Введение к работе
Актуальность проблемы.
Оксидативный стресс является одной из универсальных форм ответа организма на
воздействие неблагоприятных экзогенных и эндогенных факторов и играет
существенную роль в патогенезе воспалительно-дистрофических,
нейродегенеративных, сердечнососудистых и онкологических заболеваний и ускорении процессов старения живых организмов [Arts et al., 2005; Skulachev, 2007; Knasmuller et al., 2008]. Оксидативный стресс сопряжен с избыточной продукцией активных форм кислорода (АФК). Основная роль в защите биомолекул от действия АФК принадлежит экзогенным и эндогенным антиоксидантам [Frankel et al., 2008].
В настоящее время известен широкий спектр природных и синтетических экзогенных антиоксидантов, поступающих в организм с пищей. При этом природные антиоксиданты обладают рядом преимуществ по сравнению с синтетическими, включая отсутствие побочных и кумулятивных эффектов, а также более низкую токсичность.
Основными классами природных антиоксидантов являются каротиноиды, тиолы, фенольные соединения и пептиды. В литературе описаны последовательности более 100 антиоксидантных пептидов, выделенных из различных источников, а также полученных при конверсии белков с использованием ферментов и / или микроорганизмов [Dziuba et al., 2007; Sarmadi et al., 2010]. Наличие остатков редокс-активных аминокислот (Туг, Tip, Met, Cys, His) является важным структурным дескриптором антиоксидантных пептидов [Saito et al., 2003; Sarmadi et al., 2010]. Однако механизмы их антиоксидантного действия остаются недостаточно изученными.
Для разработки обоснованной стратегии поиска перспективных пептидных антиоксидантов необходимо исследование механизмов их взаимодействия с АФК и модельными свободными радикалами. Несмотря на различия в химической структуре антиоксидантов, ключевыми механизмами их взаимодействия с АФК являются донирование атома водорода (ДАВ) или донирование электрона (ДЭ). Тем не менее, антиоксидантные эффекты большинства соединений реализуются по смешанному механизму: последовательное донирование электрона с депротонированием (ПДЭД) или последовательное депротонирование с донированием электрона (ПДДЭ) [Barclay et al., 2003; Justino et al., 2010]. Образующиеся интермедиаты зачастую могут вступать во взаимодействие друг с другом и /или во вторичные реакции со свободными радикалами, что вносит вклад в наблюдаемый антиоксидантный эффект и создает дополнительные сложности при анализе экспериментальных данных.
Расчетные квантово-химические методы являются эффективным инструментом для изучения механизмов взаимодействия антиоксидантов со свободными радикалами и позволяют выявить молекулярные (структурные) и электронные дескрипторы, определяющие антиоксидантные свойства различных классов соединений. Благодаря применению полуэмпирических расчетных методов, в последнее время были выявлены структурные особенности флаваноидов, обуславливающие их антиоксидантные свойства, включая степень планарности молекулы, взаимное расположение фенольных гидроксильных групп, стабилизационные эффекты за счет делокализации неспаренного электрона при образовании феноксильных радикалов [Russo et al., 2000; Lemanska, et al 2001; Justino et al., 2010]. Однако, исследования такого рода для пептидов отсутствуют, что обуславливает актуальность соответствующих структурно-функциональных исследований.
При структурно-функциональном подходе параллельно с расчетом молекулярных и электронных дескрипторов необходимым этапом является характеристика антиоксидантных свойств пептидов in vitro. В настоящее время описано более 40 различных методов для тестирования антиоксидантов in vitro [Huang et al., 2005;
Shibamoto et al., 2009]. Их классификация базируется на ключевом механизме взаимодействия различных радикалов с тестируемыми антиоксидантами. Широко используемыми для характеристики природных антиоксидантов in vitro, являются методы гашения катион-радикала АБТС (2,2'-азино-бис-(3-этил-бензтиазолин-6-сульфонат) (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity - ТЕАС) и пероксильного радикала (Oxygen Radical Absorbance Capacity - ORAC). Данные методы позволяют проводить количественную характеристику антиоксидантных свойств соединений с различными физико-химическими свойствами и характеризуются высокой воспроизводимостью и надежностью. В то же время, эти методы тестирования антиоксидантов in vitro не позволяют провести интегральной оценки эффективности антиоксидантов в живых системах, поскольку они не учитывают целый ряд факторов, включая биодоступность, распределение и метаболизм антиоксидантов, а также их взаимодействие с системой антиоксидантной защиты [Blair et al., 2006]. Для объективной характеристики антиоксидантов необходима верификация их антиоксидантных эффектов in vivo.
Таким образом, вышесказанное свидетельствует об актуальности структурно-функциональных исследований пептидных антиоксидантов для оценки их эффективности и создания стратегии скрининга антиоксидантных пептидов с использованием эмпирических и квантово-химических дескрипторов.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы был структурно-функциональный анализ и исследование механизмов антиоксидантного действия пептидов в системах с различными типами радикалов.
В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
1. Исследование антиоксидантных свойств модельных низкомолекулярных
соединений: редокс-активных аминокислот, метионин- и тирозин- содержащих
дипептидов, ароматических гидроксикислот (модели тирозина) по отношению к
катион-радикалу АБТС и пероксильному радикалу;
2. Исследование геометрии молекул и электронных дескрипторов редокс-активных
аминокислот, метионин- и тирозин- содержащих дипептидов и ароматических
гидроксикислот полуэмпирическими методами;
3. Анализ механизмов антиоксидантного действия метионин- и тирозин-
содержащих дипептидов и ароматических гидроксикислот;
Исследование антиоксидантных свойств пептидных композиций, полученных при гидролизе коллагеновых и мышечных белков, по отношению к пероксильному радикалу и катион-радикалу АБТС in vitro. Идентификация антиоксидантных пептидов в исследуемых пептидных композициях;
Разработка стратегии скрининга антиоксидантных пептидов с использованием набора дескрипторов;
6. Исследование влияния пептидных композиций на антиоксидантный статус in
vivo.
Научная новизна.
Впервые проведены квантово-химические расчеты электронных дескрипторов и оптимизация геометрии тирозиновых и метиониновых дипептидов в газовой фазе. Впервые установлены механизмы антиоксидантного действия метионин- и тирозин-содержащих дипептидов. Показано, что взаимодействие метионин-содержащих дипептидов с пероксильным радикалом протекает по механизму донирования электрона, а взаимодействие тирозин-содержащих дипептидов с катион-радикалом АБТС протекает по механизму последовательного депротонирования и отдачи электрона. Впервые на основе экспериментального исследования антиоксидантной емкости тирозиновых и метиониновых дипептидов и результатов квантово-химических расчетов предложена стратегия отбора пептидов с высокой антиоксидантной емкостью.
Практическое значение работы. Выявленные закономерности взаимного влияния остатков аминокислот на антиоксидантные свойства дипептидов могут служить основой для разработки биотехнологических процессов, позволяющих получать пептидные композиции с заданными антиоксидантными свойствами. Предложенная стратегия скрининга пептидов с высокой антиоксидантной емкостью позволит проводить теоретически обоснованный поиск и отбор перспективных антиоксидантов пептидной природы. Данные, полученные при исследовании антиоксидантных свойств пептидных композиций in vitro и in vivo, могут быть использованы для создания функциональных пищевых продуктов для профилактики нейродегенеративных заболеваний.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 1-м Европейском пищевом конгрессе (2008, Любляна); 14-й Конференции международного Гуминового общества (2008, Москва-Санкт-Петербург); конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития (2009, Москва); 14-м Международном биотехнологическом симпозиуме (2010, Римини), VIII Международной конференции Биоантиоксидант (2010, Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей, а также 7 тезисов докладов на конференциях.
Объем и структура работы. Работа изложена на 186 страницах печатного текста, содержит 37 рисунков и 32 таблицы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 135 источников.
