Введение к работе
Актуальность проблемы, В настоящее время большое внимание уделяется проблеме биоко и персик к, в частности, 6и оде градации одітого из самых устойчивых к химическому и микробиологическому разложению биополимера лигнина. Базидиалькые триоы, возбудители белой гнали, являются един с шинными микроорганизмами, способными разрушать лигнин. Они синтезируют комплекс лигнолитического действия, при ни аюшиіі участие R процессе деградации лигнина. Не специфичность ферментов л и гнел итач ее к ого действия и их высокая окислительная способность открывают широкие возможности для использования как самих грибов ли гни политиков, так и их лигнияол иг ических ферментов в системах лето ксифика ним и деградации ксенобипгиков. б и оре медиации почв 11 иод.
Разработка экологически чистых биотехнологий как япя обработки и модификации л игни л содержащих материалов, так и для утилизации лигнин с о держащих от ходо а (в особенности для целлюлоз но- бумажной и текстильной промышленности )і интенсафицирозала изучение механизма деградации лигнина базидиальными грибами и роли их лиги и полити ческах ферментов в этом процессе. Результаты эткя исследований дадут возможность оценить вклад различных ферментов а процесс делигнцфикадаи и установить корреляцию между эффективностью деградации лигнина, биосинтезом тгштпитичеект ферментов и особенностями механизма их действия.
Как известно, лакказа (я-лифенол:кислород окендоредуктаза, КФ Ы 0,3.2) является одним из основных лигнинопитических ферментов и играет ключевую роль в протіессе деградации лигнина. Лаккааа относится к классу медьсодержащих оксида и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями непосредственно до волы, минуя стадию образования перекиси водорода. Эти ферменты обладают широкой субстратной специфичностью, когорто можно увеличить, используя ре до к с-медиаторы. В присутствии последних лакказы могут окислять нефенолькые соединения различной природы. Кроме того, способность лакказ катализировать реакцию гэлектро восстановления кислорода ло безмедиаторному механизму привлекает большое внимание к изучению кинетических и з л екгро каталитических свойств фермента как перспективного катализа-юра электродных процессов. Таким образом, лакказа является одним ні ферментов, чьи каталитические свойства обеспечивают возможность ее широкого применения в различных отраслях биотехнологии. Для эффективного применения фермента необходимо знание механизма его действия и структуры. Однако, несмотря на более чем столетнюю историю исследования лакказы, широкий круг вопросов касающихся каталитического механизма действия фермента, особенностей его биосинтеза, регуляции активности и физиологической роли, остается невыясненным. Таким образом, взаимосвязь структура - функции для данного фермента остается вопросом, требующим дальнейшего изучения. Установление структурно-функциональной взаимосвязи является актуальным как с теоретической (прйнциїтьі организации и функционирования медьсодержащих сжеидаз); так и с практической точки зрения (использование фермента для делигниф икании, бнорсмеднаоии, ко і га ере ии лигниясодержагцего сырья и отходов, в биосенсорных технологиям и органическом синтезе). Цела, работы - молекул чрно-функциональкые лсследовакия группы базидиальных їрибов, синтезирующих зысскоредокспотенциальные лакка-ш и установление взаимосвязи структура - функции медьсодержащей оксидазы - лакказы.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:
1. Разработать стратегию скрининга базидиомшетов, отличающихся высоким уровнем синтеза лакказ и провести филогенетическое позиционирование выбранных штаммов - продуцентов высокоредокспотенцналышх лакказ.
2. Изучить фюнолого-бвохшлческие особенности биосинтеза лигнинолитических ферментов при различных типах культивирования и в присутствии индукторов биосинтеза лакказ, включая сравнительной исследование физиков им ическнх и биохимических свойств внутриклеточного и индуцибельных/консгитугивных форм внеклеточного фермента.
3. Оптимизировать до пилотного уровня условия культавированш штаммов-продуцентов, обеспечивающие высокий выход лакказ, и исследовать их основные биохимические, физяко-химические, каталитические и электрохимические свойства,
4. Исследовать кинетический механизм ферментативной реакции, включая взаимодействие фермента с молекулярным кислородом, гидрагированньш электроном и суперокенд-раднкалом. Установить пути трансформации субстрата-донора электронов ферментативной реакции с использованием в качестве модельных компонентов ферутовой ц синаповой кислот - структурных звеньев лиственного лигнина.
5. Провести сравнительное изучение рН- и температурно-индуднрованных изменений структуры активного центра нативной лаккалы н ее произподных, а также их каталитического и электрохимического поведения различными методами,
6. Исследовать структурные особенности лакказ (первичную и третичную структуру) к на основе полученных данных разработать схему механизма катализа,
7. Исследовать физиологическую роль лакказы в процессах делигпификаши, детоксификации и синтеза гуминоподобных веществ,
8. Разработать подходы к практическому использованию фермента в системах детоксификации, лелигнифжации, пммуноферментном анализе и биосенсерных технологиях,
Научная новизна работм. Впервые на основе молекулярно-функциональной стратегии исследована группа базндиальньгх грибов, синтезирующих высокоредоксиотеяциальные лакказы. Установлена прямая корреляция дтнолитического потенциала штаммов, биосинтеза ими высокоредоксиотонцишп. ных лакказ и генетической организации (сравнение последовательностей 2SS РНК). Показана возможность совместного культивировании штаммов Cerreira maxima (активный продуцент Мг-пероксндачьі) н Coriolus hirsutus (активный продуцент лакказы). В процессе твердофазного культивирования индивидуальных и смешанной культур на березовых опилках наблюдалась.. высокая активность ферментов лигшлитического комплекса: лакказы и Mn-пероксндазы. Установлено, что ключевым ферментом при разложении лигноцеллюлодного комплекса овсяной соломы являлась яакказа при обоих температурных режимах культивирования (28"С и 37°С).
Выделены я охарактеризованы лакказы ю С. hirsutus. Сет. maxima, С. zonatus и Coriohpsfs Julvocenerea. Проведено сравнительное изучение их основных биохимических и физико-химических свойств, субстратной специфичности, каталитических параметров, электрохимического поведения и спектральных характеристик Установлено, что механизм действия этих ферментов относится к группе "пинг-понг" механизмов. Исследованы пути трансформации субстрата ферментативной реакции с использованием в качестве молельных компонентов феруловой и синаповой кислот. Изучено прямое взаимодействие молекулярного кислорода с ферментом, которое, по-видимому, является основной причиной снижения энергетического барьера при окислении субстрата. Методом импульсного радиолиза исследовано взаимодействие лакказы с гидратироаанным электроном и Ог и предложен механизм данных реакций. Обнаружено, что аномальное поведение 0/ при варьировании концентрации лакказы не связано ни с увеличением реакционной способности последней в аэробных условиях относительно гидратированного электрона (е ") и/или карбоксианион-радикала, ни с дефицитом Ог в растворе.
Изучение термостабильности лакказ методом сканирующей микрокалориметрии показало, что исследованные ферменты являются одними из наиболее термостабильных лакказ. Температуры плавления белковых частей молекул лакказ С hirsutus и С, zonatus составляют 87°С и 92°С На основании данных сканирующей микрокалориметрии лакказ и их производных с удаленным ионом меди второго типа сделано предположение о трехдоменной структуре данных лакказ, которое было подтверждено рентгеноструктурными исследованиями лакказы С. hirsutus.
Установлена первичная аминокислотная последовательность лакказы С. hirsutus, расшифрована пространственная трехмерная структура фермента с разрешением 1,8 А.
Проведено сравнительное изучение рМ и темнературно-индуцированных изменений структуры активного центра лакказы и лакказы с удаленным ионом меди второго типа, а также их каталитического и элекзрохимического поведения различными методами, включая методы Л MP и ЭПР спектроскопии. Впервые проведено ЯМР исследование парамагнитного фермента - лакказы. На основе полученных данных установлена структура двух интермедиатов лакказы и предложен механизм структурных перестроек активного центра в процессе кат&тиза.
Установлена новая физиологическая функция лакказы грибов белой гнили -участие в образовании гуминоподобных веществ. Впервые проведена комплексная характеристика гуминоподобных веществ, образованных грибами белой гнили при культивировании на растительном субстрате (овсяной соломе). Установлено, что по элементному, структурно-групповому и молекулярно-.массовому составу ГПВ близки к почвенным ГК. Показано, что предшественниками ГПВ являются продукты деструкции лигнина. Путем прямого ферментативного синтеза, инициированного лакказой Cer. maxima из низкомолекулярных соединений, продуктов деструкции лигнина, а также аминокислот, получены гуминоподобные вещества. По своим характеристикам данные ГПВ были близки природным ГК и ГПВ грибов белой гнили.
Изучен процесс биодеградации ксенобиотиков базидиальными грибами с использованием атразипа в качестве модельного ксенобиотика. Усыновлена ключевая роль лакказы в деградации атразина in vitro и in vivo. Предложен механизм данного процесса. Практический значимости Полученгтые фундаментальные знания о взаимосвязи структуры яакказ и механизма та действия, а также физиолоїяческой роля этих ферментов имеют важное значение для практического конструирования систем делигнификагган, детоксификации и биотрансформашш на основе лакказ. Разработаны приемы использования лшгнинодитическкх ферментов для делипшфыкациж а отбеливания растительного волокна, позволяющие достигать высокой степени делигниф икании (Артемов А.В., Подов В.О-, Королева 0,В. и пр., 2006; Попов В.О., Королева О-В. и др. Заявка № Q40211 от 21.11.2005). Изучен лроцесс детоксификации ксенобиотиков, с использованием в качестве модельного соединения атразики. Показана эффективность деградации данного ксенобиотика батидиомицетами и продуцируемыми ими лигаинолитическими ферментами (до 90%) (Koroleva et аЦ 2О0І; Gorbatova, О., Koroleva О., et al., 2001). Впервые установлена ключевая роль лакказы в синтезе гуминошдобных соединении базидиальными грибами, что позволило не только расширить представления о роли фермента в генезисе гуминовых веществ, по к разработать подходы к созданию нового типа биоудобрении (Явметдиков И.С, Степанова Е.В., Гаврилова В.П., Локшнн Б.В., Псрмшова Й.В., Королева 0,В., 2003- Gavrilova V.P.5 Yakovteva N S., Koroleva O.V., 2001), Впервые потсазана возможность использования лакказы в качестве фермента-маркера для иммуноферментного анализа в различных вариантах ИФА со спектрофотометричеокой и флуоресцентной системой детекции (O.Y.SKorobogafko et ві, 1994; О-В.Скороботатькс и др., 19°5; 0,В,Скоробогатько и др., Патент Дь 5020557, 27.05.92; А.И.Джафарова, О.В Скоробогатько и др., 1995). На основе коньюгатов лакказа-ангиген и лакказа-антитело показана принципиальная возможность создания пеевдобезмешаторных иммукосенсоров на основе прямого биоэлектрокатализа (Kuznetsov В.A., Shumakovich G,R, Koroleva 0."V, et ai, 2001). Разработаны шыуносеисоры на основе лакказы для определения инсулина, иммуноглобулина G, морфина и кодеина (Huang Т., Warsinke A., Koroljova-Skorobogafko O/V. et al, 1999; Bauer C,G., Kuhn A., Gajovic N., Skorobogafko (Koroleva) (XV. et al,s 1999). Разработан метод для тестирования фенольних компонентов вин (определение антиоксидантной активности вино дел ьчхекой продукции) на основе грибных яахназы и тнрозишзы с электрохимической системой детекции (Шлесв С-В-, Чеканова С.А., Королева О.В. и пр., 2004). Данный метод аппретирован на различных стадиях технологического процесса виннфикации и пастеризации красных сухих вин (Oganesjam L.A„ Telegin їй. А.3 Stnjkina S.E., T chekimowa S.A. Koroljowa OW. et аЦ 2005; Yakovleva K.E., Stepanova E.V.t Landcsmati E.O., Chckanova S.A,, OganeEJaats LA., Telegin YuA., Koroleva O.V„ 2004; ЛксолеяаКЭ., Королева О.В. и др., 2005).
