Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Биохимия и молекулярная биология IgG представителей семейства куньих
1.2. Препаративная и аналитическая биохимия выделения IgG 22
1.3. Биохимические основы биотехнологических нововведений для обеспечения инфекционной и биологической безопасности иммуноглобулинов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 41
2.1. Оборудование и реактивы 41
2.2. Получение плазмы (сыворотки) крови 42
2.3. Биохимические методы 43
2.4. Иммунологические методы 43
2.5. Микробиологические методы 44
2.6. Способы расчета показателей 45
2.7. Статистическая обработка результатов 46
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3. Схема выделения и сравнительное изучение гомологии IgG человека и животных
3.1. Получение видовых IgG 48
3.2. Разработка лабораторного набора для определения IgG норки 58
3.3. Исследование антигенной структуры видовых IgG в гомологичной системе анализа (IgG норки - анти-IgG норки)
4. Прикладная биохимия фракционирования плазмы (сыворотки) 84
крови норки с целью получения биопрепаратов на основе IgG
4.1. Способ получения и хранения фракции IgG из плазмы (сыворотки) крови
4.2 Характеристика IgG фракции, полученной с помощью риванола 90
4.3. Характеристика IgG фракции, полученной с помощью каприловой кислоты
4.4. Изучение инфекционных и антигенных свойств 97 экспериментальных серий иммуноглобулинового биопрепарата
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 99
ВЫВОДЫ 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В 21 веке стало понятно, что 1014 клеток человеческого организма, в т.ч. организмы высших млекопитающих, представляют собой регулируемую биологическую систему, воспринимающую внеклеточные сигналы от лигандов белковой, пептидной или биоорганической природы. При этом белки-регуляторы как управляющие сигналы обладают множественной спецификой в отношении клеток-мишеней. Так, например, трансферрин помимо функции белка-переносчика имеет свойство фактора роста. Полагают, что практически всем белкам присущ такой множественный регуляторный эффект, за исключением антител [Зинченко с соавт., 2003]. С этих позиций актуальный интерес представляет международный исследовательский проект «Протеом плазмы крови». Наличие в составе плазмы от 3020 до 9504 индивидуальных белков позволяет рассматривать этот сложный коллоидный раствор как обобщенную многофакторную субстанцию, в которой только иммуноглобулины имеют четко выраженную направленность в отношении чужеродной генетической информации [States D.J., et al, 2006; Omenn G S.,. 2006].
Изложенное выше имеет непосредственное отношение к прикладным исследованиям и научно-техническим разработкам биотехнологического характера. В частности, к описанию в объективных количественных критериях качества гемостатических, иммуноглобулиновых, комплексных, ферментных биопрепаратов, производство которых базируется на получении целевых белков из тканей и органов животных и человека. Отметим, что международный исследовательский проект «Протеом плазмы крови» касается, прежде всего, изучения структуры-функции и физиологической активности белков человека. В отдаленном будущем новые сведения о физиологической активности белков плазмы будут учитываться при проектировании технологий и соответствующих фармакопейных стандартов или технических условий. В настоящее время такого рода фундаментальной информации нет. Из-за отсутствия основополагающей фактологии в фармакопейных стандартах либо ТУ вносятся разного рода неопределенности, касающиеся наличия примесных белков с неопределенными физиологическими свойствами. Например, в составе медицинских иммуноглобулинов допускается 2-3 белка не иммуноглобулииовой природы в качестве примесей. В иммуноглобулиновых препаратах ветеринарного назначения в описательной части ТУ допускается присутствие практически всех белков плазмы (сыворотки), включая альбумин.
В соответствии с содержанием ФС, ФСП и ТУ в части, касающейся требований, предъявляемых к белковому спектру иммуноглобулиновых биопрепаратов, можно выделить два научно-теоретических направления, обеспечивающих реальное качество прошлых и современных биотехнологических нововведений. Первое направление в современных условиях, по сути, нацелено на неопределенное расширение нормативно-технической (приборно-методической) базы с целью обеспечения, биологической безопасности иммуноглобулиновых биопрепаратов с гетерогенным электрофоретическим спектром примесных белков, имеющих неопределенные физиологические свойства. Второе направление целесообразного развития науки и научно-технических разработок в области Фарминдустрии базируется на создании принципиальных технологических схем, позволяющих производить гомогенные в электрофорезе субстанции целевых белков. Именно это направление науки и технологии позволяет совершенствовать прикладную биохимию для обеспечения биологической безопасности конечной продукции. Имеется в виду контролировать в составе биопрепаратов предельно-допустимые концентрации физиологически активных белков. Полагаем, что достаточно общая информация, согласно которой «целевой белок биопрепарата должен иметь надлежащий уровень очистки и нативную конформацию» необходимо в качестве требований заложить в ФС, ФСП и ТУ. Предлагаемая конкретика, по нашему мнению, должна сводиться к решению прикладных задач биохимии и разработке производственных технологий, позволяющих достигать хотя бы 80% уровня чистоты целевого белка. При наличии примесных белков в объеме не более 20% еще возможно адаптировать методы аналитической биохимии к выявлению в составе конечной продукции нежелательную физиологическую активность и совершенствовать прикладную составляющую биохимии технологических нововведений.
В информации фундаментального и прикладного характера обсуждается состав иммуноглобулиновых биопрепаратов, производимых промышленным способом из плазмы (сыворотки) крови человека и животных. На основании фундаментальных представлений о роли антител в элиминации бактерий в составе IgG полагают целесообразным присутствие IgM [Garbett et al., 1989; Werdan et al., 1996]. Структурно-функциональные особенности IgA и его присутствие в составе иммуноглобулиновых биопрепаратов также учитывается прикладной наукой при проектировании научно-технических нововведений в технологии фракционирования плазмы (сыворотки) крови [Wadsworth et al., 1976]. Вместе с тем медицинской генетикой выявлены индивидуальные особенности, согласно которым в человеческой популяции всегда присутствуют отдельные индивидуумы, неспособные к биосинтезу IgA. В клинической практике такое генетическое своеобразие выявляется по биосинтезу антител, специфичных к IgA, после парэнтерального введения иммуноглобулина, в составе которого присутствует IgA [Eijkhout et al., 2003].
Известно, что олигомеры индивидуальных белков, в частности IgG, способны к активации системы комплемента [Boughton et al, 1990; Nachbaur et al., 1997]. Опубликован целый ряд работ о фракционировании плазмы с целью обеспечения инфекционной безопасности конечного продукта [Burnouf et al., 2000; Horowitz et al, 2004; Панов, 2004; Klein et al. 2005]. Однако процессы инактивации инфекционных агентов, как правило, влияют на конформацию белка, что в конечном итоге выражается в олигомеризации и фрагментации молекулы IgG [ Hetherington et al, 1984; Le Moli et al., 1989]. С точки зрения экономических подходов актуальным вопросом является изучение возможности использования межвидовых субстанций IgG в клинической практике с минимизированным и нежелательным (антитело-индуцирующим) эффектом. К настоящему времени стало возможным компьютерно-аналитическое сопоставление нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, кодирующих и составляющих IgG млекопитающих, в т.ч. на уровне выявление межвидовых особенностей их строения [Naumoff, 2005; Finn et al.,. 2006; Abhiman et al., 2006]. Однако для практической биохимии методы информатики имеют определенные ограничения. Во-первых, невозможно однозначно предсказать ориентацию экспонированных участков пептидных цепей IgG, поскольку проблематика фолдинга до настоящего времени не полностью раскрыта [Dill et al., 2007; Moore, 2007]. Во-вторых, при сопоставлении нуклеотидных последовательностей геномов не учитываются посттранскрипционные модификации и последствия, обусловленные белок-денатурирующим эффектом, присущим схемам выделения и очистки IgG. Следовательно, актуален прямой иммунохимический подход, позволяющий по совокупности эпитопов проводить сравнительный анализ видовых IgG. Очевидно также, что схема выделения образцов IgG должна обеспечивать препаративную наработку индивидуальных белков без использования агентов и приемов, обладающих денатурирующим эффектом.
С учетом изложенного, экспериментальная составляющая работы представлена нижеследующими взаимовложенными направлениями:
- получение электрофоретически гомогенных и хроматографически мономерных образцов видовых IgG для определения олигомеров и фрагментов целевого белка в составе иммуноглобулиновых биопрепаратов, производимых промышленными предприятиями России;
- создание схемы анализа видовых IgG для совершенствования научно-практических представлений об антигенных характеристиках белков, включая уровень иммунологического сходства близкородственных IgG; - совершенствование препаративной и аналитической биохимии для получения IgG в заводских условиях с учетом требований производственного характера. Цель и задачи исследования.
Цель - изучить в сравнительном аспекте IgG куньих для разработки технологии производства иммуноглобулинового биопрепарата с надлежащим уровнем инфекционной и биологической безопасности.
В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
- Разработать лабораторную схему получения электрофоретически гомогенных IgG человека и животных без олигомеров и фрагментов для обеспечения контроля качества производственных серий иммуноглобулиновых биопрепаратов.
- Изготовить иммунореагенты и оптимизировать анализ для выявления антигенных свойств видовых IgG, включая образцы из семейства куньих, и определения IgG норки в составе технологических полупродуктов.
- Апробировать приемы дробного фракционирования плазмы крови норки в заводских условиях и создать принципиальную биохимическую основу для выпуска экспериментальных серий препарата «Иммуно Н». Научная новизна.
Разработаны оригинальные схемы выделения видовых IgG и условия их хранения с минимальным уровнем (до 3%) образования олигомерных форм индивидуальных белков.
Создана исследовательская схема для оценки антигенных свойств IgG близкородственных видов.
Определены приемы крупномасштабного фракционирования гемолизной плазмы (сыворотки), полученной из трупной крови норки, при которых сохраняется нативная конформация IgG. Подобраны условия и определены концентрации риванола и каприловой кислоты, позволяющие проводить очистку IgG из полуфабриката, обогащенного целевым белком.
Отсутствие передачи вирусного начала в составе иммуноглобулинового биопрепарата «Иммуно Н» подтверждено клинико-лабораторными исследованиями экспериментальных серий, изготовленных из инфекционно-опасного сырья.
Практическая значимость.
Результаты исследований легли в основу разработки нормативно-технической и технологической документации на изготовление экспериментальных серий препарата «Иммуно Н», ее согласование и утверждение в соответствии с порядком, действующим в Российской Федерации:
- технические условия (ТУ 9382-003-43683877-03) на препарат «Иммуно Н», 27 стр.;
- экспериментально-производственный регламент на технологию производства фармацевтического биопрепарата «Иммуно Н», №001515-ОП,300стр.;
- наставление по применению препарата «Иммуно Н» для норок № 13-4-03/0692; № 001515-ОП от 06.03.03 г., 2 стр.
На пилотный проект по производству экспериментальных серий препарата «Иммуно Н» был получен федеральный аттестат № 886 от 02.04.03 г. Из экспертного заключения ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») следует, что по показателям качества экспериментальные серии препарата «Иммуно Н» аналогов в России не имеют. Результаты проведенных исследований по разработке схем получения стандартизованных форм видовых иммуноглобулинов заложены в проект «Инструкции по изготовлению и контролю видовых IgG человека и животных». В настоящее время материалы и натуральные образцы проходят согласование и испытания в ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»).
На предложенный способ хранения и получения IgG-обогащенной фракции для изготовления биопрепаратов крови выдан патент на изобретение №2338375 «Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов».
Положения, выносимые на защиту:
- Разработка биохимических основ получения электрофоретически гомогенных форм IgG без олигомеров и фрагментов необходима для целесообразного развития нормативно-технической (приборно-методической) базы и обеспечения биологической безопасности иммуноглобулиновых биопрепаратов.
- Выявление уровня иммунологического сходства видовых IgG является основой для создания перспективной технологии производства гетерологичных иммуноглобулинов с надлежащим уровнем биосовместимости.
- Совершенствование подходов препаративной и аналитической биохимии в условиях крупномасштабного фракционирования плазмы (сыворотки) крови представляет собой одну из составляющих обеспечения инфекционной и биологической безопасности производства иммуноглобулиновых биопрепаратов.
Апробация работы.
Результаты исследований представлены на Региональной конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, 20-21 сентября 2001 г., г. Ижевск; на Международной конференции «Биотехнология на рубеже тысячелетия», 12-15 сентября 2001 года, г. Саранск; на 5-ой Российской укиверситетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2001 г.; на 6-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2003 г.; на II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика - 2005", г. Москва, 2005 г.; на І съезде физиологов СНГ, г. Сочи, 2005 г.; на Международной конференции инженерного образования, 25-29 июля 2005 г., г. Гливиц (Польша); на II Всероссийском форуме «Здоровье нации - основа процветания России», г. Москва, 2006 г.; на Второй международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», г. Санкт-Петербург, 2006 г.; на XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии», г. Уфа, 2006 г.; на Третьей международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», г, Санкт-Петербург, 14-17 марта 2007 г.; на Четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», г. Санкт-Петербург, 2-5 октября 2007 г.; на-VI конференции иммунологов Урала, г. Ижевск, 2007 г.
Публикации результатов исследований.
По материалам диссертации опубликовано 10 работ. В соответствии с порядком, действующим в РФ, разработан, согласован и утвержден комплект нормативно-технической и технологической документации на производство экспериментальных серий иммуноглобулинового препарата нового поколения «Иммуно Н»: технические условия на препарат «Иммуно Н» (ТУ 9382-003-43683877-03, 27 стр.), экспериментально-производственный регламент производства на препарат «Иммуно Н» (№001515-ОП, 300 стр.) и наставление по применению препарата «Иммуно Н» (№ 13-4-03/0692; № 001515-ОП, 2 стр.).
Структура и объем диссертационной работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах, содержит 10 рисунков и 19 таблиц. Список используемой литературы включает 185 источников, в том числе 154 иностранных, имеется приложение.
