Введение к работе
Актуальность темы исследования
Разработка технологии создания новых средств диагностики и терапии - одно из наиболее актуальных направлений развития современной персонализированной медицины. В последнее время в качестве лекарственных препаратов стали использовать биофармацевтики, среди которых все более популярными становятся аптамеры, представляющие собой фрагменты однонитевой РНК или ДНК. При взаимодействии комплементарных участков цепи олигоігуклеотидьі образуют уникальные трехмерные структуры, способные к различного рода взаимодействиям и связям с функциональными группами молекулярных мишеней, что определяет их способность к специфическому связыванию (Кульбачинский А.В., 2006; Радько СП. и др., 2007; Спиридонова В.А., 2010; Patel D.J., Suri А.К., 2000; Spiridonova V.A., Kopylov A.M., 2002; Iliuk A.B. et al., 2011). Благодаря своей уникальной конформации, аптамеры могут связываться с любыми биологическими мишенями, что создает основу для разработки эффективных диагностических и терапевтических препаратов.
Преимущества аптамеров заключаются в том, что их можно химически синтезировать, модифицировать красителями, метками, токсинами, что позволяет использовать их в различных целях. Кроме того, аптамеры термостабильны, а при потере аффинности их свойства могут быть легко восстановлены (Iliuk A.B. et al., 2010). И, наконец, аптамеры неиммунногенны и нетоксичны (Ulrich Н., 2006).
Спектр применения аптамеров, обладающих высоким сродством к мишеням, достаточно широк - от визуализации и количественной детекции мишеней (Iliuk A. et al., 2011) до использования их в качестве терапевтических препаратов или для адресной доставки лекарственных средств (Давыдова А.С. и др., 2011; Ulrich К, 2006).
Одним из наиболее важных объектов для селекции аптамеров, наряду с другими, являются бактериальные клетки, что вызвано необходимостью очень быстро и точно определять наличие патогенов в биологических жидкостях и пищевых продуктах, поскольку известно, что до 30% населения промышленно развитых стран ежегодно страдает болезнями пищевого происхождения. Из всех возбудителей кишечных инфекций наибольшую опасность представляют сальмонеллы вследствие того, что они вызывают генерализацию инфекционного процесса, часто заканчивающегося эндартериитом, циррозом печени, септическим артритом, менингитом, остеомиелитом, пневмонией и другими заболеваниями (Pegues D.A. et al., 2005).
В связи с распространением кишечных инфекций остро стоит проблема определения их возбудителей, как в продуктах питания, так и в биологических жидкостях, поскольку успешный прогноз в лечении
инфекционных заболеваний зависит от ранней идентификации микроорганизма, анализа его патогенности и лекарственной устойчивости.
Существующие методы детекции микроорганизмов варьируют по времени исследования: от 30 минут до 24 часов (Дубинина И.Г. и др., Сакаль Н.Н., 1993) и, к тому же, по-прежнему существует проблема недостаточной чувствительности и специфичности этих методов, поскольку необходимо не просто определить наличие патогена, но и установить его жизнеспособность.
Кроме того, в настоящее время отмечается рост количества высокопатогенных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, эффективность лечения которых напрямую зависит от резистентности бактерий к применяемым в лечении антибиотикам. Инфекции, вызываемые резистентными микроорганизмами, чаще приводят к летальному исходу и затрудняют борьбу с инфекционными заболеваниями, поскольку пациенты остаются носителями заболевания на протяжении длительного времени, что способствует передаче устойчивых штаммов другим людям. В связи с постоянным повышением лекарственной устойчивости бактерий медицина нуждается в быстрых, обладающих высокой точностью методиках определения степени резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
Недостатки традиционных способов диагностики и терапии позволяют преодолеть методы с использованием аптамеров, хотя опыт их применения для детекции возбудителей кишечных инфекций ограничен (Joshi R., 2007; Dwivedi Н.Р., 2007).
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось получение аптамеров к двум серотипам сальмонелл - S. enteritidis и S. typhimurium, обладающих разной патогенностью и чувствительностью к антибиотикам, и исследование их диагностических и терапевтических свойств.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Подобрать уникальные последовательности ДНК-аптамеров к S. enteritidis и S. typhimurium с помощью технологии cell-SELEX, определить их специфичность и аффинность и выбрать из них наиболее специфичные к S. enteritidis и S. typhimurium.
-
Разработать на основе ДНК-аптамеров способ выявления возбудителей сальмонеллеза (S. enteritidis и S. typhimurium) в биологических жидкостях.
-
Исследовать биологический эффект ДНК-аптамеров к S. enteritidis и S. typhimurium.
-
Разработать на основе ДНК-аптамеров способ определения антибиотикоустойчивости.
Научная новизна.
-
Впервые получены ДНК-аптамеры к S. enteritidis.
-
Впервые показано, что смесь синтетических ДНК-аптамеров к S. enteritidis и S. typhimurium подавляют бактериальный рост, что показывает
возможность создания на основе ДНК-аптамеров антибиотиков нового поколения.
3. Впервые аптамеры были использованы для создания метода определения чувствительности сальмонелл S. enteritidis и S. typhimurium к антибактериальным препаратам.
Теоретическая и практическая значимость.
На основе полученных уникальных последовательностей аптамеров к бактериям 5. enteritidis и S. typhimurium могут быть разработаны диагностические тест-системы для определения возбудителей сальмонеллеза и определения их антибиотикоустойчивости. Кроме того, ДНК-аптамеры могут стать основой создания бактериостатических препаратов для лечения сальмонеллеза и средством адресной доставки антибактериальных препаратов.
Апробация результатов. Основные положения диссертации опубликованы в 6 статьях, в том числе, 3 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 3 - в зарубежной печати. Результаты исследования представлялись на конференции с международным участием «Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний», 2012 (г. Красноярск), X съезде научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации, 2012 (г. Москва), семинарах ассоциированной Российско-Канадской лаборатории BioMeT, Международном Симпозиуме 13th Tetrahedron Symposium, 2012 (Тайбэй, Тайвань) и Международной конференции OTS, 2013 г. (Неаполь, Италия).
Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на 117 страницах машинописного текста, иллюстрирован 39 рисунками, 8 таблицами. Работа состоит из введения, глав: обзор литературы; материалы и методы; результаты собственных исследований; заключения; выводов; списка литературы. Список литературы состоит из 173 источников, из которых 12 - российских и 161 — зарубежный.
