Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящей работе в качестве экспериментального подхода для изучения протеаз использованы методы, основанные на времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией-ионизацией из матрицы, или MALDI-TOF (от англ. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight). В основе метода лежит особый вариант лазерной десорбции и ионизации, осуществляемой из объема специально подобранного вещества, обычно называемого матрицей. Для разделения ионов и их регистрации используется времяпролетный детектор. Этот способ анализа образцов обеспечивает определение молекулярной массы исследуемого соединения или молекулярных масс компонентов сложных смесей.
В случае исследования белков видов с известным геномом, несложная предварительная обработка образца, как правило, позволяет идентифицировать один или несколько белков в смеси. Кроме того, благодаря конструктивным особенностям ионного источника MALDI, имеется возможность работы с биологическим материалом без предварительной очистки или фракционирования образца, например, цельной сывороткой крови.
Возможность одновременного измерения молекулярных масс нескольких компонентов смеси позволяет наблюдать гидролиз природного субстрата или нескольких субстратов, например, по накоплению продуктов реакции. Однако, в условиях ионного источника MALDI, как и практически любого другого типа масс-спектрометра, в газовой фазе ионы различных пептидов образуются с неодинаковой эффективностью, поэтому MALDI в исходном варианте нельзя отнести к количественным методам и применять для точных количественных оценок. Для количественных измерений требуется использование специальных методов анализа, например введения изотопных меток.
В данной работе при помощи масс-спектрометрии MALDI-TOF были исследованы взаимодействия выделенных ферментов и субстратов, а также гидролиз экзогенных субстратов протеазами сыворотки крови и подавление активности экзогенного фермента ингибиторами протеаз сыворотки крови.
В первой части работы исследован гидролиз пептида АЬ (1-16) белка амилоида бета, участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера (БА), ангиотензинпревращающим ферментом (АПФ). То, что АПФ гидролизует амилоид-бета, было известно ранее, однако
сайт гидролиза и влияние на гидролиз изомеризации аспарагиновой кислоты не были установлены.
Во второй части работы изучался гидролиз цельной сыворотки трипсином. В условиях in vitro, в системе из протеазы и субстрата содержащийся в низкой концентрации фермент способен гидролизовать многократно превышающее его собственное количество белка. Однако в крови этого не происходит, благодаря сбалансированной системе ингибиторов. При этом ингибиторы могут быть разделены на два типа. Ингибиторы первого типа, например, альфа-1-ингибитор протеиназ (аіИП), известный как антитрипсин, полностью блокируют активность фермента, необратимо связываясь с ним. Другой важный белок крови, альфа-2-макроглобулин (агМ) образует с протеазами комплекс, в котором активный центр фермента остается свободен, но пространственная структура образованного комплекса ограничивает взаимодействие с частью субстратов и ингибиторов, изменяя специфичность фермента. В зависимости от соотношений трипсина и ингибиторов в реакционной смеси должны наблюдаться различные продукты гидролиза. Если ингибиторы связаны с патологическим процессом, то изменения регистрируемых продуктов не только указывает на наличие и относительную концентрацию ингибиторов, но и на развитие или состояние заболевания.
Возможности MALDI-TOF-масс-спектрометрии как метода инструментального анализа ограничены чувствительностью и динамическим диапазоном, что в итоге ограничивает информативность получаемых спектров. При этом, в случаях присутствия в образце протеазы, даже в недостаточном для выявления количестве, ее активность может приводить к образованию значительных количеств легко детектируемых продуктов, которые регистрируются на масс-спектрометрических профилях.
Цели и задачи
Целью работы является разработка метода прямого MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа образцов сывороток крови с применением разных концентраций вводимого искусственно трипсина.
Основные задачи исследования.
1. Используя модельную систему в составе пептида амилоида-бета АЬ(1-16) в качестве субстрата и ангиотензинпреврашающего фермента, определить сайты гидролиза пептида
амилоида-бета Ab(l-16), определить каталитически активный домен и влияние природной модификации изомеризации остатка Asp-7 на эффективность гидролиза.
2. Осуществить масс-спектрометрический анализ MALDI-TOF продуктов гидролиза
плазмы крови различными концентрациями экзогенного трипсина (титрование
трипсином).
3. Исследовать динамику накопления продуктов гидролиза трипсином сыворотки крови
путем количественного анализа посредством MALDI-TOF-масс-спектрометрии и
установить условия, необходимые гидролиза высококопийных (мажорных) сывороточных
белков.
4. Сравнить профили MALDI-TOF-масс-спектрометрии плазмы крови при гидролизе
экзогенным трипсином в норме и при раке яичника.
Научная новизна
В работе впервые показано, что в N-домен АПФ специфично гидролизует пептид АЬ (1-16) на два пептида, АЬ-(1-5) и АЬ-(6-16), при этом С-домен АПФ не гидролизует пептид АЬ-(1-16). Кроме того, методом количественной масс-спектрометрии определено, что изомеризация остатка аспарагиновой кислоты приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза АЬ-(1-16), по сравнению с пептидом с нормальным остатком аспарагиновой кислоты.
Впервые установлено, что при гидролизе сыворотки трипсином, состав продуктов гидролиза меняется в зависимости от количества вносимого трипсина. При этом, при введении трипсина в концентрации меньше 2 мг/мл сыворотки, удается регистрировать масс-спектры, свободные от продуктов гидролиза так называемых мажорных белков, обычно целенаправленно удаляемых при проведении прямых масс-спектрометрических исследований.
Представлен новый метод регистрации изменений в составе ингибиторов протеаз крови с использованием прямой масс-спектрометрии. Концентрации ингибиторов повышаются, в том числе, при развитии онкологических заболеваний. Масс-спектрометрическая регистрация таких изменений проводилась по изменению состава продуктов триптического гидролиза.
Впервые методом количественной масс-спектрометрии в условиях прямого масс-спектрометрического анализа измерены скорости накопления отдельных продуктов гидролиза. Изменения скорости накопления продуктов отражают изменение активности ингибиторов, модифицирующих активность трипсина. Таким образом, при прямом масс-
спектрометрическом исследовании определено изменение концентраций белков, содержащихся в крови в концентрации порядка 10" М, недоступных для непосредственной регистрации методом прямого масс-спектрометрического исследования.
Практическая значимость работы
Практическая значимость работы заключается в разработке методов анализа и измерения активности протеаз методом масс-спектрометрии MALDI-TOF с использованием нативных субстратов в сыворотке крови и in vitro. В работе также показана возможность использования функциональных свойств протеолитических ферментов и ингибиторов сыворотки крови для прямой масс-спектрометрии образцов крови и ее производных.
Показанные в работе особенности гидролиза АПФ пептида АЬ (1-16), и его формы с изомеризованным остатком аспарагиновой кислоты, может указывать на потенциальную биологическую роль АПФ как фермента, связанного с развитием болезни Альцгеймера. Это находит подтверждение в работах других авторов. Так, выявлены два полиморфных варианта гена АПФ связанных с увеличением накопления Ab (Kehoe PG 2009, Miners JS et al. 2010), со ссылкой на представленную работу.
Использование функциональных свойств протеаз и ингибиторов позволяет по изменениям в их активности при проведении прямого масс-спектрометрического профилирования (ПМСП) оценивать содержание белков присутствующих в концентрациях порядка 10" М, недоступных для непосредственной масс-спектрометрической регистрации, таким образом, продемонстрирована возможность использования молекулярных зондов при прямой масс-спектрометрии.
Положения, выносимые на защиту
1. N-Концевой домен ангиотензинпревращающего фермента специфично гидролизует
пептид амилоида-бета АЬ(1-16), с образованием двух пептидов АЬ(1-5) и АЬ(6-16), причем
изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в 7 положении этого пептида приводит к 4-
кратному увеличению скорости гидролиза АПФ. С-концевой домен не гидролизует пептид
амилоида-бета АЬ(1-16).
2. Состав продуктов гидролиза сыворотки трипсином зависит от количества
вводимого фермента. При концентрациях трипсина около 8,5 мМ в спектрах представлены
продукты отличные от пептидов альбумина.
-
Скорость накопления продуктов гидролиза трипсином, и минимальное количество трипсина, необходимое для начала гидролиза альбумина для образцов сыворотках больных аденокарциномой яичника выше, чем для образцов сыворотки крови здоровых доноров..
-
С использованием гидролиз сывороток концентрациями трипсина около 10 мкМ, возможно получение MALDI-TOF-профилей, позволяющих различать образцы сыворотки больных аденокарциномой яичника и здоровых доноров.
Апробация работы.
Результаты работы доложены 3-ей Международной школе семинаре «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, апрель 2007) на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2007), 6-м Всемирном Конгрессе HUPO (Сеул, Корея, октябрь 2007), 38-ом Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ, FEBS (Санкт Петербург, июль 2013).
Публикация работы.
По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе, 10 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 1 патент на изобретение и 16 публикации в трудах конференций. Индекс Хирша автора равен 7.
Структура и объем диссертации
