Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Принципы и краткие сведения о существующих методах ранней диагностики стельности ...... 7
1. Методы диагностики по аллергической реакции 7
2. Определение стельности по физико-химическим свойствам молока 9
3. Методы диагностики с помощью химических реакций 11
4. Методы определения стельности по физическим свойствам цервикального секрета 5. Гормонально-биологические методы определения стельности 15
6. Другие методы v 18
Глава II. Особенности набора и свойств белков сыворотки крови при беременности и других формах роста. . 21
1. ОС -глобулины 21
2. глобулины 28
3. Иммуноглобулин & , общая характеристика. . . 34
4. Иммуноглобулин G- , крупного рогатого скота . 36
5. 00& при процессах роста 38
Экспериментальная часть
Глава III. Объект и методы исследования 47
1. Объект исследования 47
2. Методы исследования 47
Глава ІV. Изучение белкового спектра сыворотки крови телок и нетелей 60
1. Ионообменное хроматографирование сыворотки . 60
2. Иммуноэлектрофорез белков сыворотки крови ; телок и нетелей. 63
Глава V. Изучение действия кислой среды на белки сыворот ки крови телок и нетелей 67
1. Потенциометрическое титрование сыворотки крови телок и нетелей . . 67
2. Выяснение природы белка сыворотки крови нетелей, агрегирующего при рН 0,68 71
3. Выделение белкового комплекса из протитрованного солянокислого раствора сыворотки
крови нетелей 74
4. Изучение агрегата и образующих его белков, с помощью иммунологических и физико-химических приемов 77
Глава VI. Некоторые физико-химические свойства характерного для стельности 89
1. Дифференциальный спектр 89
2. Молекулярная масса и константа седиментации 90
3. Определение аминокислотного состава Jc(r , характерного для стельности 98
Глава VII. Теоретические результаты работы - основа для разработки метода ранней диагностики стельности у нетелей . 103
1. Изучение действия кислот на рН агрегации Оов , характерного для стельности .... 104
2. Температурный режим 106
3. Определение оптимального времени регистрации результатов метода 108
4. Описание метода диагностики стельности . . 110
Глава VIII. Лабораторная и производственная проверка метода
1. Лабораторная проверка метода 113
2. Апробация метода в производственных условиях
Общие выводы 118
Список использованной литературы Ш
- Методы диагностики по аллергической реакции
- ОС -глобулины
- Объект исследования
- Потенциометрическое титрование сыворотки крови телок и нетелей
- Дифференциальный спектр
Введение к работе
Продовольственная программа, принятая Майским /1982 г. / пленумом КПСС, поставила задачу широкой интенсификации всех отраслей сельского хозяйства и, прежде всего, животноводства. Эта отрасль стала более целеустремленно перестраиваться в сторону специализации и концентрации поголовья на отдельных комплексах. Однако специализация и концентрация не гарантирует повышения эффективности животноводства и увеличения выхода ее продукции без тщательной отработки вопросов технологии, от воспроизводства поголовья животных до получения животноводческой продукции.
Одним из условий успешного развития специализированного животноводства и, в частности, скотоводства, является интенсификация оборота поголовья животных, что невозможно без подъема на более высокий уровень системы воспроизводства. Только интенсивная отбраковка, с заменой выбывших животных высокопродуктивным ремонтным молодняком, может обеспечить повышение экономических показателей скотоводства. Это накладывает на сферу воспроизводства особую роль, выполнение которой зависит от разработки новой технологии воспроизводства, учитывающей условия и задачи современного скотоводства. Наряду с другими, лимитирующим фактором, определяющим успех воспроизводства животных является ранняя диагностика стельности.
В настоящее время существует немало методов ранней диагностики стельности. Однако по тем или иным причинам они не находят широкого применения в производственной практике. Основным методом диагностики стельности по-прежнему является ректальное исследование, с помощью которого можно обнаружить стельность лишь к 2-месячному сроку, а сам метод негигиеничен, исключительно трудоемок и требует высокой квалификации ветеринарных специалистов.
Все это и диктует необходимость поиска нового метода ранней диагностики стельности. Материалом для такого поиска может быть прежде всего кровь, которую можно назвать своеобразным "зеркалом", отражающим как физиологические, так и патологические состояния организма. За последнее время накоплено много фактов, указывающих на появление в крови животных и человека при процессах роста и, в частности, при беременности особых белков.
В связи с этим, задачей настоящей работы явилось изучение белков сыворотки крови нетелей с тем, чтобы на основе полученных результатов разработать новый метод диагностики стельности путем модификации осадочной реакции на стельность для повышения ее эффективности и доступности постановки в любой ветеринарной лаборатории. Теоретической предпосылкой для поисков белков-маркеров физиологического роста помимо всего явились данные других авторов об Лр-маркере злокачественного роста и, в частности, сведения об иммуноглобулине и , появляющемся в крови крупного рогатого скота при лейкозе на фоне общего повышения уровня белков этого класса.
В ходе исследований были использованы-такие методы ;"изучения белков как ионообменная хроматография-, иммуноэлектрофорез, электрофорез на различных поддерживающих средах, ультрацентрифугирование, спектроскопия. Применение этих и других методов позволило показать, что в крови нетелей, в отличие от крови телок, циркулирует особая популяция молекул иммуноглобулина (? , образующая при определенном рН белковый комплекс с сывороточными (X. -глобулинами. Установлено, что эта популяция молекул иммуноглобулина и , получившая название Jg G , характерный для стельности, отличается от иммуноглобулина и телки не только по зоне рН образования комплекса, но и по другим параметрам, в частности, по молекулярной массе, аминокислотному составу, структуре и конформации, что свидетельствует о ее уникальности.
Изучение свойств иммуноглобулина 1т , характерного для стельности, позволило разработать новый метод ранней диагностики беременности у нетелей, точность которого по группе стельных животных - 92,9%, по нестельным - 89,2%.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и предложений производству и списка основной использованной литературы.
Методы диагностики по аллергической реакции
Рассматриваемые в этом разделе методы диагностирования основаны на том факте, что в кровь стельных животных попадают продукты жизнедеятельности плода, в составе которых находятся фрагменты или целые молекулы белка, которые являются "чужеродными" для организма матери. Их проникновение вызывает появление специфических антител, то есть иммунизацию и сенсибилизацию организма матери. Такой сенсибилизированный организм буцет отвечать на введение даже малых доз этих белков аллергической реакцией /98/.
Аллергены, необходимые для проведения диагностических реакций, получают путем расщепления белков плода химическим и ферментативным гидролизом. Полученный гицролизат разводился до титра, вызывающего аллергическую реакцию только у стельных животных и не вызывающего ответной реакции у не стельных. Раститрованный аллерген вводится подкожно в области подхвостовой складки или в области средней трети шеи. Реакция читается через определенное время после введения по величине утолщения кожи в месте инъекции аллергена.
Более точные результаты /18/ дало использование аллергена, полученного путем химического гидролиза белков околоплодных вод и плаценты.
В качестве аллергена использовалась и сыворотка крови новорожденных телят /23/, подвергнутая неполному кислотному гидролизу. Результаты исследований показали, что достоверность метода нарастает с увеличением сроков беременности и становится максимальной к двум месяцам стельности. В целом же по группе стельных коров при исследовании 360 голов получено 86$ правильных ответов. У большинства животных после растела положительная аллергическая реакция на стельность сохраняется и после растела, и исчезает по мере увеличения послеродового периода. По группе нестельных коров точность реакции составила К.Братанов и сотр экстрагировали белки из тканей плаценты и плода. После добавления к экстракту некоторых химиопрепа-ратов они получали аллерген Р-70, который вводили внутрикожно в области средней трети шеи. Реакция учитывалась визуально в интервале 15-30 минут после введения. Положительная реакция характери-зовалась плоским отеком со строго очерченными границами в ввде вала. Было отмечено, что сильно выраженная реакция наблвдалась у коров с длительным периодом бесплодия, то есть имели место неспецифические реакции. По данным авторов точность диагностики по группе стельных животных в период с 21 по 60 день беременности составила 93,3$5, а свыше 60 дней - 100% правильных ответов.
Однако Кононов Г.А. и сотр. /34/ после производственного испытания аллергена Р-70 пришли к выводу о недостаточной точности предлагаемого метода.
Таким образом, длительность нарастания сенсибилизации организма при наступлении стельности, продолжительная следовая реакция в послеродовом периоде, повышенная кожная чувствительность у отдельных животных и трудность серийного производства аллергена не дали возможности использовать метод в широкой производственной практике.
ОС -глобулины
Исследования, проведенные А.В.Азявчиком / 5 /, показали, что при фракционировании сыворотки крови беременных женщин в крахмальном геле, во фракции о(2-глобулинов выявлено три дополнительных компонента, а во фракции о(-глобулинов - один дополнительный компонент по сравнению с фракциями сыворотки, полученной от здоровых небеременных женщин. При электрофорезе на крахмальном геле экстрактов плаценты обнаружены белки, сходные по электрофоретической подвижности с дополнительными белками сыворотки крови беременных.
К о( -глобулинам относится также и белок, обнаруженный StwsonMH. /276/. из сыворотки крови беременных женщин им была выделена дополнительная субфракция 0(2-глобулинов, дающая линию преципитации при иммуноэлектрофорезе с антителами против сыворотки крови беременных женщин, и не реагирующий со стандартной антисывороткой. Этот белок, по данным автора, специфический для беременности, был изучен более детально. Его молекулярная масса равна 506 000, известен также аминокислотный и углеводный состав, функции и механизм его появления остаются невыясненными.
У беременных животных также наблюдается появление дополнительных белков при беременности. В зоне -глобулина сыворотки крови беременных крыс было найдено четыре дополнительных белковых компонента /62/.
Что касается источников появления специфических для беременности антигенов в крови животных, то некоторую ясность в этот вопрос внесли работы & tup Pes . й /273/, который очистил и частично охарактеризовал антиген, связанный с беременностью у овец. Исследователь определил, что очищенный антиген представлен двумя фракциями с молекулярной массой 42 600 и 17 400, свидетельствующими о наличии мономерной и димерной его форм. По электрофоретической подвижности антиген, связанный с беременностью близок к о(-глико-протеицам. Автор поддерживает гипотезу, что у беременной овцы включается в действие антилютеолитический механизм, который, возможно, включает образование водорастворимого белка высокой молекулярной массы при имплантации зиготы, выдвинутую работами ряда исследователей /226,258/. Этот антиген был также обнаружен Сіііш М /157/ в трофобласте и эритроцитах. Staples / /274/ отмечает некоторое сходство между открытым им антигеном, связанным с беременностью овец, макроглобулином, связанным с беременностью у человека /275/ и белком "зоны беременности человека" /288/.
Факт появления в сыворотке крови ассоциированных с беременностью (Х-гликопротеидов подтверждается и другими работами /217, 203/. Авторы последней не только четко идентифицируют выделенный, ассоциированный с беременностью белок, как ос2-гликопротеин, но и отмечают возрастание его концентрации при злокачественных новообразованиях.
Объект исследования
Исследования проводились на животных черно-пестрой породы-совхоза "Требуховский" Броварского района Киевской области. Хозяйство благополучно по инфекционным заболеваниям и лейкозу.
Объектом исследований служила сыворотка крови клинически здоровых телок случного возраста и нетелей с различными сроками беременности.
Перед взятием крови проводилось тщательное акушерско-гинеко-логическое исследование телок для установления сроков стельности или ее отсутствия, функциональных расстройств и патологии половой сферы. В случае ранних сроков стельности проводились повторные исследования. Сроки стельности в днях уточнялись по записям осеменений в журналах регистрации.
Отбор крови проводился на протяжении года в стойловый и пастбищный периоды. Кровь бралась из яремной вены. Для получения сыворотки проба крови отстаивалась при комнатной температуре. Сгустки отделялись от стенок пробирки стеклянной палочкой После образования сгустка сыворотка отбиралась в пробирки и центрифугировалась в течение 10 минут при 2-8 тыс.об/мин. Гемолиз ированные и липоид-ные сыворотки в опытах не использовались.
2. Методы исследований
Для проведения эксперимента использованы современные методы получения и очистки препаратов сывороточных, белков и отдельных белковых фракций с целью изучения их физико-химических, биологических, иммунологических и других свойств.
Ионообменная хроматография
При получении белковых фракций сыворотки крови стельных и нестельных животных, разделении белковых комплексов, полученных кислотным титрованием сыворотки крови беременных животных использовался метод ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 средний, шведской фирмы "Фармация", с размером гранул Ю0-270мкм.
С целью подготовки ионообменника необходимое количество сухого адсорбента суспендировалось в дистиллированной воде и оставлялось для набухания на Ї-2 часа. После этого суспензия трижды декантировалась с промежутками между сливом неосевших мелких частиц /то есть временем отстаивания/ в 20 минут. Суспензия фильтровалась на воронке Бюхнера и промывалась 0,5 М раствора Null, Следующим этапом подготовки ионообменника было многократное промывание дистиллированной водой до нейтральной реакции-фильтрата. Затем сефа-декс обрабатывался 0,5 М раствором соляной кислоты и вновь промыв вался водой до нейтральной реакции фильтрата.
Потенциометрическое титрование сыворотки крови телок и нетелей
Метод потенциометрического титрования был отработан группой авторов на сыворотке людей, больных злокачественными опухолями /27,81/. Параметры, определяющие режим реакции на злокачественные опухоли человека, были взяты за основу работы. В процессе работы был использован рН-метр ЭВ-74, с подключенной к нему магнитной мешалкой для постоянного перемешивания реакционной смеси. Опыты с сывороткой крови телок и нетелей показали отсутствие агрегации белка в зоне рН, установленной для сыворотки крови лвдей со злокачественными опухолями. Такие результаты не исключали того, что в крови нетелей может циркулировать белок, адекватный антителам, но с другой зоной рН агрегации.
Для того, чтобы проверить выдвинутое выше предположение, было проведено титрование сыворотки крови телок и нетелей в диапазоне рН от 0,69 до 0,49. Степень опалесценции контролировалась по определению оптической плотности реакционной смеси на фотоэлектро-колориметре с зеленым светофильтром.
Дифференциальный спектр
В результате выделения гомогенного препарата Job- ( характерного для стельности, была получена возможность изучить некоторые его физико-химические свойства. Прежде всего был снят дифференциальный спектр поглощения субфракции Лс& , характерного для стельности, на фоне JoB- телки в ультрафиолетовом диапазоне,представленный на рисунке 18.
Анализ кривой показывает, что по сравнению со спектром \Jfyb нестельного животного /84/ появляется дополнительный максимум при длине волны излучения 275 нм. Это свидетельствует о наличии особенностей структуры JQv , характерного для стельности, по сравнению с JQtf" телки.
2. Молекулярная масса и константа седиментации
В дальнейшем была определена молекулярная масса исследуемой субфракции с помощью метода тонкослойной хроматографии на сефа-дексе G-200 в присутствии белков-свидетелей с известной молекулярной массой.
После нанесения в точки стартовой линии, белки сразу же начали элюировать с током буфера. Выбранный носитель позволяет разделить сферические белковые молекулы, а иммуноглобулины имеют приблизительно сферическую форму, по. их размерам.
В качестве свидетелей-маркеров были взяты следующие белки: альбумин, папаин, 6$ сыворотки крови телок и ферритин. По наиболее удавшимся репликам, одна из которых представлена на рис. 19, были сделаны измерения расстояний, пройденных белками за определенное время.
Точками отсчета были наиболее удаленные от стартовой линии точки фронтального края проявленных пятен элюируемых белков. Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунке 20.
По построенному графику находим, что белок, прошедший за время элюции расстояние в 118 мм /точка 2/, а это и есть исследуемая субфракция J0(7 , характерного для стельности, имеет координаты по оси абсцисс, соответствующие 5,17. Эта величина является десятичным логарифмом от I4I253. Таким образом, величина искомой молекулярной массы субфракции JOu , характерного для стельности, составляет I4I000.
