Введение к работе
Актуальность проблемы.
Окислительный стресс является ключевым звеном патогенеза большинства известных заболеваний. Антиоксидантные препараты нашли широкое применение в различных областях медицины. В клинической практике в настоящее время используют в основном так называемые не-ферментативные антиоксиданты - ретинол, а-токоферол и другие подобные им соединения. В отличие от них, ферменты обладают гораздо большей активностью и специфичностью действия. Однако практически единственным ферментом, применяемым в качестве антиоксиданта, остается супероксид-дисмутаза. Поэтому разработка и внедрение в клиническую практику ферментативных антиокси-дантов является важной задачей для исследователей. Особый интерес в этом плане представляет церулоплазмин (ЦП), выделенный из плазмы крови человека. Данный препарат успешно применяют в комплексной терапии онкологических больных (Эделева Н.В. и др., 1997), при лечении анемии различного генеза (Сакаева Д.Д., Жбанкова Т.И., 2002). Преимуществом ЦП является то, что он не только выполняет роль антиоксиданта, но и участвует в метаболизме железа (Osaki S., 1969) и меди (Stoj С, Kosman D.J., 2003), а также оказывает влияние на активность ферментов, регулирующих сосудистый тонус (Segelmark М. et al., 1997; Bianchini A. et al., 1999).
Широкомасштабное производство препарата ЦП ограничено рядом факторов, главным из которых является его нестабильность, обусловленная влиянием протеолитических ферментов (Соколов А.В., Соловьев К В , 2002; Ryden L., 1971). Необходима оптимизация технологии производства ЦП, позволяющая снизить действие факторов инактивации и получить фермент с максимально сохраненной активностью.
Важной проблемой является выяснение механизма действия препарата. Признано, что ЦП относится к реактантам острой фазы, т.е. его активность существенно возрастает при воспалении и стрессе. В то же время положительный эффект препарата отмечен при лечении заболеваний, сопровождающихся увеличением вьіработкні ЭДй*0^М&ЩЫХ белков' ревматоидного
I иммотсмНА*1
4 артрита (Карякина Е.В. и др., 2001), ожоговой болезни (Тарасенко М.Ю., 1995), ишемической болезни сердца (Закирова А.Н., 1995) и др. Необходимо установить природу нарушения функций ЦП при различной патологии для точного определения областей его возможного использования.
Расширение спектра клинического применения препарата требует также выяснения возможности реализации прооксидантного эффекта ЦП. Установлено, что in vitro нативный ЦП способен не только ингибировать, но и активировать процессы свободно-радикального окисления (Ehrenwald Е. et al., 1994). Имеются предположения о возможном участии ЦП в патогенезе атеросклероза, связанном с усилением процессов перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ) из-за наличия редокс-активных атомов меди в его молекуле (Klipstein-Grobusch К. et al., 1999; Craig W.Y. et al., 1995; Mezzetti A. et al., 1999). Проокисдантный эффект наблюдается и у других антиоксидантних препаратов, например, у токоферола и ретинола (Dyatlov V.A. et al., 1998; Rice M.E., 2000). Необходимо изучить влияние ЦП на процессы перекисного окисления in vivo для определения возможных противопоказаний к его клиническому применению.
Особого внимания заслуживает гемостимулирующий эффект ЦП. Механизмы, лежащие в его основе, не установлены. Во-первых, ЦП является переносчиком меди, необходимой для кроветворения (Osaki S. et al., 1966), во-вторых, функционирует как ферроксидаза, окисляя двухвалентное железо до трехвалентного и способствуя его утилизации; в-третьих, усиливает резистентность стволовых клеток к различным повреждающим факторам (Берлинских Н.К. и др., 1984). Недавно установлено, что ЦП является фактором, регулирующим содержание железа в тканях организма, и способствующим его выведению в случае переизбытка (Attieh Z.K. et al., 1999; Patel N.B. et al., 2002; Sarkar J., et al., 2003). В связи с этим необходимо определить факторы, за счет которых реализуется антианемическое действие препарата Учитывая вышеизложенное, была сформулирована цель и определены задачи настоящего исследования.
5 Цель работы - установление механизмов, лежащих в основе изменения свойств ЦП; разработка технологии получения нативного фермента; изучение безопасности и клинической эффективности препарата «Цер>лоплаз-мин». Задачи исследования.
-
Провести детальный анализ изменения свойств ЦП на различных стадиях очистки и установить причину нестабильности препарата.
-
На основе полученных данных разработать оптимальную технологию производства препарата.
-
Определить условия реализации антиоксидантного и прооксидантного эффектов ЦП in vivo, определить их зависимость от физико-химических свойств препарата.
-
Установить характер нарушения функций ЦП при патологии, определить основные механизмы развития этих нарушений.
-
На основании полученных данных определить возможную область применения препарата, и провести анализ его клинической безопасности и эффективности.
Научная новизна.
Доказано, что основной причиной снижения ферментативной активности ЦП как in vitro, так и in vivo является окислительная модификация. Предложен метод определения специфической активности (СпА) ЦП, позволяющий оценить соотношение активной и неактивной форм фермента. Установлено, что данный параметр является постоянной величиной при нормальных условиях и меняется при патологии в зависимости от характера течения заболевания.
Доказано, что ЦП не проявляет прооксидантных свойств in vivo. Вводимый препарат способствует нормализации соотношения активной и неактивной форм фермента и уровня свободно-радикального окисления.
Предложен механизм антианемического действия препарата, состоящий в восстановлении метаболизма железа, нарушенного по типу «анемии хрони-
ческих заболеваний». Обнаружена взаимосвязь между лечебным эффектом препарата и концентрацией сывороточного ферритина.
Впервые продемонстрирован антигипоксический эффект ЦП в эксперименте на модели гипобарической гипоксии (решение о выдаче патента по заявке №2003103889). Установлен нейропротективный эффект ЦП при лечении больных сахарным диабетом (Патент RU 2240808, опубл. 27.11.04) и дисцир-куляторной энцефалопатией (Патент RU 2242989, опубл. 27.12.04). Обнаружен нефропротективный эффект ЦП при лечении сахарного диабета.
Практическая значимость.
Проведенные исследования позволили установить причину снижения ферментативной активности ЦП. На основании полученных данных предложен способ получения активного препарата, защищенный патентом RU 2225725, опубл. 20.03.04.
Исследования СпА ЦП позволили определить нормальные значения данного показателя и использовать его в качестве диагностического критерия при различных заболеваниях. Определено прогностическое значение СпА ЦП при остром деструктивном панкреатите (Патент RU 2236680, опубл. 20.09.04).
Продемонстрирована возможность внутримышечного способа введения препарата в организм.
Полученные доказательства безопасности и клинической эффективности ЦП при лечении острого деструктивного панкреатита, сахарного диабета, дисциркуляторной энцефалопатии свидетельствуют о возможности применения ЦП при данных заболеваниях.
Внедрение в практику.
Технология получения ЦП внедрена на Нижегородском государе і венном предприятии по производству бакпрепаратов фирме «ИмБио» Разработан промышленный регламент на препарат церулоплазмин лиофилизированный для инъекций №01898718-30-2000, согласованный с Гематологическим научным центром РАМН.
7 Основные положения, выносимые на защиту.
-
Причины изменения физико-химических свойств и ферментативной активности ЦП.
-
Технология получения стабильной формы препарата «Церулоплазмин» с сохранением ферментативной активности.
-
Факторы, определяющие антиоксидантные и прооксидантные свойства ЦП.
-
Закономерность изменения активности ЦП при патологии.
-
Зависимость антианемического эффекта ЦП от уровня железа в организме пациента.
Апробация работы.
Основные результаты и положения работы доложены на V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998); на научно-практической конференции «Производственная трансфузиология на рубеже XXI века» (Москва, 1999); на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000); на международном медицинском форуме «Человек и травма» (Н.Новгород, 2001); на I конгрессе неврологов, психиатров, нейрохирургов Приволжья «Нейрохирургия и здоровье человека» (Н.Новгород, 2002); на научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003); на III Международном урологическом симпозиуме «Диагностика и лечение рака предстательной железы» (Н Новгород, 2003); на II Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2003); на II съезде анестезиологов и реаниматологов юга России (Анапа, 2003); на IV рабочем совещании руководителей центров и отделений детской гематологии/онкологии (Москва, 2003); на I Российском международном конгрессе «Цереброваскулярная патология и инсульт» (Москва, 2003); на IX конгрессе педиатров России (Москва, 2004); на конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ (Н.Новгород, 2004).
Объем и структура диссертации.
