Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
ЧАСТЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
Влияние интерлейкина-1 на ось гипотахгамус-гипофиз-надпочечники 11
1. Концепция двунаправленного взаимодействия между иммунной и
эндокринной системами 12
2. Ось гипоталамус-гипофиз-надпочечники 14
2.1. Организация оси ГГН 14
2.2 Экспериментальная оценка секреторной активности оси ГГН 16
3. Цитокины 17
3.1. Цитокины и семейство цитокиновых рецепторов 17
3.2.IL-l,IL-6nTNF-a 20
4. Влияние цитокннов на секреторную активность ГГН оси in vivo 23
Исследования на животных 23
Исследования на человеке 25
5. Механизмы активации осиГГНинтерлейкином-1 26
Непосредственные воздействия на гипофиз и надпочечники 26
Проникновение цитокннов в мозг 28
5.2.1. Цитокины и целостность гематоэнцефалического барьера 29
5,2.2 Опосредованный переносчиками перенос цитокинов через
гематоэнцефалический барьер 30
6. Синтез цитокинов в мозге 31
Заключение 33
Часть П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
Глава 1. Материалы и методы 36
Реактивы 36
Экспериментальные животные 36
Синтетические пептиды 37
4. Методы выделения и оценки влияния пептидов на бласт-
трансформацию Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы 37
4.1. Клеточные культуры 37
4.2, Оценка влияния пептидов на бласт-трансформацию Т- и В-
лимфоцитов по включению [метил- Н]тимидина в клетки 38
5. Методы изучения стресс - протекторного действия пептидов 38
Определение уровня 11-оксикортикостероидов в крови и надпочечниках крыс 39
Определение уровня свободного гистамина в сердечной мышце 41
Определение активности фермента диамшюксидазы в сердечной мышце 41
6. Определение кинетических характеристик взаимодействия изучаемых
пептидов с рецепторами методом радиолигандного анализа 42
Получение мембранных фракций из органов крысы 42
Получение [ Н]иммунокортина и ^Н]лейкокортикотропина 43
йодирование пептида АКТГ(11-24) 43
Изучение связывания " Г-меченого АКТГ(11-24), [^Н]иммунокортина и рН]лейкокортикотропииа с мембранными фракциями из надпочечников крысы 44
Анализ ингибирования связывания :1-меченого АКТГ(1 1-24), [3Н]иммунокортина и [^Щлейкокортикотропина с мембранными фракциями из надпочечников крысы 45
Изучение влияния пептидов па активность аденилатциклазы в мембранах коры надпочечников крысы 45
7. Статистическая обработка результатов 46
Глава 2. Результаты исследований 47
Характеристика пептидов 47
Влияние пептидов на бласт-трансформацию Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы 47
Влияние пептидов на пролиферацию митоген-стимулированных Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы in vitro 48
Влияние АКТГ(11-24) и лейкокортикотропина на стимулирующий эффект иммунокортииа 50
Влияние иммунокортииа на спленоциты, находящиеся на разной стадии активации 51
3. Изучение рецепции пептидов 53
Связывание ["'ЬЦиммунокортина с мембранами коры надпочечников крысы 53
Связывание [ Н]лейкокортикотропина с мембранами коры надпочечников крысы 55
Связывание ^і-меченого АКТГ (11-24) с мембранами коры надпочечников крысы 56
4. Влияние кортикотропинподобных пептидов на функциональную
активность коры надпочечников крысы 58
Влияние иммунокортииа на аденилатциклазную активность мембран коры надпочечников крысы 58
Влияние лейкокортикотропина на аденилатциклазную активность мембран коры надпочечников крысы 59
Влияние кортикотропинподобных пептидов на уровень 11 -оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках крысы in vivo 60
Влияние иммунокортииа на уровень КС в надпочечниках крыс в покое, при холодовом и тепловом воздействиях in vivo 61
Влияние лейкокортикотропина на уровень КС в надпочечниках крыс в покое, при холодовом и тепловом воздействиях in vivo 62
Влияние лейкокортикотропина на уровень КС в плазме крови
крыс в покое и при холодовом воздействии in vivo 65
4.3.2. Влияние фрагмента АКТЦ15-18) и его модифицированных аналогов на уровень КС в надпочечниках крыс в покое и. при
холодовом воздействии in vivo 66
5. Влияние кортикотропинподобных пептидов на систему гистамин -
диаминоксидаза миокарда крыс при различных стрессовых факторах
in vivo 69
Влияние иммунокортина на систему гистамин - диаминоксидаза миокарда крыс в покое и при термических воздействиях 69
Влияние лейкокортикотропина на систему гистамин -диаминоксидаза миокарда крыс в покое и при термических воздействиях. 72
Влияние фрагмента АКТГ(15-18) и его модифицированных аналогов на систему гистамин - диаминоксидаза миокарда крыс в покое и при холодовом шоке 72
Глава 3. Обсуждение результатов 77
3.1. Влияние иммунокортина, лейкокортикотропина и АКТГ(11-24) на
б ласт-транс формацию Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы in vitro 77
Изучение рецепции иммунокортина, лейкокортикотропина и АКТГ(П-24) 79
Изучение влияния иммунокортина, лейкокортикотропина, фрагмента АКТГ(15-18) и его модифицированных аналогов на уровень
11-оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках крыс при различных
термических воздействиях in vivo 81
3.4. Изучение влияния иммунокортина, лейкокортикотропина, фрагмента
АКТД15-18) и его модифицированных аналогов на систему гистамин -
диаминоксидаза миокарда крыс при различных термических
воздействиях in vivo 86
ВЫВОДЫ 95
ЛИТЕРАТУРА 96
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АКТГ - адренокортикотропный гормон
ВВВ - гематоэнцефалический барьер
CNTF - цилиарный нейротрофический фактор
CSF - колониестимулирующий фактор
GC - глюкокортикоиды
HEPES - Н-2-гидроксиэтилпиперазин-1Ч'-2--этансульфоноБая кислота
IgG - иммуноглобулин класса G
IL - интерлейкин
INF - интерферон
Kd - равновесная константа диссоциации
Ki - равновесная константа ингибировиаия
LIF - фактор, ингибирующиЙ лейкозные клетки
и - число мест связывания рецепторов в расчете на одну клетку
NGF - фактор роста нервов
OSM - онкостатян М
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
TNF - фактор некроза опухолей
БСА - бычий сывороточный альбумин
ГГН - ось гипоталамус-гипофиз-надпочечники
кДа - килодальтон
Кон А - конканавалин А, лектин Canavalia ensiformes
КРГ - кортикотрonин-рилизинг гормон
КС - 11-оксикортикостероиды
ЛПС - бактериальный липополисахарид
Н цепь - (heavy) тяжелая цепь иммуноглобулина G
F10MK - проопиомеланокортин
Трис - трис (гидроксиметил) аминометан
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
ЦНС - центральная нервная система
ЭДТА - этилеидиаминтетрауксусная кислота
Для написания последовательностей пептидов и белков были использованы однобуквенные и трехбуквенные символы аминокислот.
Введение к работе
Актуальность проблемы. Стресс - это одна из общих неспецифических нейрогуморальных реакций организма на действие "чрезвычайных" раздражителей (стрессоров), которая в основном определяется деятельностью гипоталамуса, гипофиза и коры надпочечников (Selye, 1950, 1956). Стресс имеет защитное значение и направлен на восстановление нарушенного гомеостаза. Патогенное действие любого агента включает в себя специфическое действие на ткань, неспецифическое местное действие и неспецифическое влияние, опосредованное через гипофиз-адреналовую систему. Усиление психоэмоциональной нагрузки, ухудшение экологической обстановки - все это приводит к возрастанию стрессорных воздействий и снижению адаптационных возможностей организма современного человека. Поэтому разработка новых эффективных и безопасных средств, способных повышать устойчивость организма к стрессу - это важная и актуальная задача.
В настоящее время биологически активные пептиды, производные природных пептидных гормонов, рассматриваются как потенциальные лекарственные средства нового класса. Несомненными достоинствами пептидов являются быстрая реакция организма па их введение, практически полное отсутствие токсичности, а также тот факт, что продуктами деградации пептидов являются аминокислоты. К сожалению, поли функциональность пептидных гормонов является лимитирующим фактором их применения в качестве лекарственных препаратов. Поэтому основной задачей при конструировании новых лекарственных средств на базе природных пептидных гормонов является синтез селективно действующих аналогов с узким спектром действия, устойчивых к ферментативному расщеллению. Основным регулятором ответа организма на стресс является адренокортикотропиый гормон (АКТГ). В этой связи детальная характеристика свойств и механизма действия неизвестных ранее
АКТГ-подобных пептидов иммунокортина (VKKPGSSVKV) и лейкокортикотропина (GKVLKKRR) важна и актуальна.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы - изучение свойств и механизма действия активности АКТГ-подобных пептидов иммунокортина (ИМК) и лейкокортикотропина (ЛКТ).
Основные задачи исследования:
1. Изучение влияния ИМК и ЛКТ на пролиферацию Т и В лимфоцитов
селезёнки крысы ш vitro.
2. Получение [3Н]ИМК, [3Н]ЛКТ и ,251-меченого АКТГ(П-24) и исследование
связывания с мембранными фракциями коры надпочечников крысы.
Изучение влияния ИМК, ЛКТ, фрагмента АКТГ( 15-18) и его модифицированных аналогов на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках крыс в покое, при холодовом и тепловом шоке in vivo.
Изучение влияния ИМК, ЛКТ, фрагмента АКТГ(15-18) и его модифицированных аналогов на систему гистамнн - диаминоксидаза миокарда крыс при различных термических воздействиях in vivo.
Работа выполнена в лаборатории "Пептидных биорегуляторов" Филиала Инстиута биооргапической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в соответствии с планом научно - исследовательских работ.
Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым экспериментальным доказательством того, что кортикотропинподобные пептиды: ИМК, соответствующий аминокислотной последовательности 11 -20 вариабельной части тяжелой цепи иммуноглобулина G (Н-цепи IgGl) человека, и ЛКТ, соответствующий фрагменту 81-88 предшественника интерлейкина-1а (pIL-] а) человека, быка, кролика и мыши, - обладают стресс-протекторной активностью.
Установлено, что ИМК, ЖТ, фрагмент АКТГ( 15-18) и его модифицированные аналоги снижают уровень КС при термических воздействиях, а также коррегируют систему гистамин - диаминоксидаза (ДАО) как при холодовом, так и при тепловом шоке.
Также обнаружено, что ИМК увеличивает пролиферацию митогеи-стимулированных Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы in vitro. Показано, что это действие иммунокортина опосредовано через рецептор АКТГ.
Приоритетными являются результаты исследования с помощью [3Н]ИМК, [3Н]ЛКТ и 12Т-меченого АКТГ(П-24) G-б елок-связанного рецептора АКТГ (меланокортин-2 рецептор, MC2R) на мембранах коры надпочечников крысы.
Практическая ценность результатов работы. В настоящее время решением одной из важнейших задач современных биологин и медицины является создание новых эффективных и безопасных средств, повышающих устойчивость организма к стрессу. Поэтому такое свойство ИМК и ЛКТ, как способность усиливать адаптационные возможности организма при действии различных экстремальных факторов, может привлечь внимание фармакологов и клиницистов.
Основные положения, которые выносятся на защиту:
АКТГ- подобный пептид ИМК увеличивает пролиферацию митоген-стимулированных Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы in vitro. Показано, что ЛКТ и АКТГ( 11-24), не оказывая никакого стимулирующего действия на сплепоциты, блокируют активирующий эффект ИМК, выступая в качестве конкурирующих пептидов.
Меченые [3Н]ИМК и [ЭН]ЛКТ с высоким сродством и специфичностью связываются с G-белок-связанными рецепторами АКТГ на мембранах коры надпочечников крысы.
*
З, ИМК, ЖТ, фрагмент АКТГ(15-18) и его модифицированные
аналоги снижают уровень КС при термических воздействиях, а также коррегируют систему гистамин - ДАО как при холодовом, так и при тепловом шоке.
»
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Влияние интерлейкина-1 на ось гипоталамус-гипофиз-надпочечники.
Глюкокортикоиды - это гормоны, вырабатываемые надпочечниками; давно известно, что они имеют сильное воздействие на иммунологические процессы. Однако взаимодействие между иммунной и нейроэндокринной системами двунаправленно. Эндокринная и иммунная системы общаются на одном "химическом языке", содержащем лиганды и рецепторы "классических" гормонов и иммунорегуляторные медиаторы. Исследования в первой половине 1980 г.г. показали, что моноцитарный или рекомбинантный интерлейкин-1 (IL-1) стимулирует секрецию гормонов осью гипоталамус-гипофиз-надпочечники (ГГН); таким образом, иммунорегуляторы, известные как цитокины, играют ведущую роль в этом двустороннем взаимодействии между иммунной и нейроэндокринной системами. Следующие 10-15 лет показали, что большое число цитокинов увеличивают секреторную активность ГГН.
Так как нейроэндокринное воздействие цитокинов проявляется на уровне центральной нервной системы (ЦНС). В последнее время на первый план вышли работы, посвященные выделению цитокинов, влияющих на ось ГГН, определению физиологических и психологических условий, при которых происходит синтез данных цитокинов, а также моделированию механизмов их воздействия на ось ГГН.
]. Концепция двунаправленного взаимодействия между иммунной и
эндокринной системами.
Концепция двунаправленного взаимодействия между иммунной и эндокринной системами окончательно сформировалась и получила прочное практическое подтверждение благодаря плодотворным работам Эдвина Блалока и др. в начале 1980-х г.г. В работах данного коллектива приведено молекулярное обоснование данного двунаправленного взаимодействия (Blalock et al., 1994; Weigent et al., 1997). Их ранние исследования показали схожесть в принципах действия иммунорегуляторов и гормонов (например, интерферона и норэпинефрина) (Blalock et al,, 1980), а в дальнейшем было установлено, что ряд классических гормонов не только секретируются обычными эндокринными железами (например, гипофизом), но и производится клетками иммунной системы: например, лимфоциты синтезируют адренокортикотропный гормон (АКТУ) - гипофизарный гормон, являющийся главным физиологическим регулятором секреции глюкокортикоидов (GC) надпочечниками (Blalock et al., 1981). Более того, исследования Блалока показали не только то, что лимфоциты производят гормоны (АКТГ, эндорфины, гормон роста (Smith et al., 1983; Weigent et al., 1988)), но и что данные гормоны способны влиять на иммунные процессы в организме (Blalock et al., 1985; Johnson et al., 1984).
В середине 1980-х г.г. стало очевидно, что иммунорегуляторные цитокины формируют ключевую взаимосвязь между иммунной и эндокринной системами (Blalock et al, 1985). Блалок и его лаборатория показали, что монокины интерлейкин-1 (IL-1) и IL-6 (гепатоцито-стимулирующий фактор) стимулируют секрецию АКТГ из клеточной линии AtT20 (кортикотропная опухолевая клеточная линия). Год спустя Беседовский и др. (Besedovsky et al, 1986) продемонстрировали, что систематическое введение моноцито-производного или рекомбинантного IL-1 увеличивает концентрации АКТГ и GC в плазме мышей. Кроме того, Беседовский и др. экспериментально продемонстрировали на крысах, что
нейтрализация эндогенного IL-1 угнетает глюкокортикоидный ответ на вирусное заражение (применялся вирус болезни Ньюкасла). Последующие эксперименты четко продемонстрировали, что наблюдение стимулирующего эффекта цитокинов на нейроэндокринную секрецию является не просто фармакологическим феноменом; было выдвинуто предположение, что IL-1 играет важную эндогенную роль в регуляции оси ГГН во время вирусных заболеваний.
Данные основополагающие работы Блалока и Беседовского подтвердили, что цитокины могут быть кортикотропин-рилизинг гормонами (КРГ), синтезируемыми вне гипоталамуса в пораженных тканях. Последующие работы трех независимых лабораторий вылились в одновременные публикации в журнале Science 5 987 года (Berkenboseli et al., 1987; Bemton et al., 1987; Sapolsky et al., 1987). Одна из работ (Bernton et al., 1987) демонстрировала прямое действие IL-1 на секрецию АКТГ клетками аденогипофиза в клеточных культурах, таким образом подтверждая ранние работы Блалока (Blalock et al., 1985), предположившие существование прямого воздействия IL-1 на аденогипофиз. Две другие работы (Berkenbosch et al., 1987; Sapolsky et al., 1987), напротив, опровергали стимуляцию IL-1 секреции АКТГ в клеточнвгх культурах, кроме того факта, что IL-1 in vivo повышает концентрации АКТГ и GC в плазме. Две вышеупомянутые работы продемонстрировали, что вызываемая IL-1 секреция АКТГ in vivo находится в зависимости от секреции и действия гипоталамического КРГ, который является основным катализатором синтеза АКТГ. Эти открытия прочно закрепили за гипоталамусом роль части оси ГГН, ответственной за реакцию на IL-1, и послужили подтверждением идеи о том, что иммунорегуляторы могут влиять на активность центральной нервной системы (ЦНС).
В настоящее время собрано множество доказательств того, что IL-1 и другие цитокины являются переносчиками сигналов в мозг. Параллельно с исследованиями, посвяіценньїми изучению взаимоотношений между иммунной системой и осью ГГН, большое количество исследований
показало, что повышение температурь!, вызываемое каким-либо патогенным фактором, возникает как результат синтеза иммунными клетками эндогенного пирогена, который способен передавать сигналы ЦНС (Atkins et al., 1960; Kluger et al., 1991). Этот эндогенный пироген был предположительно идентифицирован как IL-1 (Kluger et al., 1991).
В совокупности данные работы предоставили неоспоримые доказательства того, что 1L-1 влияет на ответные реакции ЦНС и на изменения иммунной активности.
С опубликованием результатов работ Беседовского и Блалока стало очевидно, что IL-1 влияет на секрецию большинства неяроэндокринных гормонов. Более поздние исследования показали, что неироэндокрянная секреция находится под влиянием не только IL-1, но и множества других яммунорегуляторных цитокинов. В связи с этим продолжали тщательно исследовать влияние нескольких интерлейкинов, TNF, хемокинов, интерферонов, факторов роста и нейротропных факторов на ось ГГН.
2. Ось гипоталамус-гипофиз-надпочечники.
2.1. Организация оси ГГН
За последние 10-15 лет было опубликовано более 1000 статей касательно активации ГГН оси цитокннами. Такое кол-во работ связано с числом обнаруженных цитокинов, со сложностью организации ГГН оси и функциональной важностью действия оси во время стрессовых ситуаций. Лежащая в основе стресса секреция тлюкокортикоидов (GC) необходима для нормального функционирования большинства тканей, и даже небольшое отклонение от нормального уровня этих стероидных продуктов значительно изменяет физиологические и биохимические параметры, Взаимодействие эндокринной системы и ЦНС модулирует суточный ритм секреции GC с пиком, приходящимся на время пробуждения, и спадом, приходящимся на первые часы сна. Уровень GC в крови увеличивается в ответ на любое воздействие, которое является угрозой для организма или может быть
принято за таковое. GC имеют широкий спектр воздействия иа клетки, увеличивая и уменьшая их активность путём влияния на метаболические, эндокринные, нервные и иммунные процессы, и, таким образом, помогая клеткам выжить. Поэтому неудивительно, что изменение уровня GC в крови является сенсорным сигналом для гипоталамуса.
Паравентрикулярные ядра (ПВЯ) гипоталамуса участвуют в процессе регуляции гипофизарно-надпочечниковой оси и являются основным источником КРГ в ЦНС. КРГ, состоящий из 41 аминокислоты, является основным физиологическим регулятором секреции АКТГ гипофизом (Rivier et al., 1986). КРГ высвобождаются из нервных отростков в области срединного возвышения и через гипоталамо-гипофизарную систему с кровью поступают к аденогипофизу, где взаимодействует со специфическим G белок-связывающим рецептором (КРГ-Rl), в результате чего стимулируется синтез проопиомеланокортипа (ПОМК) и секреция АКТГ и других производных пептидов ПОМК (Turnbull et al., 1997, Vale et al,, 1981).
АКТГ запускает секрецию GC в пучковой зоне коркового слоя надпочечников. У людей главным GC пучковой зоны является кортизон, а у крыс и мышей - кортикостерон.
Эти стероиды угнетают синтез и секрецию КРГ в гипоталамусе и производных пептидов ПОМК в гипофизе (Keller-wood et al., 1984, Young et al., 1986).
ПВЯ подразделяются на два вида: крупноклеточные (кПВЯ) и мелкоклеточные (мПВЯ). кПВЯ вместе с супраоптическими ядрами (SON) образуют крупноклеточные нейроны, которые являются важнейшими источниками аргинина вазопрессииа (AVP) и окситодина, секретируемыми в общий кровоток. мПВЯ содержит тропные КРГ нейроны, которые секретируют КРГ в гипофизарную портальную систему. Данные нейроны производят и другие пептиды, наибольшего внимания из которых заслуживает AVP (Sawchenko et al., 1984, Tilders et al., 1993), тесно
взаимодействующий с КРГ с целью стимуляции секреции АКТГ (Rivier et at, 1983). Более того, AV.P и окситоция, секретируемые вне мІЇВЯ (например, в крупноклеточных нейронах), также могут оказывать влияние на секрецию АКТГ в гипофизе (Antoni et al., 1990; Plotsky et al., 1991).
Существует огромное количество различных источников стресса, приводящих к активации оси ГГН. мПВЯ способны воспринимать разнообразные сигналы от различных областей мозга, отвечающих за висцеральную, соматосенсорную, аудиальную, визуальную и другую информацию, а также от областей, ответственных за реакцию на эмоциональные раздражители (Sawchenko et al., 1996). Таким образом, существует множество факторов, влияющих на активность оси ГГН, и несомненно, что все без исключения регуляторные процессы, перечисленные выше, являются отправными точками, запускающими процесс ответной реакции оси ГГН на стрессовые ситуации.
2.2 Экспериментальная оценка секреторной активности оси ГГН.
При исследовании изменения секреторной активности оси ГГН под действием цитокинов использовалось огромное количество разнообразных методик. Финальным результатом увеличения активности оси ГГН является повышение концентрации АКТГ и GC в крови.
Временные измерения уровня иммунореактивности данных гормонов широко применяются как метод изучения влияния цитокинов на ось ГГН у человека. Лабораторные опыты на животных с использованием разнообразных хирургических, фармакологических и генетических воздействий на определенный цитокин позволяют получать ценные данные для раскрытия процессов функционирования нейрохимических механизмов, вовлеченных в процесс активации оси ГГН.
Для оценки непосредственного влияния цитокинов на каждый конкретный компонент оси ГГН используется ряд методов in vitro. Только одна линия клеток доступна для изучения влияния цитокинов на ось ГГН, а
именно AtT20, которая была использована как модель для исследования эффекта прямого влияния цитокинов на кортикотрофы аденогипофиза, В большинстве исследований in vitro используют методики, которые позволяют после предварительной препарации гипоталамуса, аденогипофиза или надпочечников сохранить целостность органа, его сегмента или изолированной однослойной культуры клеток. Данные методики предоставляют изолированную от внешних воздействий среду, что позволяет провести исследование непосредственного влияния применяемых препаратов на ткани исследуемого органа.
3. Цитокины, 3.1. Цитокины и семейство цитокиновых рецепторов.
Цитокины - это большие (8-60 кДа), продуцируемые клетками белковые факторы, осуществляющие короткодистанционную регуляцию межклеточных и межсистемных взаимодействий. Цитокины контролируют выживаемость клеток, стимуляцию или ингибироваыие их роста, дифференцировку, функциональную активацию и апоптоз клеток. Способность регулировать перечисленные функции обусловлена тем, что после взаимодействия цитокинов с комплементарными рецепторами на поверхности клеток сигнал через элементы внутриклеточной транедукции передается в ядро, где активируются соответствующие гены. Белки, являющиеся продуктами активированных генов, вырабатываются клетками и регулируют перечисленные выше процессы.
Цитокины - гормоноподобные молекулы, действие которых на клетку-мишень опосредуется высокоспецифичными высокоаффииными мембранными рецепторами. Все рецепторы цитокинов представляют собой трансмембранные гликопротеины, у которых внеклеточная часть отвечает за связывание цитокина. Как правило, эти рецепторы состоят более чем из одной субъединицы, причем высокоаффинное связывание является следствием взаимодействия цитокина с разными субъединицами, каждая из
которых сама способна связывать соответствующий цитокин, но с более низкой аффинностью. Нередко на клетках-мишенях цитокинов обнаруживаются несколько типов центров связывания, различающихся аффинностью к цитокину, Рецепторы цитокинов, за редким исключением (1L-1, TNF), обладают абсолютной специфичностью. Одни субъединицы реагируют только с определенным цитокином, в то время как другие являются общим рецептором для разных цитокинов. Функциональное сходство ряда цитокинов обусловлено наличием общих структур в рецепторах. Кроме того, существуют общие групповые рецепторы, способствующие устранению избытка цитокинов в очаге поражения. Растворимый рецептор, связывающийся с цитокином, - это отщепленный ферментом внеклеточный домен мембранного рецептора. Растворимые рецепторы сохраняют высокую аффинность в отношении своих лигандов и благодаря этому способны нейтрализовывать цитокины, препятствуя их доступу к интактным мембранным рецепторам. Растворимые рецепторы могут выполнять функция конкурирующих антагонистов, а также участвовать в транспорте, доставке цитокинов в очаг поражения и выведении их из организма.
В отличие от классических гормонов, большинство цитокинов является молекулами локального (паракринного) действия. Они продуцируются и утилизируются клетками, находящимися в тесной близости. Возможно и аутокринное действие цитокинов, т.е. действие на ту же клетку, которая секретировала данный цитокин. Время полураспада большинства цитокинов в кровотоке измеряется минутами. Секреция цитокинов - краткосрочный процесс. Кодирующая цитокины мРНК нестабильна, что в сочетании с краткосрочностью транскрипции генов цитокинов приводит к краткосрочности их биосинтеза.
Среди всех известных к настоящему времени секретируемых клетками регуляторных факторов две группы цитокинов являются наиболее хорошо изученными. Это факторы роста и цитокины иммунной системы (ИС).
Цитокины ИС служат медиаторами иммунной и воспалительной реакций, обладают аутокринной, паракринной и эндокринной активностью, действуют как факторы роста и факторы дифференцировки клеток, а также обладают плейотропной (полифункциональной) активностью (Cohen et al., 1996; Paul et al., 1989).
Классификация цитокинов может проводиться по их биохимическим и биологическим свойствам, а также по типам рецепторов, посредством которых цитокины осуществляют свои биологические функции. В зависимости от того, какие клетки ИС преимущественно синтезируют тот или иной цитокин, различают интерлейкины, монокины и лимфокины. В настоящее время 23 интерлейкина имеют цифровые обозначения (IL-1 - IL-23), остальные цитокины буквенные: CSF (колониестимулирующие факторы), OSM (онкостатин М), L1F (фактор, ингибирующий лейкозные клетки), NGF (фактор роста нервов), CNTF (цилиарный нейротрофический фактор), TNF (фактор некроза опухолей), интерфероны (1NF) и т.д.
Спектры биологических активностей цитокинов ИС в значительной степени перекрываются: один и тот же процесс может стимулироваться в клетке более чем одним цитокином. Во многих случаях в действиях цитокинов наблюдается синергизм. Антигенная стимуляция приводит к секреции цитокинов "первого поколения" - TL-1 и IL-б, TNF- а, которые индуцируют биосинтез центрального регуляторного цитокина TL-2, а также IL-3, 4, 5, INF -у и др. В свою очередь, цитокины "второго поколения" влияют на биосинтез ранних цитокинов. Такой принцип действия позволяет не только регулировать иммунный ответ, но и амплифицировать его, вовлекая в реакцию все возрастающее число клеток. Основными клетками-продуцентами цитокинов ИС являются Т-хеляеры и макрофаги, которые выполняют главные функции в поддержке приобретенного и врожденного иммунитета.
Действие цитокинов тесно связано с физиологическими и патофизиологическими реакциями организма. При этом происходит
модуляция как локальных, так и системных механизмов защиты. Одной из важнейших функций системы цитокинов является обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной системы в ответ на стресс.
3.2,IL-l,IL-6iiTNF-a
Множество различных цитокинов оказывает влияние на ось ГГН, среди них наиболее изученными являются IL-1, IL-6 и TNF-a.
IL-1 играет одну из центральных ролей в воспалительной реакции, в ответе на бактериальную инфекцию и тканевые повреждения, вызванные ультрафиолетовым излучением. Он проявляет свойства нейроэндокринного гормона, стимулируя продукцию АКТГ. IL-1 участвует в регуляции температуры тела, а его повышенная продукция приводит к развитию лихорадки. Известны факторы, снижающие биологическую активность IL-1. К ним прежде всего относят глюкокортикоиды и простагландины.
IL-1 представляет собой систему из трех молекул: IL-la , IL-1J3 , IL-1 Ra (антагонист рецептора IL-1) и двух рецепторов IL-1 R 1 и IL-1 RIL IL-1 синтезируется в форме предшественников макрофагами, эндотелиальиьтми и мезенхимальными клетками, В-лимфоцитами, а также клетками других тканей. Предшественник IL-la (npo-ILla) биологически активен и способен соединяться с рецептором в форме димера, IL-.1J3 приобретает способность связываться с рецептором для IL-1 только после ферментативного расщепления, в результате которого образуется конечный продукт с молекулярной массой 17,5 Ша. Этот процесс катализируется определенным ферментом - IL-ip-конвертирующим энзимом, недавно переименованным в каспазу 1 (Кеапе et аі., 1995).
Биологические свойства IL-la и IL-lp очень сходны либо идентичны. IL-la и IL-lp кодируются разными (хотя и тесно сцепленными) генами и различаются по структуре и pi (5.0 для IL-la и 7.0 для IL-1[3). Гомология их
белковой структуры составляет лишь 25% (Dinarello et al., 1991). Несмотря на незначительную гомологию, IL-la и IL-1 р конкурируют за один и тот же рецептор. Преобладающей формой IL-1 является IL-1 |В .
Рецепторы IL-1 I типа (IL-1R1) экспрессируются на многих клетках: Т-лимфоцитах, тимоцитах, фибробластах, эндотелиальных клетках, гепатоцитах и др. Тин II рецепторов (IL-IRTI) характерен для В-лимфоцитов, макрофагов и моноцитов. Высокоаффинное связывание IL-la и IL-lp наблюдается для обеих форм рецептора (Sims et аі., 1994). Число рецепторов на клетках невелико и составляет, как правило, несколько десятков или сотен. Оба типа рецепторов представляют собой трансмембранные гликопротеины с Ig-подобной структурой внеклеточного участка молекулы. Между ними имеется 28% гомологии.
Антагонист рецептора IL-1 (IL-IRa) является мономерным гликозилированным белком с молекулярной массой 25 kDa, который продуцируется моноцитами и другими клетками. Он связывается с рецепторами 1 IL-la с той же аффинностью, что и IL-1, но это связывание не приводит к запуску процессов межклеточной биологической сигнальной трансдукции (Eisenberg et аі., 1990; Hannum et al., 1990). Таким образом, IL-IRa выступает в качестве ингибитора и, по-видимому, является важным физиологическим регулятором экспрессии IL-1 (Dinaerello et al., 1991).
IL-6 - это мономер с молекулярной массой 19-34 kDa. Он является фактором дифференцировки В-клеток, способствуя созреванию В-лимфоцитов в антителопродуцирующие клетки, IL-6 индуцирует синтез белков острой фазы, в связи с чем (также как и IL-1 и TNF) может быть отнесен к цитокинам воспаления. Выделяясь несколько позже, чем IL-1 и TNF-a, IL-6 подавляет их образование (они же, наоборот, стимулируют его выработку) и поэтому относится к цитокинам, завершающим развитие воспалительной реакции (Dinarello et al., 1991).
Мембранный рецептор IL-6 содержит две цепи: IL-6Ra, гликопротеин с
молекулярной массой 80 KDa, и IL-6R|3, гликопротеин с молекулярной
массой 130 KDa. Мембранный рецептор IL-6 расщепляется с образованием циркулирующей формы с молекулярной массой 55 KDa, обозначенной как sIL-6R. В первую очередь IL-6 связывается с IL-6R (IL-6Ra и IL-6RJ3) с образованием бинарного комплекса (Macklewicz et al., 1995). Ответственным за сигнальную трансдукцию является гомодимер IL-6Rp\ который активируется также LIF, CNTF, онкостатином М и IL-11 (Kishimoto et al., 1995). sIL-6R принимает участие в процессах, происходящих в печени при остром и хроническом воспалении.
В группу факторов некроза опухолей (TNF) входят TNFa и TNFJ3 (лимфотоксиы). TNFa и TNFJ3 представляют собой полипептиды с молекулярной массой около 17 kDa, TNFa является продуктом моноцитов/макрофагов, эндотелиальных, тучных и миелоидных клеток, в особых случаях - активированных Т-лимфоцитов. Последние являются основными продуцентами TNFfl TNF|3 образуется при действии на Т-клетки антигенов и митогенов значительно позже, чем TNFa (па 2-3-и сутки после активации). Противоопухолевое действие, связанное с геморрагическим некрозом и давшее ему название, не ограничивает спектр действий данного фактора. TNF также обладает иммуномодулирующим и противовоспалительным действием, вызываемым активацией макрофагов, неитрофилов, эозинофилов и эндотелиальных клеток (Dinarello et al., 1991). TNF проявляет свою биологическую активность при связывании со специфическими высокоаффинными мембранными рецепторами; белком TNF-RI (с молекулярным весом 55-60 KDa, известным как CD120a и р55) и белком TNF-RII (с молекулярным весом 75-80 KDa, известным как CD120b и р75). Они экспрессируются клетками большинства типов тканей (Bazzoni et al., 1996).
Активация различных типов клеток приводит к протеолитическому расщеплению мембранных рецепторов и образованию их растворимых форм. Образовавшиеся циркулирующие формы s'TNF-RI и sTNF-RII стабилизируют циркулирующий TNF и увеличивают период полураспада данного цитокина.
Они принимает участие в апоптозе, а также обладают антивирусной активностью (Darnay et al., 1997).
4. Влияние цитокинов на секреторную активность ГГН оси in vivo. 4.1. Исследования на животных.
Ряд исследований на крысах и мышах подтвердил и расширил понимание процесса стимуляции секреции АКТГ и GC под действием введенных IL-la и IL-lp\ а также многих других цитокинов. Экспериментально подтверждено увеличение секреторной активности оси ГГН у кур (Wick et al., 1993), овец (Vellucci et al., 1995), бабуинов (Reyes et al., 1996) и людей. Эксперименты на беспозвоночных (улитках) продемонстрировали наличие рудиментарной стрессовой системы, в работе которой принимают участие КРГ-, АКТГ- и биоамин-подобные молекулы в иммуноцитах (Ottaviani et al., 1997). Стрессовая система улиток содержит в себе цитокины и реагирует на них, включая IL-1, IL-2, TNF-a (Ottaviani et al., 1997). Данное обстоятельство свидетельствует о том, что процесс активации оси ГГН с помощью IL-1, сохранившийся неизменным в процессе эволюции, является очень важным для выживания (Ottaviani et al., 1996).
У млекопитающих секреция АКТГ1 в ответ на внутривенное введение ІГ-1 начинается очень быстро (через 5-10 минут после инъекции), и продолжается относительно недолго (около 1 часа) по сравнению с реакцией на внутрибрюшинное введение IL-Ір, которая начинается медленнее, но длится как минимум 2 часа. Наконец, ответная реакция на введение IL-1 напрямую в мозг продолжается несколько часов (обычно более 3-4 часов), а начинается позднее, чем при внутривенном введении 1L-1, но раньше, чем при внутрибрюшинном введении. Большинство исследований установило, что IL-ip оказывает большее влияние на крыс, чем IL-la (Naito et al., 1989; Matta et al., 1993). У крыс IL-1 [3 стимулирует секрецию АКТГ на всех стадиях послеродового развития как женских, так и мужских особей, ее
интенсивность зависит от возраста и пола (O'grady et al., 1993; Levine et al., 1994). Однократное введение IL-1 (3 не только сильно поднимает концентрации АКТГ и кортикостерона у крыс, но также приводит к длительному (как минимум трехнедельному) увеличению коэкспрессии AVP в нейронах КРГ гипоталамуса и гиперактивации оси ГГН (Schmidt et al., 1995). Длительное же введение IL-1J3 увеличивает способность гипоталамуса к синтезу КРГ (и гипофиза - к синтезу АКТГ), а также отмечается увеличение веса надпочечников (Naito et al., 1990) и возрастание концентрации АКТГ в плазме как минимум на 7 дней (Naito et al., 1990, Sweep et al., 1992, Van der meer et al., 1996).
Ось ГГН активируется в ответ на воздействие не только тех цитокинов, которые синтезируются в миелоидных клетках (например, IL-1, синтезированный в моноцитах или макрофагах), но также реагирует на воздействие цитокинов, синтезированных в лимфоидных клетках (например, IL-2, синтезированный в лимфоцитах). При этом воздействие IL-1 (3, согласно экспериментальным данным по оценке силы влияния различных цитокинов на ось ГГН (Sharp et al., 1989; Besedovsky et al., 1991), является наиболее выраженным. Однако, было установлено, что сила влияния каждого конкретного цитокина находится в непосредственной зависимости от относительных концентраций различных цитокинов в крови. Например, во время локальных воспалений IL-6, который, как считается, имеет меньшее влияние на ось ГГН, чем IL-1, вырабатывается дольше и интенсивнее, чем 1Г-1. Более того, некоторые цитокины содействуют друг другу для усиления стимуляции оси ГГН (Cheifetz et al., 1988; Zhou et al., 1996): например, TNF-a усиливает воздействие IL-ip (Van der meer et al., 1995). Однако опыты на крысах показали, что данное воздействие TNF-a наблюдалось постоянно только при периферийном введении, а при введении TNF-a непосредственно в мозг наблюдалось лишь в части экспериментов. Дальнейшие исследования выявили причину таких варьирующих результатов. Крысы реагировали
только на внутримозговое введение крысиного TNF-a (Turnbull et а!., 1997), а
на введение человеческого TNF-a наблюдалась очень слабая реакция или ее отсутствие (Sharp et al., 1989; Van der meer et al., 1996). Аналогичные результаты были получены и на мышах (Benigni et al., 1996).
4.2. Исследования на человеке.
В дополнение к разнообразным исследованиям цитокинов на животных, было проведено множество клинических испытаний ряда цитокинов на человеке в рамках программы борьбы с раковыми заболеваниями. Особенно ценно, что данные исследования позволили оценить воздействие именно человеческих цитокинов на человеческий организм.
Как внутривенные, так и подкожные инъекции IL-la (Curti et al., 1996), IL-lp (Crown et al., 1991), IL-2 (Spinazze et al., 1991), IL-6 (Mastorakos ct al., 1993), TNF-a (Molten et al., 1993) увеличивает концентрацию АКТГ и кортизола в плазме. Как и в случае с лабораторными животными, ответная реакция проявляется быстро - в течение 1 часа при внутривенном введении и 1-4 часов - при подкожном.
Серия экспериментов (Mastorakos et al., 1993-94), в которых принимали участие раковые больные с подходящей клинической историей, показала, что IL-6 имеет особенно ярко выраженное влияние на ось ГГН. В первый же день введение IL-6 (30 (ig/kg) привело к заметному росту концентраций АКТГ и кортизола в плазме - пики концентраций приходились на первый и второй час после введения препарата соответственно. Концентрация АКТГ в плазме вернулась к исходному уровню через 5 часов, тогда как концентрация кортизола оставалась повышенной в течение 24 часов. На седьмой день эксперимента секреция АКТГ в ответ на введение IL-6 заметно снизилась, вероятнее всего, в результате работы отрицательной обратной связи, усилившейся благодаря повышенной концентрации кортизола. Длительная секреторная активность надпочечников сопровождалась их увеличением, что подтвердила компьютерная томография. Последующие эксперименты
показали, что 0.3 f,ig/kg IL-6 является максимальной внутривенной дозой (Mastorakos et al., 1994), а 1-3 [.ig/kg - минимальной эффективной подкожной (Tsigos et al., 1997). Как оказалось, ответное увеличение концентрации АКТГ в плазме на инъекцию IL-6 сильнее, чем при стандартных тестах функциональности гипофизарно-надпочечниковой системы (например, введения овечьего КРГ), а токсический эффект от инъекции 1L-6 ниже. Исследователи выдвинули предположение о возможности использования IL-6 для тестирования функциональности гипофизарно-надпочечниковой системы (Mastorakos et al., 1996, 1997).
5. Механизмы активации оси ГГН интерлейкином-1.
Общепризнано, что цитокины различных семейств способны существенно влиять на активность оси ГГН. Кроме того, распределение различных цитокинов и их рецепторов по всему мозгу, гипофизу, и, в меньшей степени, надпочечникам дает основание предполагать, что цитокины влияют на работу этих органов. Однако, утверждение, что цитокиновые рецепторы (и рецепторы 1L-1 в частности) экспрессируются в секреторных клетках (тройные КРГ нейроны, природные кортикотрофы, GC-продуцирующие адренокортикальные клетки), не имеет достаточного обоснования. Это привело к предположению об участии структурных и/или фармакологических посредников в активации оси ГГЫ при помощи цитокинов. Работы, посвященные исследованию механизмов, с помощью которых определенные цитокины могут активировать ось ГГН при возникновении угрозы гомеостазу, были сконцентрированы на цитокине IL-1 и, в меньшей степени, на IL-6 и TNF-a.
5Д, Непосредственные воздействия на гипофиз и надпочечники.
Большинство данных in vivo показывают, что стимуляция выделения гипофизом АКТГ и секреции GC надпочечниками в ответ на присутствие IL-1 вызвана повышенной секрецией гипоталамического КРГ. Это доказывается заметным уменьшением в плазме концентраций АКТГ и кортикостерона, когда происходит иммунонейтрализация синтеза КРГ. Однако, полное
подавление секреции как АКТГ, так и кортикостерона после иммунонейтрализации КРГ не наблюдалось. (Van der meer et al., 1996). Кроме того, заметные повышения концентрации кортикостерона в плазме были отмечены даже тогда, когда секреция АКТГ, вызванная IL-1, была заметно сокращена (Kapcala et al., 1996). Хотя концентрация АКТГ в плазме может быть повышена до уровня 1,000 PG/мл с помощью внутривенного введения IL-lp\ более низкого уровня (100-200 PG/мл) АКТГ вполне достаточно, чтобы максимально стимулировать секрецию кортикостерона. Действительно, в надпочечниках крыс и собак наблюдается существенное увеличение в плазме содержания GC даже при небольшом росте концентрации АКТГ (<10 PG / мл) в плазме (Капеко et al., 1981; Keller-wood etal., 1983).
Ряд цитокинов, и IL-1 в частности, способен к непосредственному воздействию на гипофиз, усиливая секрецию АКТГ, и на кору надпочечников, увеличивая секрецию GC. Рецепторы для IL-1 ясно представлены в передней доле гипофиза, хотя маловероятно, что они экспрессируются на кортикотрофах. Гипофиз и надпочечники, несомненно, подвергаются действию IL-1, если его концентрация в крови растет (например, при росте концентрации эндотоксинов в крови). Кроме того, IL-1 может быть синтезирован локально в пределах этих тканей. В настоящее время кажется очевидным, что длительное воздействие IL-1 на гипофиз или надпочечники необходимо, чтобы вызвать высвобождение АКТГ или GC. Условия, обуславливающие длительные воздействия повышенных концентраций цитокинов - например, при хроническом воспалении (Sarlis et al., 1993; Stephanou et al., 1992), - могут повлечь за собой прямое воздействие IL-1 или других цитокинов на секрецию гипофизарного АКТГ и/или надпочечного GC. Кроме того, IL-1 может регулировать рост и развитие вышеперечисленных желёз. (Arzt et al., 1996; Zieleniewski et al., 1995). Точно так же в работах показано влияние ряда других интерлейкинов (например,
IL-2, IL-6) и факторов роста (например, EGF) на рост гипофиза или надпочечников (Arzt et al., 1993, Pereda et al, 1996).
Совокупность накопленных данных показывает, что наибольшему влиянию IL-1 подвергается гипоталамус. Возникает вопрос, как такой большой гидрофильный пептид, как IL-I, проникает в ЦНС, чтобы влиять на гипотоламическую секрецию. Вероятными ответами на данный вопрос являются:
допущение возможности того, что IL-1 проникает через гематоэицефалический барьер (ВВВ), чтобы войти в мозговую паренхиму,
и допущение возможности того, что IL-1 воздействует на ВВВ, который осуществляет дальнейшую передачу информации.
Принимается во внимание то, что IL-1, продуцируемый в пределах самого мозга, производит активацию оси ГГН. Также рассматривается возможность того, что повышенная секреция IL-1 в поврежденной ткани может косвенно активировать ось ГГН с помощью синтеза и секреции циркулирующего посредника.
5.2. Проникновение цитокинов в мозг.
Транспортировка растворенных веществ из кровеносных сосудов в околососудистую ткань (или наоборот) происходит через трансклеточные или параклеточные механизмы, В пределах мозга параклеточиый путь особенно трудноосуществим из-за присутствия ВВВ. ВВВ большей частью состоит из неокончатых эндотелиальных клеток, формирущих непрерывный клеточный слой, который представляет собой проницаемую непрерывную плазматическую мембрану (Rapoport et al., 1976). Большой размер молекулы (8-65 kDa) и гидрофильность цитокинов препятствует их трансклеточному движению посредством простой диффузии в каких-либо существенных объёмах. Действительно, ранние исследования показали, что ВВВ непроницаем для IL-1 (Blatteis et al., 1990; Coceani et al., 1988). Однако, транспорт цитокинов через параклеточиый путь возможен, когда целостность ВВВ нарушена.
5.2.1. Цитокины и целостность гематоэнцефалического барьера.
Потеря целостности ВВВ может происходить из-за воспалительных кровоизлияний в мозге, которыми сопровождаются болезни центральной нервной системы (например, рассеянный склероз, менингит, мозговые опухоли, умственное расстройство при СПИДе), мозговые травмы или эпилепсия (Johansson et al., 1995). Кроме того, введение больших доз липо полисахарида (LPS) также может увеличивать проницаемость ВВВ (Boje et al., 1995, De vries et al., 1996). Нарушение целостности ВВВ облегчает не только проникновение больших пептидов, таких как цитокины, но также увеличивает скорость проникновения в мозг клеток (таких как макрофаги, моноциты, лимфоциты и нейтрофилы), которые способны к синтезу и секреции цитокинов, но чьё проникновение в здоровый, неповрежденный мозг затруднено.
Выявление зависимости между периферийными воспалительными явлениями и выделением цитокинов в ЦНС привело к ряду исследований, посвященных изучению возможного влияние цитокинов на проницаемость ВВВ. Снижение межэндотелиалы-юго электрического сопротивления в культурах монослоя мозговых энд отел нал ьных клеток в результате действия LPS или 1L-1 р, TL-6 или TNF-a подтверждает факты повышения проницаемости ВВВ (De vries et al., 1996).
Исследования in vivo показали, что внутрицереброваскулярный TNF-a увеличивает проницаемость ВВВ у крыс (Kim et al., 1992) и свиней (Megyeri et al., 1992), а увеличение его выделения ведет к росту проницаемости ВВВ, связанной с рядом возбуждающих центральную нервную систему условий (Sharief et al., 1992, Shohami et al, 1996). Однако, способность систематически вводимых цитокинов (IL-.1 a, IL-1J3, IL-2, IL-6, TNF-а) влиять на целостность ВВВ была подвергнута критике (Banks et al., 1992; Saija et al., 1995). Эксперименты демонстрировали увеличение проницаемости ВВВ после периферического введения LPS в чрезвычайно высоких дозах (Liu et
al., 1996) или показывали увеличение проницаемости ВВВ только спустя длительный промежуток времени (Lustig et al., 1992).
Таким образом, увеличение проницаемости ВВВ (как результат влияния либо ЦНС, либо сильной периферической инфекции) может вести к проникновению как самих цитокинов, так и цитокин-продуцирующих клеток в ЦНС, и в итоге произведённые цитокины могут способствовать ЦНС-опосредованному остро-фазовому ответу. Однако совершенно ясно, что начальный неироэндокринный эффект от периферийного введения цитокинов или LPS может наблюдаться быстрее и при введении более низких доз, необходимых для повреждения ВВВ (Liu et al., 1996).
5.2,2 Опосредованный переносчиками перенос цитокинов через гематоэицефалический барьер.
Работа Банкса и других (Banks et al., 1995) показала, что межклеточный насыщаемый механизм переноса дает возможность цитокинам проникать в мозг, даже когда целостность ВВВ не поставлена под угрозу. Это относится к насыщающимся транспортным механизмам для IL-la (Banks et al, 1989), IL-lp (Banks et al., 1991), IL-lra (Gutierrez et al., 1994), IL-6 (Banks et al., 1994), и TNOF-a (Gutierrez et al., 1993), но не для IL-2 (Waguespack et al., 1994). Такие транспортные механизмы были выявлены посредством внутривенного введения мышам "I-меченного цитокина и измерения радиоактивности:
в целом мозге,
в целом перфузируемом мозге, свободном от примеси крови,
в мозговом паренхимном гомогенате, лишённом мозговых капилляров. Нужно отметить, что применявшиеся дозы цитокинов не нарушали целостности ВВВ, как показывают стабильно низкие уровни проникновения
І-мєченного белка в ЦНС. Не весь радиоактивный материал, найденный в мозге после внутривенного введения цитокина, хроматографи чески выявлен как подлинный цитокин. В частности, только 16% радиоактивности в мозговой паренхиме после внутривенного введения 1251-меченного IL-6 были вызваны радиоактивностью неповрежденного IL-6 (Banks et al,, 1994), что
поднимает вопрос о том, какой процент 1-меченного TL-6, попадающего в мозг, фактически является биологически активным. Неоднократные исследования регрессии и конкуренции с немеченными цитокинами продемонстрировали, что такая транспортировка радиоактивности в мозг насыщаема. Члены семейства IL-1, IL-la, IL-1J3, и IL-lra совместно используют одни и те же транспортеры (GutieiTez et al., 1994; Plotkin et al., 1996), но проникновение IL-6 в мозг не ингибируется в присутствии немеченного IL-la или TNF-a (Banks et al., 1994), тогда как работы по изучению конкурирования с IL-la, IL-1J3 и IL-6 продемонстрировали избирательность транспортёра TNF-a (Gutierrez et al, 1993). Вышеупомянутые исследования Банкса (Banks et al., 1995) продемонстрировали, что пиковые значения между 0.05 и 0.3% полной дозы как 12"1-меченного IL-la, так и IL-lp\ IL-1 га, IL-6, TNF-a найдены в каждом грамме целой мозговой ткани спустя 20-60 минут мосле внутривенной инъекции.
Выдвигалось множество сомнений, является ли это количество цитокинов, проникаюїцих в мозг, физиологически существенным (Rivest et al., 1995; Rothwell et al, 1996; Watkins et al., 1995). Действительно, кажется маловероятным, что такая незначительная концентрация цитокинов, проникающих в мозг с использованием межклеточного насыщаемого механизма переноса, может вызывать столь быстрый эффект. Однако кажется вероятным, что такие транспортные механизмы проникновения в ВВВ могут играть существенную роль, когда периферийный уровень эндогенных цитокинов в крови остается повышенным в течение длительного промежутка времени. Например, при рассмотрении хронического воспаления, когда уровень 1L-6 в плазме может оставаться высоким в течение длительного периода (от нескольких часов до нескольких недель).
6. Синтез цитокинов в мозге.
Последние исследования показывают, что IL-1, как и другие цитокины, синтезируется не только на периферии, но и в мозге, что поднимает вопрос о
влиянии синтезированного таким образом IL-1 на секреторную активность оси ГГН. Данные о распределении рецепторов IL-1 в мозге, доступные в настоящее время, говорят о том, что IL-1, синтезированный в мозге, не может играть заметную роль в регулировании активности гипоталамуса, так как рецепторы IL-1 располагаются преимущественно в околобарьерной области (например, в периваскулярных элементах) и подходят для передачи сигналов от IL-1 из крови в мозг, но не для передачи сигналов от IL-1, синтезированного непосредственно в самом мозге. Единственным ядром гипоталамуса, которое содержит рецепторы IL-1, является дуговидное ядро, которое, как известно, оказывает влияние на активность оси ГГН, но его роль в передаче сигналов IL-1 пока не определена (Ericsson et al., 1995).
Несмотря на недостаточность данных, объясняющих непосредственное воздействие IL-1, синтезированного в мозге, на ось ГГН (с учетом вышеописанного расположения рецепторов IL-1), цитокин TL-1, введенный непосредственно в мозг, увеличивает синтез мРНК КРГ в ГШЯ, что увеличивает секрецию КРГ, влекущую за собой рост концентрации АКТГ и кортикостероиа в плазме крови. При этом для стимуляции оси ГГН требуются меньшие дозы ГГ-1, чем при периферическом введении (Andrew et al, 1999).
Патологии, связанные с прямым повреждением клеток (инфекции, травмы и т.п.), запускают синтез IL-1 в мозге. К сожалению, лишь несколько исследований было посвящено данному процессу; в них было подтверждено, что существует связь между вирусным заболеванием и активацией оси ГГН с помощью IL-1, синтезированного в мозге (llyin et al, 1997; Raber et al, 1996). Многие исследователи стали придавать большое значение концепции нейроиммунной регуляции, то есть задаваться вопросом, влияют ли события, не связанные с прямым поражением клеток, на синтез цитокинов в мозге ~ в частности, в работах рассматривалась возможность того, что иммунный или воспалительный ответ на периферии дублируется (или даже инициируется) синтезом цитокинов в НДС, и было показано, что периферическое введение
LPS действительно приводит к секреции цитокинов, в том числе и к синтезу IL-1 в мозге, а введение в мозг anti-lL-І (3 антител ингибирует действие IL-1 и, таким образом, ослабляет острую фазу ответа на периферическое введение LPS (Klir et al., 1994; Rothwell et al., 1990).
Еще более убедительное подтверждение влияния IL-1, синтезированного в мозге, на ось ГТН поступило с неожиданной стороны -из исследований, посвященных нейроэндокринным реакциям на стресс в результате обездвиживания (Minami et al., 1991; Shmtani et al,, 1995): mPLIK IL-lfS синтезировалась в гипоталамусе крыс в течение 30 минут от начала опыта, достигала своего пика около 60 минут от начала опыта и оставалась повышенной при замерах около 120 минут от начала опыта.
Таким образом, хотя имеются достоверные факты, подтверждающие возможность синтеза IL-1 в мозге во время поражений ЦНС, сильных физических и психологических стрессов, только в малом количестве работ считается, что синтезированный в мозге 1L-1 играет большую роль в секреторной регуляции оси ГТН (Tsien et al., 1996).
Заключение
Основополагающие открытия Беседовского и Блалока продемонстрировали, что IL-1 является важным эндогенным регулятором оси ГГН. В настоящее время известно, что множество цитокинов способно оказывать аналогичное влияние.
Цитокиновые рецепторы были обнаружены во многих нейроэндокринных тканях.
Общепризнанным является тот факт, что влияние на ось ГГН происходит не только извне - цитокины не только попадают в ЦНС с кровью, но и синтезируются в мозге и надпочечниках. Афферентные нейроны, наподобие представленных в блуждающем нерве, также могут быть целью цитокинов - они передают информацию о воспалении в мозг.
Наконец, в последнее время выдвигают предположение, что цитокиновая регуляции оси ГГН может происходить не только во время инфекционного заболевания, воспаления или в результате травмы, но также под действием физических и психологических стрессов независимо от наличия вышеперечисленных общепризнанных факторов.
Очевидно, что гипофиз и надпочечники представляют собой потенциальные мишени для цитокинов (когда данные органы подвержены продолжительному влиянию их повышенной концентрации), однако большинство данных показывает, что и прямая, и косвенная стимуляция секреции КРГ в гипоталамусе является основным средством, с помощью которого цитокины (как минимум IL-1, IL-6 и TNF-a) активируют ось ГГН.
Существует множество различных механизмов воздействия IL-1 на ось ГГН. В случае, когда уровень IL-1 повышается эндогенно (в отличие от экзогенного введения), механизмы активации сильно зависят от анатомического положения тканей и жидкостей, в которых наблюдается значительное повышение концентрации IL-1 (кровь, периферийная ткань, мозг), однако в реальных условиях трудно выделить одного конкретного виновника. Например, при локальном воспалении, когда уровень IL-1 повышается только в поврежденных тканях, механизм воздействия с помощью афферентных нейронов кажется наиболее подходящим кандидатом на роль активатора оси ГГН. Однако, IL-І активизирует секрецию IL-6, который получает доступ к кровотоку, таким образом, хотя бы частично оказывая влияние на ось ГГН. Ситуация еще больше усложняется, так как ни один из предлагаемых механизмов активации не принимает во внимание тот факт, что выделение лишь одного цитокина в ответ на угрозу гомеостазису является очень маловероятным, а систематических исследований, посвященных одновременному влиянию множества цитокинов на ось ГГН (например, IL-1 и IL-6), не проводилось.
Вероятно, наиболее важным результатом огромного количества исследований, посвященных механизму активации IL-1 оси ГГН, является
І-
установление существования большого разнообразия способов иммунонейроэндокринного взаимодействия. Это разнообразие дает уверенность, что факт возникновения угрозы клетке, ткани или всему живому организму будет тем или иным способом доведен до оси ГГН.
Часть И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
