Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Метаболиты триптофана в патогенезе эндогенных психических заболеваний 11
1.1.1. Серотонин и его метаболиты 16
1.1.2. Серотониновая гипотеза эндогенных депрессивных расстройств 21
1.1.3. Тромбоцитарный серотонин при депрессивных расстройствах 25
1.1.4. Кинуренин и его метаболиты 29
1.1.5. Воспаление и метаболизм триптофана 33
1.1.6. Активация кинуренинового пути при депрессивных расстройствах 35
1.2. Методы определения метаболитов триптофана 42
1.2.1. Методы определения серотонина 42
1.2.2. Методы определения кинуренинаи 3-гидроксикинуренина44
Заключение 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы 52
2.1. Реактивы и растворители 52
2.2. Оборудование 52
2.3. Исследуемые пациенты и добровольцы 54
2.4. Забор крови и получение плазмы 55
2.5. Метод определения серотонина в тромбоцитах крови человека 55
2.6. Метод определения кинуренина в плазме крови человека 57
2.7. Метод синтеза алкиловых эфиров метаболитов триптофана 59
2.8. Получение растворов НС1 в абсолютных спиртах з
2.9. ТСХ алкиловых эфиров метаболитов триптофана 60
2.10. MALDIOF масс-спектрометрия алкиловых эфиров метаболитов триптофана 61
2.11. MALDIOF масс-спетрометрическая детекция триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови 61
2.12. Статистическая обработка 62
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 63
3.1. Разработка метода определения серотонина в тромбоцитах крови человека 63
3.2 Апробация метода определения серотонина в тромбоцитах крови человека 67
3.3. Разработка метода определения кинуренина в плазме крови 71
3.4. Апробация метода определения кинуренина в плазме крови 75
3.5. Характеристика алкиловых эфиров метаболитов триптофана... 77
3.6. MALDIOF масс-спетрометрическая детекция триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови 84
Выводы 87
Список сокращений 89
Список литературы
- Серотониновая гипотеза эндогенных депрессивных расстройств
- Исследуемые пациенты и добровольцы
- Получение растворов НС1 в абсолютных спиртах
- Апробация метода определения кинуренина в плазме крови
Серотониновая гипотеза эндогенных депрессивных расстройств
Впервые серотонин был выделен в 1937 году из слизистой кишечника и охарактеризован Эрспамером В. и Виалли М. по способности сокращать гладкие мышцы и назван «энтерамином». Примерно в то же время Раппорт М. и соавторы выделили из сыворотки крови и охарактеризовали вещество, приводящее к сужению сосудов и повышению кровяного давления, и назвали его «серотонин» [29]. В дальнейшем структура выделенного серотонина была подтверждена химическим синтезом [30]. В 1953 году нейрофизиологи Пейдж И. и Твэрог Б. обнаружили серотонин в головном мозге [31]. Было показано, что серотонин в основном синтезируется и хранится в энтерохромаффинных клетках кишечника (около 95% всего серотонина в организме) [32], участвует в перистальтике кишечника и из кишечника поступает в кровь. Кроме того, серотонин синтезируется в нейронах головного мозга и участвует в передаче и модуляции нервного импульса. Серотонин играет роль нейромедиатора и нейромодулятора в центральной нервной системе, участвует в регуляции памяти, сна, поведенческих и эмоциональных реакциях. Нарушения в функционировании серотониновой системы головного мозга вовлечены в патогенез психических и неврологических заболеваний, среди которых депрессия [21], шизофрения [33], расстройства аутистического спектра [34,35] болезнь Альцгеймера [36], болезнь Паркинсона [37], боковой амиотрофический склероз [38] и другие.
Гидроксилирование триптофана до 5-гидрокситриптофана ферментом триптофан гидроксилазой (ТН) - первая стадия синтеза серотонина. Образование серотонина происходит за счет декарбоксилирования 5-гидрокситриптофана. Эта реакция катализируется ферментом декарбоксилазой ароматических L-аминокислот (AADC) с использованием пиридоксаль-5-фосфата (активная форма витамина В6) в качестве кофермента. Поскольку активность AADC примерно в 75 раз выше активности ТН, формирование 5-НТР с помощью ТН считается скорость-лимитирующей стадией [39]. Уровень синтеза серотонина зависит от активности ферментов НТ и AADC, а также от доступности триптофана как субстрата. В ряде работ было показано, что большие количества потребляемого с пищей триптофана повышают содержание серотонина в тканях, в то время как диеты с дефицитом триптофана приводят к снижению содержания серотонина [40,41]. Метаболизм серотонина Серотонин в организме метаболизируется различными путями: окислительным дезаминированием (моноаминоксидаза, МАО), конъюгацией с серной и глюкуроновой кислотами, N-ацетилированием, 5-0-метилированием и их комбинациями. Ферменты, катализирующие эти реакции, по-разному распределены между органами и тканями.
Большая часть серотонина метаболизируется флавопротеином моноаминоксидазой (МАО) [42]. Этот фермент, локализованный, прежде всего, на внешней мембране митохондрий, катализирует окислительное дезаминирование некоторых моноаминов до соответствующих альдегидов, аммиака и пероксида водорода. Известны, по меньшей мере, два типа моноаминоксидаз: МАО-А и МАО-В, различающиеся, прежде всего, по субстратной специфичности, органной локализации и ингибиторам. МАО-А высокоаффинна к серотонину, адреналину, норадреналину, мелатонину, гистамину, в то время как МАО-В более активна в дезаминировании бензиламина, фенилэтиламина и дофамина [43,44]. МАО-А локализована, главным образом, в клетках печени, желудочно-кишечном тракте и плаценте. МАО-В присутствует в тромбоцитах. Оба типа в значительном количестве присутствуют в нервной ткани - в нейронах и астроглии.
Продукт окислительного дезаминирования серотонина, 5-гидроксииндолацетальдегид, может, в свою очередь, окисляться до 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA) или распадаться до 5-гидрокситриптофола. Первая реакция является наиболее важной. Она катализируется альдегид дегидрогеназой с участием NAD в качестве кофермента. Альдегид дегидрогеназа обнаружена во многих тканях и органах, включая мозг и печень [43,45]. Распад 5-гидроксииндолацетальдегида до 5-гидрокситриптофола катализируется альдегид редуктазой. Этот фермент использует NADH в качестве кофермента. Формирование 5-гидрокситриптофола составляет около 1% от всего метаболизма серотонина в норме, однако, при алкоголизме и патологиях печени может происходить сдвиг от 5-HIAA в сторону 5-гидрокситриптофола [46-48].
Конъюгация серотонина с серной (с формированием серотонин-О-сульфата) или глюкуроновой кислотой (с формированием серотонин-О-глюкуронида) представляет малую ветвь его метаболизма. Оба типа конъюгатов детектировали в моче здоровых людей [49-52]. Серотонин и 5-HIAA выделяются с мочой преимущественно в свободной форме, в то время как 5-гидрокситриптофол экскретируется, в основном, в виде конъюгата [47]. Потребление серотонин-содержащих продуктов способно повышать выделение с мочой конъюгатов серотонина [53].
В процесс синтеза мелатонина (5-0-метил-М-ацетилсеротонин) в эпифизе вовлечены два высокоспецифичных фермента, катализирующих, в основном, N-ацетилирование и 5-О-метилирование серотонина. Мелатонин -гормон, принимающий участие в создании циркадного ритма, развитии репродуктивной системы, поведении [54,55]. Недостаточный синтез мелатонина и нарушение циркадных ритмов наблюдаются, в частности, у пациентов с депрессивными расстройствами [56,57].
Серотонин-М-ацетилтрансфераза была обнаружена как в мозге, так и в печени. В эпифизе ее функционирование отличается циркадной ритмичностью, что приводит к значительному повышению уровня мелатонина в плазме ночью [58]. Вторую стадию образования мелатонина катализирует гидроксииндол-О-метилтрансфераза. Этот фермент вызывает 5-О-метилирование N-ацетилсеротонина с участием S-аденозилметионина в качестве донора метильной группы [59].
Механизмы клиренса серотонина Как писалось выше, большая часть (примерно 95%) серотонина в организме находятся в энтерохромаффинных клетках ЖКТ, из которых может высвобождаться в кишечную полость и в кровь в результате воздействия симпатических или парасимпатических нервных стимулов, повышенного внутрикишечного давления и изменения рН [60]. Однако, поскольку серотонин - вазоактивный амин, приводящий к повышению тонуса сосудов, его повышенная концентрация в плазме крови может быть опасной. Поэтому в организме существуют механизмы быстрого клиренса серотонина из плазмы крови или его дезактивации, среди которых: захват серотонина тромбоцитами, связывание с транспортными белками плазмы [61], катаболизм серотонина в печени и легких.
Исследуемые пациенты и добровольцы
Наиболее прямые доказательства участия воспаления в патогенезе депрессивных расстройств вытекают из исследований, в которых иммуностимулирующие агенты вызывают депрессивные симптомы у пациентов и/или здоровых людей. Так, известно, что широко распространенное лечение гепатита-С с использованием IFN-a вызывает у более чем 50% пациентов депрессивные симптомы, которые сохраняются на протяжении всего курса терапии, однако, исчезают через короткий период времени после ее прекращения [5,6]. Интересно, что у этих пациентов терапия IFN-a усиливала метаболизм триптофана по кинурениновому пути, повышая отношение концентраций KYN/TRP, являющееся индикатором активности ШО [157]. Концентрация TRP, как правило, но не всегда [158], была понижена, а концентрация KYN повышена в образцах сыворотки крови пациентов с гепатитом-С во время терапии IFN-a. Изменение отношения KYN/TRP коррелировало с выраженностью симптомов депрессии и тревожности, оцененной по соответствующим шкалам: шкала Монтгомери 37
Асберга для оценки депрессии (MADRS), шкала депрессий Бека (BDI), шкала Гамильтона для оценки тревоги (HARS) [6].
Повышенние продукции кинуренина и снижение уровня триптофана наблюдается также у больных раком, проходящих лечение IFN-a. У этих пациентов также было выявлено повышение отношения KYN/TRP, которое коррелировало с ухудшением прогноза заболевания и развитием депрессивных симптомов [159].
У здоровых добровольцев стимуляция иммунной системы приводит к повышению продукции провоспалительных цитокинов и повышенному образованию кинуренина, связанному с симптомами депрессии [160].
Как было сказано ранее, в случае воспалительных реакций, активирующих IDO, наблюдается пониженная доступность серотонина для серотонергической нейротрансмиссии, что является патогенетическим фактором развития депрессивных расстройств.
Активация воспалительных реакций при депрессивных расстройствах приводит к повышению экспрессии не только основного фермента превращения триптофана в кинуренин - IDO, но и КМО - фермента, превращающего KYN в 3-гидроксикинуренин (3-ОНК), что, в свою очередь, может привести к смещению метаболизма кинуренина в сторону образования 3-ОНК и QUIN. Голландскими исследователями было высказано предположение, что дисбаланс между этими нейротоксическими метаболитами и нейропротекторной кинуреновой кислотой нарушает взаимодействие между нейронами и глией и может сделать нейроглиальную сеть более уязвимой к влиянию психоэмоционального стресса, что может приводить к хроническому течению депрессивных расстройств [161].
Нейротоксические метаболиты кинуренина могут вызывать апоптоз астроцитов и, в меньшей степени, нейронов, что ослабляет нейроглиальное взаимодействие и приводит к снижению синтеза нейротрофических факторов, таких как глиальный нейротрофический фактор (GDNF), мозговой нейротрофический фактор (BDNF) [162,163]. Гибель астроцитов может также нарушать превращение глутамата в глутамин ферментом глутаматсинтетазой, которое, как известно, происходит, главным образом, в астроцитах [164]. Это приводит к нарушению катаболизма глутамата в мозге, повышению его концентрации в синаптической щели и способствовует глутаматергической эксайтотоксичности (за счет гиперактивации NMDA рецепторов).
У нелеченных пациентов, страдающих депрессивными расстройствами, не принимавших лекарства, по крайней мере, 4 месяца, был показан дисбаланс между нейропротекторными и нейротоксическими ветвями кинуренинового пути с понижением концентраций нейропротекторных метаболитов. Соотношение между кинуреновой кислотой и кинуренином было достоверно ниже у депрессивных пациентов, чем у здоровых добровольцев. Более того, при шестинедельном лечении антидепрессантами, главным образом, селективными ингибиторами обратного захвата серотонина, метаболический дисбаланс кинуренинового пути не нормализовался. Поэтому авторы выдвинули гипотезу, что такой дисбаланс между кинуреновой кислотой и кинуренином может в дальнейшем вызывать нейродегенеративные изменения и способствовать хронификации болезни и появлению резистентности к терапии [165].
При некоторых формах тревожных расстройств выявлена повышенная концентрация кинуренина в плазме, а при депрессии она была понижена по сравнению со здоровыми донорами. После лечения эти показатели приходили в норму в обеих группах [19]. В этом исследовании концентрация кинуренина достоверно коррелировала с тяжестью тревожного расстройства. Результаты исследования показали, что повышение концентрации кинуренина в плазме может быть использовано как дополнительный критерий для дифференциальной диагностики тревожных расстройств с депрессивным настроением от эндогенной депрессии в клинической практике. Недавно проведенное исследование [166] на постмортальных образцах тканей мозга больных с депрессивными расстройствами и доноров по определению содержания в них хинолиновой кислоты, определяемой иммуногистохимическим методом, показало повышение ее концентрации в префронтальной области коры головного мозга больных. Подобное повышение уровня хинолиновой кислоты у больных наблюдалось также в области гиппокампа.
При депрессивных расстройствах существуют морфометрические свидетельства наличия нейродегенеративных изменений и гибели астроцитов [167]. Этим изменениям может способствовать повышение уровня токсических метаболитов кинуренина.
В работе [168] было выявлено повышенное отношение концентраций KYN/TRP в плазме, коррелирующее с уровнем ангедонии (снижение или утрата способности получать удовольствие) у подростков с депрессивными расстройствами. Более того, у детей с меланхолической депрессией отношения KYN/TRP, 3-HAA/KYN и уровень кинуренина были связаны с тяжестью депрессивных симптомов [169].
При депрессивных состояниях, связанных с цитокиновой терапией, например, с терапией IFN-a больных гепатитом С, наблюдается понижение концентрации кинуреновой кислоты (KYNA) (и повышение отношения концентраций KYN/KYNA) в сыворотке крови, коррелирующее с тяжестью депрессии [170]. Другое исследование выявило повышение уровней как KYNA, так и QUTN в цереброспинальной жидкости пациентов, принимающих IFN-a [171]; об отношениях между концентрациями метаболитов этих двух ветвей кинуренинового пути в исследовании не сообщалось. Тем не менее, оба исследования указывают на повышение уровня распада триптофана, изменение концентраций метаболитов кинуренина в ответ на терапию интерфероном-а и последующее возникновение депрессивных расстройств.
Получение растворов НС1 в абсолютных спиртах
Нами были подобраны условия (температура и время реакции, способ синтеза) и произведен синтез алкиловых эфиров метаболитов триптофана. Синтез алкиловых (метиловых, пропиловых, изобутиловых) эфиров 3-гидроксикинуренина проводился с целью повышения его стабильности в условиях пробоподготовки и анализа, а также при длительном хранении образцов путем защиты карбоксильной группы 3-гидроксикинуренина и протонирования аминогрупп. Полученные эфиры использовались в качестве стандартов для разработки аналитического метода. Синтез алкиловых (метиловых, пропиловых, изобутиловых) эфиров триптофана и кинуренина проводился с целью получения стандартов для разработки метода одновременного количественного определения триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в виде их алкиловых эфиров. Синтезированные соединения были охарактеризованы с помощью ТСХ и MALDIOF масс-спектрометрии.
Анализ методом тонкослойной хроматографии синтезированных алкиловых эфиров показал, что метиловые, пропиловые и изобутиловые эфиры получаются с количественными выходами или близкими к количественным. После проведения синтеза в реакционной смеси пятна 3-гидроксикинуренина на пластинке для ТСХ не было обнаружено.
Структура полученных эфиров подтверждалась масс-спектрометрически на MALDIOF масс-спектрометре (см. главу «Материалы и методы»). На масс-спектрах вышеуказанных алкиловых эфиров имелись высокоинтенсивные сигналы молекулярных ионов [М+Н]+ с незначительной фрагментацией.
На рисунке 13 приведена тонкослойная хроматограмма кинуренина (дорожка №1) и пропилового эфира кинуренина (дорожка №2). Процедуры проведения ТСХ и проявления хроматограмм описаны в главе «Материалы и методы». На хроматограмме видно, что выход пропилового эфира кинуренина близок к количественному и составляет не менее 95% (дорожка №2). После проведения синтеза в реакционных смесях не было обнаружено пятен исходных метаболитов триптофана. Аналогичные результаты получали для других эфиров.
На рисунках 14-16 приведены MALDIOF масс-спектры метилового, пропилового и изобутилового эфиров 3-гидроксикинуренина. На рисунках 17 и 18 приведены MALDIOF масс-спектры изобутиловых эфиров триптофана и кинуренина, соответственно.
В таблице 7 приведены основные хроматографические (Rf) и масс-спектрометрические (значение m/z молекулярного иона) характеристики синтезированных эфиров метаболитов триптофана. KYN-O-Pr KYN Рисунок 13. Тонкослойная хроматограмма кинуренина (дорожка №1) и пропилового эфира кинуренина (дорожка №2) в системе этилацетат:пиридин: уксусная кислота:вода:эфир (5:5:1:3:4, v/v/v/v/v) после проявления хлором и крахмал йодидом. Факторы удерживания (Rf) кинуренина и пропилового эфира кинуренина (KYN-O-Pr) составляют 0.52 и 0.82, соответственно. х1С и
MALDIOF масс-спектр изобутиловых эфиров триптофана (1, [М+Н]+=261.231), кинуренина (2, [М+Н]+=265.215) и 3-гидроксикинуренина (3, [М+Н]+=281.171) в плазме крови человека (объем нанесения: эквивалент 0,5 мкл плазмы крови). Полученные нами алкиловые эфиры могут быть анализированы не только с помощью MALDIOF масс-спектрометрии, (недостатками которой является дороговизна оборудования, а также сложность количественного определения), но также с помощью ВЭЖХ с масс-спкектрометрической детекцией. Так, в литературе описан ряд методов количественного определения аминокислот в виде алкиловых эфиров с помощью ВЭЖХ-МС [267,268]. Авторы отмечают высокую чувствительность масс-спектрометрического определения аминокислот в виде эфиров за счет повышения их сродства к протону и, соответственно, более эффективной ионизации, что позволяет использовать для анализа минимальный объем образца и делает эти методы перспективным для клинического скрининга, в том числе, скрининга новорожденных. Особенно стоит отметить опубликованный совсем недавно метод определения хинолиновой кислоты в сыворотке крови в виде ее дибутилового эфира с помощью ВЭЖХ-МС, обладающий очень высокой чувствительностью и требующей минимальное количество образца [269].
Стоит также упомянуть, что точность и воспроизводимость метода можно повысить за счет использования в качестве внутренних стандартов гомологичных эфиров соответствующих метаболитов триптофана ввиду их сходных физико-химических свойств.
В связи с вышеизложенным, в наших дальнейших исследованиях предполагается применение данного подхода для разработки метода одновременного количественного определения 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в плазме крови в виде их алкиловых эфиров с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией.
Таким образом, полученные нами алкиловые эфиры кинуренина, 3-гидроксикинуренина и триптофана могут быть использованы для MALDIOF масс-спетрометрической детекции этих метаболитов, но также являются первым шагом в разработке нового метода их количественного определения в плазме крови с помощью ВЭЖХ-МС.
Апробация метода определения кинуренина в плазме крови
В основе разработанного нами метода определения кинуренина в плазме крови лежит ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Подбор условий пробоподготоеки Были подобраны оптимальные условия для осаждения белков при пробоподготовке плазмы крови для определения кинуренина, обеспечивающие его дополнительную стабилизацию повышение выхода для анализа с помощью ВЭЖХ-МС. Степень извлечения кинуренина, измеренная для концентрации вносимого в плазму кинуренина 340 нг/мл, составила 68%. Оптимизация масс-спектрометрического детектирования
При разработке метода были оптимизированы условия МС детекции, позволяющие определять концентрацию кинуренина с высокой чувствительностью и специфичностью. Детектирование кинуренина проводилось с использованием ионизации электрораспылением (ESI) -способа ионизации, типичного для анализа таких полярных соединений как аминокислоты, к которым относится кинуренин. Определение вещества проводили при положительной полярности работы источника в режиме мониторинга заданных масс (MRM - multiple reaction monitoring). Режим MRM обеспечивает эффективность в отсекании фона и, как следствие, значительно снижает предел определения. Массы материнского и дочернего ионов определяли в режиме сканирования масс (рис. 8, 9, 10). В качестве дочерних ионов для MRM-детекции выбраны ион с m/z = 146.1, и m/z = 192.1, как демонстрирующие максимальный отклик. Параметры работы детектора подбирались для достижения максимального выхода MRM (209.0— 146.1 и 209— 192.1) (табл. 4). В этих условиях достигнута оптимальная чувствительность количественного определения кинуренина (0,1 мкмоль/л). Э
Масс-спектр стандартного раствора кинуренина, полученный в режиме сканирования с установленным диапазоном детекции 200 - 230 m/z. Зарегистрирован максимальный отклик сигнала масс-спектрометрического детектора для m/z=209.0, соответствующий родительскому иону кинуренина.
Масс-спектр стандартного раствора кинуренина, полученный в режиме сканирования после фрагментации исходного иона кинуренина (энергия столкновений 15В). Отсутствие сигнала в части спектра, соответствующей родительскому иону (m/z = 209), свидетельствует о полной фрагментации.
Был произведен подбор условий хроматографии (состав подвижной фазы, скорость элюирования, температура) для достижения максимального отклика кинуренина и приемлемого времени элюирования.
На рисунке 11 представлена типичная MRM масс-хроматограмма образца плазмы пациента. Пик кинуренина (tyji = 2,77) симметричный, отвечает гауссову распределению, без признаков размывания и раздвоения.
Полученная калибровочная кривая описывается уравнением у = 7,915 х х + 891,61 (где у - площадь хроматографического пика в относительных единицах; х - концентрация кинуренина, нг/мл) (рис. 12). Для пересчета концентрации в мкмоль/л кинуренина необходимо поделить полученное значение X на молекулярный вес кинуренина - 208,22.
Калибровочная кривая (зависимость концентрации кинуренина от величины площади масс-хроматографических пиков). Линейность калибровочной кривой в диапазоне концентраций 21,24 -679,81 нг/мл кинуренина демонстрируется коэффициентом достоверности аппроксимации R2=0,999. Правильность и точность (CV, коэффициент вариации) для каждого уровня на калибровочной кривой находились в приемлемых диапазонах (меньше 15%; меньше 20% для LOQ) (табл. 5). Предел количественного определения (LOQ) для кинуренина составил 0,1 мкмоль/л (21,2 нг/мл кинуренина) при значениях правильности и точности менее 20% (точность 3,7%; правильность 18,9%).
Апробация метода проведена на 14 образцах крови, полученных от пациентов с депрессивными расстройствами. Средняя концентрация кинуренина в плазме пациентов составила 1.63±0.54 мкмоль/л, что хорошо соотносится с литературными данными [165,246]. Диапазон полученных значений концентрации кинуренина составляет от 1,02 мкмоль/л до 3,11 мкмоль/л (табл. 6). Полученные результаты свидетельствуют о гетерогенности группы обследованных пациентов по концентрации кинуренина в плазме крови, что требует дальнейших исследований. Таблица 6. Результаты измерения концентрации кинуренина в плазме крови пациентов с депрессивными расстройствами.
Таким образом, нами был разработан метод количественного определения кинуренина в плазме крови, сочетающий простую и быструю стадию подготовки пробы с хроматомасс-спектрометрическим определением, обеспечивающим высокую чувствительность и селективность определения кинуренина. Разработанный метод является экспрессным, что позволяет проводить десятки анализов в день, используя небольшие объемы плазмы крови (200 мкл), что делает возможным его использование как для медико-биологических исследований, так и для рутинных клинических анализов. 3.5. Характеристика алкиловых эфиров метаболитов триптофана
Нами были подобраны условия (температура и время реакции, способ синтеза) и произведен синтез алкиловых эфиров метаболитов триптофана. Синтез алкиловых (метиловых, пропиловых, изобутиловых) эфиров 3-гидроксикинуренина проводился с целью повышения его стабильности в условиях пробоподготовки и анализа, а также при длительном хранении образцов путем защиты карбоксильной группы 3-гидроксикинуренина и протонирования аминогрупп. Полученные эфиры использовались в качестве стандартов для разработки аналитического метода. Синтез алкиловых (метиловых, пропиловых, изобутиловых) эфиров триптофана и кинуренина проводился с целью получения стандартов для разработки метода одновременного количественного определения триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в виде их алкиловых эфиров. Синтезированные соединения были охарактеризованы с помощью ТСХ и MALDIOF масс-спектрометрии.
Анализ методом тонкослойной хроматографии синтезированных алкиловых эфиров показал, что метиловые, пропиловые и изобутиловые эфиры получаются с количественными выходами или близкими к количественным. После проведения синтеза в реакционной смеси пятна 3-гидроксикинуренина на пластинке для ТСХ не было обнаружено.
Структура полученных эфиров подтверждалась масс-спектрометрически на MALDIOF масс-спектрометре (см. главу «Материалы и методы»). На масс-спектрах вышеуказанных алкиловых эфиров имелись высокоинтенсивные сигналы молекулярных ионов [М+Н]+ с незначительной фрагментацией
