в крови соединений металлов переменной валентности и прежде всего геминового и негеминового железа -катализаторов свободнорадикального окисления ставит эту ткань в число важнейших в опосредовании общетоксического повреждающего эффекта кислорода под повышенным давлением.
Важную роль в механизме усиления кислородной интоксикации, окислении аутооксидабельных соединений и повреждении биомембран играет увеличение гемолиза эритроцитов и выход в
- "6 -
плазму мощного прооксиданта - гемоглобина (Лукаш и др., 1979; Внуков и др., 1979). Это вызывает изменение ряда сопряженных биохимических показателей, ведет к увеличению активности про-оксидантных компонентов в плазме и является реальным механизмом усиления свободнорадикального окисления в крови.
Подробное изучение этих процессов может явиться основой разработки достаточно чувствительных, информативных и доступных биохимических тестов степени тяжести кислородной интоксикации и тестов индивидуальной чувствительности организма к гипероксии.
Цель исследования. Основной целью работы явилось установление роли металлосодержащих соединений плазмы крови в развитии кислородной интоксикации и разработка на этой основе биохимических тестов. Для достижения этой цели работа проведена в следующих направлениях:
I. Исследование динамики основных прооксидантных металлосодержащих белков в плазме крови у животных при разных режимах гипероксии и в постгипероксический период, доказательство их роли в процессах радикалообразования и усиления кислородной интоксикации:
а) определение содержания и форм гемоглобина в плазме
крови, выяснение роли гемоглобина в проявлении пероксидазных
свойств плазмы при разных режимах ГБО;
б) изучение оксидазной активности церулоплазмина и роли
медьсодержащих компонентов плазмы в механизмах кислородной
интоксикации;
в) исследование хемилюминесценции плазмы в системе IkjOg-
люминол как интегрального показателя соотношения про- и анти
оксидантних систем крови при ГБО, сопоставление прооксидант-
ной активности ряда железо- и медьсодержащих компонентов в различных хемилюминесцентных моделях.
Отбор перспективных тестов степени тяжести кислородной интоксикации и доказательство их информативности в эксперименте на модельной патологии и в клинике на разных группах больных.
Определение биохимических показателей в пробах крови, экспонированных при ГБО и сопоставление полученных результатов с индивидуальной устойчивостью животных к гипероксии.
Научная новизна работы. В работе впервые установлена динамика основных металлосодержащих компонентов плазмы крови -внеэритроцитарного гемоглобина, суммарной пероксидазной активности и оксидазной активности церулоплазмина у животных при разных режимах гипероксии и в постгипероксическии период и показана роль этих изменений в развитии кислородной интоксикации. Исследована динамика и информативность хемилюминес-ценции плазмы в системе Н2О2-ЛЮМИНОЛ при разных режимах гипероксии и в постгипероксическии период, показана зависимость этого показателя от активности прооксидантных компонентов плазмы крови. Проведенные эксперименты позволили отобрать информативные тесты степени тяжести кислородной интоксикации, которые впервые были апробированы в клинике при ГБО-терапии на разных возрастных группах больных с различными патологиями. Впервые выделены возрастные группы детей, различающиеся динамикой и формами внеэритроцитарного гемоглобина и его пер-оксидазоактивных производных. Впервые предложено определение динамики хемилюминесценции в системе Н2О2-ЛЮМИНОЛ в пробах крови, экспонированных в гипероксических условиях, для прогнозирования индивидуальной устойчивости организмов к ГБО.
Практическая значимость работы. Практическую ценность представляют установленные изменения биохимических показателей, которые использованы в качестве тестов степени тяжести кислородной интоксикации. Их информативность и достаточно высокая чувствительность доказана на разных группах больных при разных патологиях при проведении ГБО-терапии. Доступность материала для анализа, простота исполнения тестов является дополнительным преимуществом для их использования в клинических лабораториях. Результаты исследования динамики ВЭГ в эксперименте и апробация этого показателя в клинике явились основой для получения авторского свидетельства № 936880 "Способ диагностики кислородной интоксикации". На основе данных по апробации показателя СПА оформлено рацпредложение № 109 от 17.10.1979 г. "Способ диагностики токсического действия кислорода" в НИИ Акушерства и Педиатрии МЗ РСФСР и подана заявка на изобретение № 3394820/13 от 11.03.82 г. Определение оксидазной активности плазмы крови признано рацпредложением № 130/82 от 06.07.1982 как "Способ определения степени тяжести кислородной интоксикации". На основе клинической апробации теста индивидуальной чувствительности подана заявка и получен приоритет на изобретение № 3358121/13 от 27.II.1982.
Результатом работы по экспериментальному диабету явилось создание способа усиления аллоксанового диабета, что признано рационализаторским предложением.
Тесты внедрены во Всесоюзном Центре ГБО (г.Москва), НИИ по биологическим испытаниям химических соединений (БИХС) МЗ СССР (г.Купавна Моск.обл.), Ростовском-на-Дону НИИ Акушерства и Педиатрии МЗ РСФСР, Свердловском ордена Трудового Красного Знамени институте Охраны Материнства и Младенчества МЗ СССР,
Ростовском-на-Дону ордена Дружбы Народов Медицинском институте, 7-й объединенной клинической больнице, г.Волгоград.
Тесты степени тяжести гипероксического повреждения и индивидуальной чувствительности организма к ГБО могут быть использованы для отбора и апробации эффективных антигиперокси-ческих препаратов.
Материалы, полученные в работе, используются при чтении лекций по специальным курсам на кафедре биохимии и биотехнологии РГУ.
Современные представления о механизме кислородной интоксикации
Образование супероксида постулировано при аутоокислении геМОГЛОбИНа В МетгеМОГЛОбИН (Goldberg et al, 1979; Shaanan, 1982; Wallace et al, 1982), миоглобина и цитохромов С и Р-450 (Estabrook et al, 1979; Метелица, 1982; Wallace et al,I982), ГеМИНа (ЙОН, 1982), ГИДРОХИНОНОВ ( Sutton, Sangster, 1982), адреналина и норадреналина ( Bors et al, 1978), тиолов - глу-татиона, дитиотреитола, меркаптоэтанола (Мерзляк, Соболев, 1975), гиалуроновой и диоксифумаровой кислот, ДОФА. ( Haiii weli, 1981). Супероксидный анион-радикал генерируется при ферментативной работе ксантиноксидазы ( Ohmori et al, 1978), Д-галакто-зооксидазы, триптофан-2,3-диоксигеназн, дофамин- -гидрокси-лазн, уратокеидазы ( Fridovich, 1976), НАДЇЇ-оксидазн ( Drath et al, 1975)» Генерация 0 отмечена при нормальном функционировании митохондрий, эндоплазматического ретикуяума, хлоропластов (Мерзляк, Соболев, 1975), при активации нейтрофилов ( Drath, Karnovsky, 1975), макрофагов ( Johnston et al, 1978), MOHOЦИТОВ ( Klebanoff, Hamon, 1976). В МИТОХОНДРИЯХ Наряду С реакциями цикла Габера-Вейсса в генерации гидроксильных радикалов участвуют семихиноновые радикалы убихинона ( Nohl et ai, 1982). Убихинон принимает также участие в образовании митохондриями ПереКИСИ ВОДОрОДа ( Boveris et al, 1976). Супероксид-зависимое образование гидроксильных радикалов обнаружено в присутствии тиольных соединений - глутатиона, цистеина, цистеамина (Rowley, Haiiiweii, 1982), двухвалентного железа (Осипов и др., 1981), при окислении, катализируемом пероксидазами ( Haiiiweii, 1977), цитохромом Р-450 (Метелица, 1982) и множестве других реакций. Синглетный кислород, помимо неферментативной дисмутации супероксидных анион-радикалов, образуется в биологических системах при катализируемом гемопротеидани разрушении гидроперекисей лишщов ( Hawco et al, 1977), работе пероксидазн из хрена, липоксигеназы, простагландинсинтетазн (Мерзляк, Соболев, 1975). Как видно из перечисления, соединения металлов, в первую очередь железа и меди, металлоферментн играют ключевую роль в генерации активных форм кислорода. Образование активных форм кислорода в низких стационарных и, по-видимому, безопасных для клетки концентрациях является нормальным проявлением ее метаболической активности. Усилению радикалообразования и развитию патологических последствий взаимодействия радикалов с биосубстратами препятствует наличие систем эффективной антирадикальной защиты. Нормальное функционирование живых организмов в аэробной среде было бы невозможно без наличия многоуровневой и многоканальной системы антирадикальной защиты и регуляции концентрации свободного кислорода и радикалов в тканях ( Gochierner, 1978; Герасимов, 1979, 1981). Интересно, что именно соединения железа и меди природа использовала для создания наиболее эффективных ферментативных систем антирадикальной защиты. Образование кислородных радикалов эффективно тормозится согласованной работой супероксиддисмутаз и каталазн. Биологическая роль железо-, марганец-или медь-, цияксодержащих супероксиддисмутаз заключается в быстром удалении из среды супероксида с образованием химически более инертной перекиси водорода и предотвращении появления синглетного кислорода в результате неферментативной дисмутации супероксидов (Мс Cord, Fridovich, 1969; Fridovich, 1976, 1978; Рее, Мс Clune, 1978). Супероксвддиемутаза является также мощным ингибитором образования семихиноновых радикалов ( winterbourn et ai, 1978). Образующаяся перекись водорода разрушается гемеодержа-щими каталазой и пероксидазами (Шноль, Бухатина, 1965; Dean, 1982). Накопление липидных гидроперекисей активно предотвращается селенозависимой глутатионпероксидазой ( Burk et ai, 1978; Годзиева, 1981), неорганическим селеном и селенопистеи-ном ( Beutier et ai, 1975), а также селенонезависимыми глута-тионпероксидазами - глутатион-трансферазами А, В, С ( Birk, Lawrence, 1978; Shreve et al, 1979). Ідутатионпероксидаза сильно ингибируется ионами тяжелых металлов, в частности меди ( Dierickx, 1982). Помимо ферментов в регуляции интенсивности свободноради-кальных процессов принимают участие ряд низкомолекулярных соединений - dC-токоферол ( Yagi et al, 1978; Matsushita et al, - 16 1978; Мс ау et al, 1978), Ji -каротин и другие карртиноиды (МерзЛЯК, Соболев, 1975), фПЭВОНОИДЫ ( Cavallini et а1,І978), эндогенные тиолы (Бурлакова и др., 1978), аскорбиновая кислота (Chen et al, 1980), ряд фенолов (Петрусевич, 1975), кате-холамины (Корнеев и др., 1980), фосфатидилхолин и фосфатиди-линозит (Аристархова и др., 1979), стероиды (Гукасов, Федоров, 1977; Саксонов, 1978), никотиновая кислота, билирубин и биливердин (Журавлев, 1975, 1982), мочевина (Лукаш и др., 1980), аргинин (Кричевская и др., 1980), полиамины (Шугалей и др., 1981).
Значительное регулирующее действие оказывает сама структура биологических мембран, взаиморасположение белков и липи-дов (Владимиров, Арчаков, 1972; Деев и др., 1978; Конев и др., 1982).
Вся эта сложная и разветвленная система эффективно предотвращает интенсификацию радикалообразования и проявление токсичности кислорода в условиях нормоксии. Однако гипероксия создает ситуацию, когда активность систем антирадикальной защиты недостаточна для эффективного сдерживания свободноради-кального окисления. В настоящее время накапливается все большее число данных о значительном активировании реакций свобод-норадикального окисления при гипероксии (Borg et al, 1978; Кричевская и др., 1980; Фрэнк, Массаро, 1981; Журавлев, 1982). При гипероксии обнаружено образование Н в перфузируемой печени крыс, в ее изолированных клетках, митохондриях, микросомах и пероксисомах (Chance et al, 1978).
Определение металлов и металлосодержащих белков плазмы крови кроликов при гипероксии и в постгипероксический период
Задачей исследования первого раздела работы была характеристика некоторых прооксидантных систем плазмы крови при действии ГБО. Определяли динамику внеэритроцитарного гемоглобина, железа, пероксидазной активности плазмы, меди, оксидаз-ной активности церулоплазмина, а также интенсивность хемилю-минесценции плазмы в системе Н202 люминол и содержание продукта реакций перекисного окисления липидов - малонового ди-альдегвда в мембранах эритроцитов.
В связи с предполагаемым использованием биохимических показателей в качестве тестов степени тяжести кислородной интоксикации в клинике при многократных сеансах ГБО изучали динамику всех показателей в разные сроки постгипероксического периода.
Кролики являются удобным для такого исследования объектом, позволяющим неоднократный забор крови в достаточных для анализа количествах и сопоставление динамик показателей с индивидуальным состоянием животного в условиях ГБО и в постгипероксический период.
Время наступления судорог при действии 0,4 МПа кислорода в группе из 20 кроликов составило 95,4 + 4,3 мин. с колебаниями от 68 мин до 149 мин, среднее время гибели - 56,2 + 13,6 мин с колебаниями от 3 мин. до 3 часов после декомпрессии. 30$ кроликов выжило в постгипероксический период (5 суток наблюдения) (табл. I). Как следует из таблицы, время наступления судорог и время гибели изолированно друг от друга не могут служить достаточно полными критериями индивидуальной чувствительности. Например, у кроликов 5 и 15 судорожный приступ под действием 0,4 МПа кислорода возник через 68 и 69 мин соответственно, однако оба кролика выжили после ГБО. И наоборот, у кролика 19 судороги возникли через 149 мин после начала ГБО и он погиб через 3 мин после декомпрессии. Оба показателя индивидуальной чувствительности к ГБО несомненно взаимосвязаны, однако, очевидно, выражают разные стороны устойчивости организма к ГБО. Изменения биохимических показателей в крови при ГБО, отражающие общетоксический эффект кислорода под давлением, необходимо сопоставлять с величинами как времени наступления судорог, так и с временем гибели животных в постгипероксический период.
Так как при ГБО возможно перераспределение жидкости между кровью и тканями, что может являться дополнительной причиной изменения изучаемых биохимических показателей в крови, мы определяли содержание белка в плазме наряду с определением других показателей. Результаты представлены в табл. 2. В плазме крови кроликов отмечаются значительные колебания общего содержания белка от 6,0 г# до 14,6 г#, в среднем - 8,14 г#. После сеанса ГБО 0,4 МПа до возникновения судорог у 10 кроликов из 16 содержание белка не изменялось, у 4 кроликов значительно уменьшалось (кролики I, 2, 12 и 13) и у двух - значительно возрастало (кролики 8 и II). Однако закономерности между временем гибели животных в первые сутки постгипероксического периода на основании содержания общего белка в плазме крови выявить не удалось.
Нами не обнаружено достоверных изменений в концентрации белка в плазме крови и во все сроки постгипероксического периода (табл. 2). Незначительное увеличение содержания белка на 14$ (р 0,05) обнаружено только в момент гибели животных (табл. 4). Содержание ВЭГ у интактных кроликов составило 2,11 + + 0,15 мкМ (табл. 3). После наступления у кроликов судорог его содержание увеличивается на 50$. Через 30 мин после извлечения животного из барокамеры содержание гемоглобина превышает контрольный уровень на 53$, а через 60 минут - на 107$. В более отдаленные сроки постгипероксического периода содержание ВЭГ начинает снижаться. Через 120 мин после извлечения животного из барокамеры оно превышает контрольный уровень на 49$, а через сутки не отличается от уровня контроля (табл.3). Максимальное увеличение концентрации гемоглобина в плазме (на 151$) наблюдается в момент гибели животного (табл. 4). Имеется, следовательно, достаточно тесное соответствие между величиной концентрации ВЭГ и состоянием кроликов при гипероксии. Значительное увеличение показателя наблюдается в момент наступления судорог и через I час после ГБО (время, близкое к среднему времени гибели). Максимальное увеличение данного показателя наблюдается у более чувствительных (погибших после ГБО) кроликов (табл. 4), что отвечает требованиям к нему как биохимическому тесту степени тяжести кислородной интоксикации как при гипероксии, так и в ранние сроки постгипероксического периода. Например, кролики 13 и 14 оказались од-ними из наиболее чувствительных к действию ГБО.
Определение оксидазной активности церуло-плазмина в плазме крови крыс при различных режимах гипероксии
Таким образом, наличие достаточно сильных восстановителей является дополнительным регулятором пероксидазной активности наряду с содержанием внеэритроцитарного гемоглобина, состава пероксидазоактивных фракций и других возможных механизмов. Окисление восстановителей при гипероксии может непосредственно вести к увеличению СПА.
Увеличение пероксидазной активности при ГБО, по-видимому, усиливает окислительную атаку восстановленных субстратов с помощью неорганической и органических перекисей, образующихся в условиях гипероксии. Можно предполагать, что этот процесс является механизмом, усиливающим кислородную интоксикацию.
В плазме, однако, присутствует ряд белков, осуществляющих окисление субстратов непосредственно молекулярным кислородом. Одной из основных оксидаз крови является церулоплазмин. Следующим этапом работы поэтому явилось исследование оксидаз-ной активности церулоплазмина в плазме крови крыс при различных режимах гипероксии.
Концентрация церулоплазмина в плазме крови интактных крыс, определенная по его оксидазным свойствам, составила 1,58+0,11 мкМ (табл. 13), что соответствует данным литературы (Колб, Камышников, 1976; Schultze, Heremans, 1966; Engler, 1979).
"Терапевтический" режим ГБО (0,2 МПа в течение I часа) вызывает увеличение оксидазной активности плазмы на 81$. Повышение давления кислорода до 0,3 Mia и увеличение времени экспозиции до 2 часов сопровождается возрастанием оксидазной активности на 94$ над уровнем контроля.
Действие 0,5 МПа кислорода при различных вариантах экспозиции вызывает, как и в случае пероксидазнои активности, неодинаковые изменения оксидазных свойств ЦП. Через 30 мин нахождения крыс в барокамере оксидазяая активность превышает контрольный уровень на 88$ (р 0,001), но при увеличении времени экспозиции до I часа она снижается до 2,29 + 0,15 мкМ, превышая уровень контроля лишь на 45$ (табл. 13). Предсудо-рожное состояние (0,5 МПа, 2 часа) характеризуется дальнейшим повышением оксидазной активности до 2,54+0,15 мкМ ІЩ, или на 61$ (р 0,001). Развитие судорожного приступа под действием 0,7 МПа кислорода происходит на фоне максимального увеличения оксидазной активности ЦП (102$ над уровнем контроля).
В изменении оксидазных свойств плазмы, таким образом, отмечается такой же дозозависимый эффект, как и в изменениях пероксидазнои активности при разных величинах давления и длительности экспозиции в условиях ГБО. Аналогичен ответ обоих показателей на низкие и высокие давления кислорода. Оксидаз-ная активность, так же, как и пероксидазная, значительно изменяется в ответ на действие низких доз кислорода. Одинаковая по направленности динамика пероксидазнои и оксидазной активности в плазме и концентрации внеэритроцитарного гемоглобина, по-видимому, указывает на тесную взаимосвязь этих показателей и, возможно, общие механизмы их изменения.
Нами, однако, обнаружена лишь одна фракция, обладающая оксидазной активностью при дискэлектрофоретическом разделении плазмы в 7,5$ полиакриламидном геле. Фракция с Rm 0,31, представленная церулоплазмином, не изменяет своих электрофо-ретических свойств и числа компонентов при действии 0,7 МПа кислорода до возникновения у крыс судорожного приступа. Таким образом, причиной модификации оксидазных свойств ЦП при ГБО не является перераспределение его фракционного состава.
Сходство динамики ВЭГ, СМ и ЦП при ГБО позволило предположить, что изменения ЦП, как и в случае пероксидазной активности, вызываются изменениями концентрации ВЭГ в плазме. Для доказательства этого были поставлены модельные эксперименты по влиянию ряда соединений, содержащих геминовое железо, на оксидазную активность пулированной плазмы крови крыс.
Наиболее значительное усиление оксидазных свойств церуло-плазмина наблюдалось при добавлении гемоглобина к плазме непосредственно перед определением его активности (табл. 14). Например, при добавлении 3 мкМ гемоглобина оксидазная активность увеличивалась на 7$, при добавлении 6 мкМ гемоглобина -на П#, 12 мкМ гемоглобина - на 15$, 16 мкМ - на 20$, 22 мкМ -на 26$, 30 мкМ - на 35$. Если плазма с гемоглобином предварительно инкубировалась при 37С в течение I часа в термостате, то зависимость оксидазной активности от концентрации гемоглобина была менее значительной.
Аналогичные зависимости были получены и для пероксидазы из хрена и хлорогемина. Таким образом, присутствие соединений геминового железа увеличивает оксидантные свойства церулоплаз-мина.
Биохимические тесты-в плазме крови крыс с аллок-сановым диабетом при различных режимах гипероксии
Тест индивидуальной чувствительности, так же как и тесты степени тяжести кислородной интоксикации, могут оказаться важными для оптимизации режимов пребывания человека в условиях повышенного давления кислорода. Весьма перспективным направлением применения кислорода под давлением является ГБО-терапия.
Одной из распространенных патологий, в лечении которой в Ростовском НИИ Акушерства и Педиатрии применяется метод ГБО, является сахарный диабет у беременных женщин. Прежде чем приступить к апробации тестов кислородной интоксикации в клинике, мы считали необходимым оценить их информативность на модели сахарного диабета у животных.
Как показано в предыдущих главах, изменения тестов, с одной стороны, отражают темп реакций свободнорадикального окисления в крови при гипероксии, позволяя оценить динамику прооксидантной активности плазмы. С другой стороны, активация реакций свободнорадикального окисления при некоторых патологиях может вести к изменению общей чувствительности к ГБО и чувствительности тестов к действию гипероксии.
По данным литературы, аллоксановый диабет характеризуется значительным усилением реакций перекисного окисления липидов Б тканях (Моситарян, Геворкян, 1981; Murata et al, 1981). Существенно изменяются и свойства мембран эритроцитов при диабете, что делает их более чувствительными к действию повреждающих агентов ( Cataliotti, 1978). Все это может быть причиной изменения чувствительности тестов в условиях патологии, а также сенсибилизации организмов к кислородной интоксикации.
Использование тестов в клинике у пациентов с различными патологиями при лечении методом ГБО-терапии, в том числе группе беременных женщин с тяжелыми формами сахарного диабета, делает актуальной постановку серии с изучением динамики тестов при действии ГБО на крыс с экспериментальным диабетом. В опыт использовали крыс-самок через месяц после подкожной инъекции аллоксана в дозе 180 мг/кг, у которых уровень глюкозы в крови в течение эксперимента составил от 9,35 до 17,6 мкМ (в среднем 10,28 мкМ). Концентрация глюкозы в крови контрольных крыс составила в среднем 4,02 мкМ с колебаниями от 3,3 мкМ до 5,5 мкМ, что согласуется с данными литературы (Кабак, 1968). Развитие диабета не приводит к изменению содержания ВЭГ и СПА в шгазме крови крыс (табл. 25) по сравнению с контрольными животными (табл. 8). Однако, как оксидазная активность ЦП, так и интенсивность ХЛ плазмы в системе Н202-люминол претерпевают существенные изменения. Оксидазная активность плазмы при аллоксановом диабете у крыс на 71% (р 0,01) превышает уровень контроля, что может быть связано с изменением содержания церулоплазмина и (или) его оксидазных свойств. Интенсивность хемилюминесценции плазмы крови у крыс с диабетом составила 7567 + 888 ед., что в 3,59 раз (р 0,001) превышает уровень контроля (табл. 26, 16). Таким образом, развитие диабета сопровождается значительным увеличением ок-сидазных и прооксидантных свойств плазмы. Наряду с другими причинами это может непосредственно вызывать повышение чувствительности организма к токсическому действию кислорода даже при его небольших избыточных давлениях. Использование нескольких режимов ГБО - терапевтических и токсических позволило сопоставить проявление ранних признаков кислородной интоксикации по тестам у здоровых животных и в условиях патологии. Уже при действии 0,2 МПа 02 в течение I часа наблюдается увеличение содержания ВЭГ до 5,15 + 0,36 мкМ, что на 47$ превышает (р 0,01) уровень гемоглобина при этом режиме ги-пероксии у контрольных крыс (табл. 25). Наблюдается также тенденция к увеличению СПА. Интенсивность хемилюминесценции при этом режиме ГБО возрастает по сравнению с уровнем до ГБО на ЪЪ% (р 0,01), а по сравнению с контрольными животными, экспонированными в барокамере в таких же условиях - в 3,27 раз (р 0,001). Светосумма вспышки хемилюминесценции увеличивается по сравнению с уровнем до ГБО на 87% (р 0,01), что характеризует усиление общей способности плазмы к радикало-образованию. Оксидазная активность церулоплазмина в плазме при действии как 0,2 МПа в течение I часа, так и 0,3 МПа 02 в течение 2 часов не изменяется. По-видимому, церулоплазмин при диабете находится в плазме в "активированной" форме (см. п.3.1.3), и изменение оксидазной активности плазмы может происходить только путем изменения его концентрации.
