Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Антитела к нативной ДНК как критерий диагностики аутоиммунных заболеваний 12
1.2. Наногравиметрические биосенсоры как инструмент биохимических исследований 16
1.2.1. Биосенсоры на основе пьезокварцевых резонаторов 18
1.2.2. Физические основы масс-чувствительности пьезокварцевых резонаторов 22
1.2.3. Конструирование пьезокварцевого биосенсора 26
1.2.4. Иммобилизация биологического компонента биосенсора 28
1.3. Методы формирования и изучения свойств ДНК-содержащих
рецепторних покрытий биосенсоров 31
1.3.1. Ковалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот 36
1.3.2. Нековалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот 45
1.3.3. Бионанотехнологические подходы к иммобилизации нуклеиновых кислот 49
1.3.4. Атомно-силовая микроскопия как инструмент для изучения биологических объектов 51
1.4. Заключение по обзору литературы 54
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 55
2.1. Оборудование и реактивы 55
2.2. Объекты исследований 57
2.3. Кварцевые микровесы - устройство и применение 58
2.3.1. Кварцевые микровесы для анализа в газовом режиме 58
2.3.2. Кварцевые микровесы QCM 200 59
2.4. Проточно-инжекцирный режим исследования 63
2.4.1. Дегазация растворов 63
2.4.2. Термостатирование 63
2.4.3. Установка проточной ячейки 63
2.4.4. Перистальтический нанос и система трубок 64
2.5. Предварительная обработка и очистка электродов ПКР 64
2.6. Нанесение биологических пленок на электрод ПКР 67
2.7. Определение слоя-предшественника для иммобилизации ДНК 67
2.8. Формирование поли-Ь-лизинового слоя-предшественника 68
2.8.1. Определение оптимального значения рН 68
2.8.2. Определение оптимального значения температуры 68
2.8.3. Определение оптимального времени инкубации 69
2.8.4. Определение оптимальной концентрации поли-Ь-лизина 69
2.8.5. Зависимость формирования поли-Ь-лизинового слоя-предшественника от материала и обработки поверхности электрода ПКР 69
2.9. Визуализация поверхности электродов кварцевых резонаторов методом атомно-силовой микроскопии 69
2.10. Формирование ДНК-содержащей пленки 70
2.10.1. Определение чистоты и однородности препарата нативной ДНК 70
2.10.2. Определение буферного раствора 71
2.10.3. Определение оптимальной концентрации ДНК 71
2.10.4. Определение оптимального значения температуры 71
2.11. Характеристика формирования и свойства ДНК-содержащей пленки 71
2.11.1. Изучение взаимодействия иммобилизиованного поли-Ь-лизина и ДНК in situ 72
2.11.2. Кинетика связывания поли-Ь-лизина и ДНК 73
2.11.3. Определение вязкостно-эластичных свойств ДНК- содержащей нанопленки 73
2.12. Визуализация поверхности ДНК-содержащей нанопленки методом атомно-силовой микроскопии 73
2.12.1. Предварительная обработка золотых подложек 74
2.12.2. Приготовление проб для исследования 74
2.12.3. Визуализация наноструктурированных поверхностей с помощью АСМ 75
2.12.4. Обработка АСМ-изображений 76
2.13. Применение ДНК-содержащей нанопленки в качестве чувствительного слоя пьезокварцевого биосенсора 76
2.13.1. Блокировка сайтов неспецифического связывания 76
2.13.2. Иммуноанализ 77
2.14. Оценка результатов и статистическая обработка 77
2.14.1. Пьезокварцевая масс-чувствительность в газовой среде 77
2.14.2. Пьезокварцевая масс-чувствительность в жидкой среде 78
2.14.3. Статистическая обработка результатов 80
ГЛАВА 3. Результаты исследований 81
3.1. Определение и формирование слоя-предшественника для иммобилизации нативной ДНК 81
3.1.1. Слой-предшественник для иммобилизации ДНК 82
3.1.2. Формирование поли-Ь-лизинового слоя-предшественника на серебряных электродах в газовом режиме 84
3.1.3. Определение характера формирования поли-Ь-лизинового слоя в зависимости от материала и обработки электродов ПКР 89
3.1.4. Формирование поли-Ь-лизинового слоя-предшественника на золотых электродах в газовом режиме 92
3.1.5. Регенерация электродов ПКР для последующего их использования 93
3.2. Формирование и характеристика ДНК-содержащей пленки 95
3.2.1. Определение чистоты и однородности нативной ДНК 95
3.2.2. Определение буферного раствора для иммобилизации ДНК 96
3.2.3. Определение оптимальной концентрации ДНК 97
3.2.4. Определение оптимальной температуры присоединения ДНК 98
3.2.5. Изучение взаимодействия иммобилизованного поли-L-лизина и ДНК in situ в проточно-инжекционном режиме 99
3.2.6. Влияние молекулярной массы поли-Ь-лизина на связывание нативной ДНК 103
3.2.7. Кинетика связывания нативной ДНК с иммобилизованным поли-Ь-лизином 105
3.2.8. Изучение структуры ДНК-содержащей пленки методом атомно-силовой микроскопии 106
3.3. Иммуноанализ при помощи ДНК-биосенсора на основе ДНК-содержащей нанопленки 109
3.3.1 Иммуноанализ в газовом режиме 109
3.3.2. Иммуноанализ в жидкостном режиме 112
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 121
Выводы 136
Литература 137
- Антитела к нативной ДНК как критерий диагностики аутоиммунных заболеваний
- Атомно-силовая микроскопия как инструмент для изучения биологических объектов
- Пьезокварцевая масс-чувствительность в жидкой среде
- Формирование поли-Ь-лизинового слоя-предшественника на серебряных электродах в газовом режиме
Введение к работе
Актуальность проблемы
Развитие биохимии в XXI веке определяется постоянным совершенствованием методов исследования. Последнее десятилетие происходит стремительное внедрение в биологическую науку новых подходов к изучению взаимодействия биологических макромолекул. В результате разработаны и постепенно входят в практику эффективные методы лабораторной диагностики различных заболеваний (Jain, 2005а).
Объектом пристального внимания исследователей являются антитела (AT) к ДНК, высокое содержание которых отмечается при системной красной волчанке (СКВ) и некоторых других аутоиммунных заболеванях (Blatt, Glick, 1999; Pincus et al., 2002, Pisetsky, 2004), в связи с чем постоянно ведется поиск новых методов анализа (Hahn, 1998).
Одним из подходов к детекции и изучению AT к нативной ДНК является разработка пьезокварцевых биосенсоров, отличающихся высокой чувствительностью и экспрессностью (Luppa et al., 2001; Kankare et al., 2006). Принцип действия пьезокварцевых биосенсоров основан на масс-чувствительности пьезокварцевого резонатора, позволяющей фиксировать изменения массы на поверхности электродов в субнанограммовом диапазоне (Lu et al, 2004). Применение таких биосенсоров в проточно-инжекционном режиме дает возможность изучить процесс взаимодействия макромолекул in situ (Marxer et al., 2003). Из альтернативных средств исследования в аналитической химии и материаловедении пьезокварцевые сенсоры превращаются в один из мощных инструментов молекулярной биологии, генетики, нейробиологии, микробиологии, иммунологии и биохимии (Shons et al., 1972; Ко, Park, 2005; Yang et al., 2006).
На сегодняшний день описаны пьезокварцевые биосенсоры для ДНК-диагностики (Zhou et al., 2001) и определения некоторых ДНК-связывающих белков (Kim et al., 2002). Для формирования ДНК-содержащего рецепторного
8 слоя подобных биосенсоров используется ковалентная иммобилизация однонитевых олигонуклеотидов (Mirsky, 2002).
Практически любой из биологически значимых полимеров - ДНК, белки, углеводы, может быть отнесен к нанообъектам, то есть таким объектам, хотя бы одно из линейных измерений которых не превышает 100 нм (Seeman, 2001; Котельников, 2004). Относительно недавно было установлено, что нанообъекты характеризуются особыми свойствами, позволяющими использовать их во многих научных и практических приложениях (Kawasaki, Player, 2005). Нанотехнология - область знания о структуре и свойствах нанообъектов, буквально ворвалась в биологию, предоставив последней целый арсенал высокоточных методов (Roco, 2003). Не исключено, что использование в качестве «строительных блоков» нанотехнологии таких биологических полимеров как ДНК (Park et al., 2005) в недалеком будущем позволит разработать наноустройтва и наномашины, которые коренным образом преобразуют современную науку и технику (Drexler, 1981).
Если еще недавно основное внимание уделялось традиционным методам, заключающимся в переходе от макрообъектов к микрообъектам, то сегодня разрабатывается также обратный подход - от малого к большему, или, как выразился один из основателей нанотехнологии Ричард Фейнман (Feynman, 1960; Silva, 2004): «снизу вверх». В связи с этим, в последние годы для формирования тонких пленок биологических веществ используются процессы самосборки молекулярных ансамблей (Winfree et al., 1998; Whitesides, Grzybowski, 2002). Формирование и структуру ДНК-содержащей нанопленки можно изучать методами наногравиметрического анализа и атомно-силовой микроскопии. Применение нанопленок в качестве биоселективных элементов сенсоров позволяет сохранить антигенные свойства нативной ДНК. Изучение процессов создания нанопленок представляет самостоятельный интерес для исследования многих аспектов
9 взаимодействия биологических макромолекул. В связи с этим представляется весьма актуальным разработка и определение свойств ДНК-содержащей нанопленки для использования в качестве чувствительного элемента пьезокварцевых биосенсоров для определения AT к нативной ДНК.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было получение и характеристика свойств ДНК-содержащей нанопленки для создания рецепторного слоя пьезокварцевого биосенсора.
В работе были поставлены следующие задачи: о исследовать сорбцию потенциальных слоев-предшественников (поли-Ь-лизин, фибронектин, спермин, спермидин и нафион) на поверхности серебряных и золотых электродов пьезокварцевых резонаторов и их способность к связыванию нативной ДНК; о определить оптимальные условия формирования поли-Ь-лизинового слоя-предшественника и ДНК-содержащей пленки; о охарактеризовать кинетику формирования, стабильность, вязкостно-эластичные свойства и структуру поверхности ДНК-содержащей нанопленки; о изучить возможность применения пьезокварцевого биосенсора на основе полученной ДНК-содержащей нанопленки для определения AT к нативной ДНК в сыворотке крови.
Научная новизна
Установлено, что поли-Ь-лизин может быть иммобилизован на поверхности серебряных и золотых электродов кварцевых резонаторов в процессе самосборки, без предварительной модификации металлической поверхности.
Впервые для изучения межмолекулярного взаимодействия ДНК и поли- L-лизина использован метод проточно-инжекционного
10 наногравиметрического анализа с одновременным измерением частоты колебаний и реактивного сопротивления кварцевого резонатора. Показано, что характер связывания ДНК и иммобилизованного поли-Ь-лизина зависит от вторичной структуры полинуклеотида. Описана кинетика связывания ДНК с иммобилизованным поли-Ь-лизином, определены эластичные свойства ДНК-содержащей нанопленки. Методом атомно-силовой микроскопии получены изображения ДНК-содержащей нанопленки и изучена структура ее поверхности.
Установлено, что полученная ДНК-содержащая нанопленка может быть использована в качестве распознающего элемента биосенсоров для определения AT к нативной ДНК.
Практическая значимость
Разработанный способ поэтапной иммобилизации поли-Ь-лизина и нативной ДНК на серебряных и золотых электродах кварцевых резонаторов может быть использован при конструировании других типов биосенсоров или ДНК-содержащих покрытий.
Представленный в работе протокол применения пьезокварцевого. биосенсора на основе ДНК-содержащей нанопленки может быть использован для экспресс-анализа AT к нативной ДНК.
Положения, выносимые на защиту:
Способ формирования на металлических поверхностях наноструктурированной эластичной ДНК-содержащей нанопленки.
Использование полученной ДНК-содержащей нанопленки в качестве чувствительного элемента пьезокварцевых биосенсоров для определения AT к нативной ДНК в биологических жидкостях.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2004-2006 гг.), на Международной научной конференции «Новая Геометрия Природы» (Казань, 2003), Всероссийской конференции "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии XXI века для диагностики и лечения заболеваний человека" (Петрозаводск, 2003), Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России -2004" (Москва, 2004), научно-практической конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), VI - VIII Международных научных молодежных школах "Когерентная оптика и оптическая спектроскопия" (Казань, 2002-2004), VI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2006), 10-ой Школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2006), XIII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Яльчик, Республика Марий Эл, 2006).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, включает 52 рисунка и 6 таблиц. Список использованных библиографических источников включает 262 источника, из них 245 - иностранные работы.
По материалам диссертации опубликовано 16 работ.
Антитела к нативной ДНК как критерий диагностики аутоиммунных заболеваний
Исследование взаимодействия нуклеиновых кислот и белков является одним из актуальных направлений в биологии. Такие взаимодействия осуществляются на всех этапах репликации и экспрессии ДНК, а также в ходе многочисленных процессов регуляции, следовательно, их роль в функционировании живых систем чрезвычайно велика (Зенгер, 1987). Кроме того, весьма важную роль играет взаимодействие ДНК и иммуноглобулинов, являясь одним из наиболее актуальных вопросов современной биохимии и иммунологии.
Антитела к ДНК присутствуют в крови как у практически здоровых людей или животных, так и у индивидуумов, страдающих некоторыми аутоиммунными заболеваниями (Holborow et al., 1957; Ceppellini et al., 1957; Robbins et al., 1957). Высокий уровень антител к нативной ДНК в сыворотке крови является характерной особенностью и одним из диагностических признаков системной красной волчанки. Повышение уровня аутоантител к нДНК в сыворотках крови здоровых доноров может являться предвестником аутоиммунной патологии (Eila, Naparstek, 1998). Установлена и корреляция между уровнем содержания AT к ДНК и тяжестью заболевания (Morimoto et al, 1982). Кроме того, было показано, что AT к ДНК обладают нуклеазной активностью и способны гидролизовать фосфодиэфирную связь полинуклеотида (Shuster et al., 1992). Дальнейшие исследования позволили установить, что наличие повышенного уровня содержания AT к ДНК отмечается при ряде других заболеваний, таких как бронхиальная астма (Paul et al., 1989), аутоиммунный тиреоидит Хашимото (Li et al., 1995) и др.
Биологическая роль AT к ДНК до сих пор не вполне ясна. Считается, что AT к ДНК в крови больных аутоиммунными заболеваниями выполняют как позитивные, так и негативные в отношении развития заболевания функции. Предполагается, что AT к ДНК могут участвовать в изоляции и нейтрализации как чужеродной, так и собственной ДНК (Grabar, 1983).
AT к нДНК, присутствующие в крови больных СКВ и другими аутоиммунными заболеваниями, представлены иммуноглобулинами классов G и М. AT к ДНК класса IgM обладают перекрестной активностью к различным антигенам, как собственным, так и экзогенным. Связывание таких AT с нуклеиновыми кислотами имеет, как правило, низкоаффинный характер. В отличие от них, AT к ДНК класса IgG обладают высоким сродством к ДНК и не характеризуются связывающей активностью в отношении неродственных антигенов (Hahn, 1998).
Среди AT к ДНК класса IgG выделяют три группы иммуноглобулинов -AT к нативной ДНК (нДНК), антитела к денатурированной ДНК (дДНК) и антитела, реагирующие как с нДНК, так и с дДНК. AT к дДНК обладают сродством ко всем компонентам денатурированной ДНК: основаниям, нуклеотидам, нуклеозидам и сахаро-фосфатному остову, тогда как AT к нДНК реагируют с дезоксирибофосфатным остовом и комплементарными парами оснований (Bill et al., 1997). У большинства больных системной красной волчанкой повышен уровень содержания в крови именно AT к нДНК, что приводит к образованию циркулирующих иммунных комплексов и способствует разрушению тканей и органов, например, почек. При этом уровень содержания коррелирует со степенью тяжести заболевания у большинства пациентов (Sany, 1990). Помимо этого, увеличение уровня содержания AT к нДНК рассматривают как признак других аутоиммунных, инфекционных и онкологических заболеваний (Hahn, 1998).
Для своевременного выявления и определения курса лечения подобных заболеваний крайне важно достоверно и оперативно определить уровень содержания антител к нДНК (Hahn, 1998). Однако сложность заключается в том, что на сегодняшний день не существует единой, общепринятой методики определения уровня AT к нДНК. Современные клинические тесты для определения антител к нДНК, используемые в лабораторной диагностике, включают в себя радиоиммунные, иммунофлуоресцентные и иммуноферментные методы анализа.
Радиоиммунный метод анализа заключается в совместной инкубации меченой радиоактивной нДНК и сыворотки крови пациента с последующей преципитацией иммунных комплексов в сульфате аммония. Данный метод считается наиболее чувствительным из существующих, но использование радиоактивных меток значительно затрудняет процесс диагностики. (Smeenk et al., 1991). Кроме того, одним из недостатков данного метода является возможность параллельного определения AT к дДНК из-за загрязнения образцов антигенов денатурированной ДНК.
Флуоресцентный иммуноанализ (метод непрямой флуоресценции) использует в качестве субстрата для связывания антител к нДНК меченый кинетопласт простейшего Crithidia luciliae (Ballou, Kushner, 1979). Это позволяет избежать побочного определения AT к дДНК, так как кинетопласт Crithidia luciliae представляет собой кольцевую молекулу нативной ДНК. Тем не менее, метод непрямой флуоресценции трудоемок и длителен, требует специальной подготовки персонала, что является лимитирующим фактором для широкого применения данного метода в лабораторной практике.
Иммуноферментный анализ (ИФА) предполагает иммобилизацию ДНК на поверхности лунок пластиковых планшетов, инкубацию в них сывороток, нанесение вторых антител, меченых тем или иным ферментом, внесение субстрата ферментативной реакции, инкубацию, внесение стоп-реагента и оценку анализа в результате изменения окраски раствора в лунках. В настоящее время ИФА используется как основной лабораторный метод определения антител к нДНК. (Stokes et al., 1982). Однако и ИФА не всегда позволяет достоверно дифференцировать норму от патологии. Это связано, в первую очередь, с многостадийным характером анализа. Каждая из основных стадий (иммобилизация антигена, инкубация сыворотки, внесение вторых антител, ферментативная цветная реакция, и, наконец, спектрофотометрическое определение продукта реакции) зависит от чистоты и качества приготовления реактивов, точности их внесения и времени нахождения в лунках планшета, аккуратности при отмывках. Каждая из стадий вносит существенный вклад в суммарную ошибку анализа, что часто приводит к ложноположительным или ложноотрицательным результатам. Ведутся многочисленные работы, направленные на усовершенствование иммуноферментного определения уровня содержания AT к нДНК. Основное внимание при усовершенствовании иммуноферментных методов уделяется иммобилизации антигена (нДНК) (Mouratou et al., 2002) и использованию стабильных ферментов, таких как щелочная фосфатаза (Chlmenti et al., 2001; Tasneem, Ali, 2001) для получения иммунных конъюгатов. Однако достаточно сложно устранить недостатки всех стадий иммуноферментного анализа и перед исследователями встает вопрос - не будет ли более перспективным избрание альтернативного способа детекции.
Атомно-силовая микроскопия как инструмент для изучения биологических объектов
Стремительное развитие методов нанотехнологии, в том числе и их применение в биологических исследованиях, в первую очередь связано с новыми возможностями измерения и варьирования характеристик отдельных структур в нанометровом масштабе (Niemeyer, 2001). Современные измерительные устройства и связанные с ними методики позволили ученым создать новые структуры, обнаружить ранее не известные эффекты и явления, найти для них практическое применение. В последние годы для изучения наноструктурных элементов биологических чувствительных пленок все чаще используются некоторые методы нанотехнологии, например, атомно-силовая микроскопия (ACM) (Jalili, Laxminarayana, 2004).
В 1986 году коллективом авторов под руководством Binnig был разработан атомно-силовой микроскоп, представляющий собой своеобразную модификацию туннельного зондового микроскопа (Binnig et al., 1986). Атомно-силовая микроскопия позволяет всесторонне исследовать структуру поверхностей, в том числе и тонких пленок, сформированных из биологических макромолекул. В процессе сканирования регистрируются вариации силового взаимодействия кончика иглы с исследуемой поверхностью. Игла расположенна на конце специальной консольной балки (кантилевера), способной изгибаться под действием небольших сил взаимодействия Ван-дер-Ваальсового типа, возникающих между острием иглы и сканируемой поверхностью. Деформация кантилевера регистрируется с помощью чувствительных датчиков, что дает возможность, после соответствующих преобразований воссоздать, топографию исследуемой поверхности с высоким разрешением (Андриевский, 2005).
С помощью атомно-силового микроскопа можно получать изображения биологических объектов - вирусов, бактерий, макромолекул (таких, как ДНК, иммуноглобулины, структурные белки и т.п.) (Miiller, Anderson, 2002; Casero et al., 2003; Frederix et al., 2003). Также ACM позволяет измерять силы трения, упругости, адгезии, изучать вязкие свойства поверхности с субнанометровым разрешением (Withers, Aston, 2006). Кроме того, в последние годы, АСМ активно применяется как инструмент для изучения адгезии клеток к поверхности внеклеточных матриц, биоматериалов и других клеток (Simon, Durrieu, 2006), для характеристики процессов адсорбции белков на поверхности металлов (Kidoaki, Matsuda, 2002) и формирования липидных пленок (Dufrene, Lee, 2000). Необходимо отметить и то, что некоторые из методик формирования наноструктурных материалов предполагают использование АСМ как манипулятора для перемещения отдельных атомов или молекул (Oyabu et al., 2003).
Разрешающая способность микроскопа зависит от радиуса острия зонда (Garsia, Perez, 2002). Деформация кантилевера фиксируется с помощью оптической системы, основанной на фокусировке лазерного луча на обратной стороне кантилевера и его отражения на фотодиод. Отклонения кантилевера обуславливают смещение лазерного луча и его перемещение по секциям фотодиода.
Обработка сигнала и построение трехмерного изображения изучаемой поверхности обеспечивается блоком электроники микроскопа и соответствующей компьютерной обработкой. Выделяют следующие основные режимы работы АСМ: контактный, полуконтактный и бесконтактный (Андриевский, 2005). При контактном режиме острие зонда касается поверхности изучаемого объекта в течение всего времени сканирования и повторяет ее форму. Такой режим обеспечивает наиболее высокое разрешение, однако возникающее при этом давление может вызвать повреждения поверхности. В связи с этим контактный режим практически не пригоден для исследования большинства биологических объектов. Одним из вибрационных методов, получившим широкое распространение при исследовании биологических объектов, является полуконтактный метод сканирования. Его особенность состоит в том, что колеблющееся острие кантилевера (зонда) находится настолько близко к поверхности, что при сканировании оно периодически контактирует с поверхностью в нижней части области размаха колебаний. При этом большую часть периода колебаний кантилевер не касается поверхности и вообще относительно слабо взаимодействует с образцом. При приближении иглы к поверхности взаимодействие резко усиливается. В зависимости от характера взаимодействия может меняться амплитуда колебаний кантилевера на его резонансной частоте, сдвиг фазы основной гармоники колебаний относительно возбуждающего сигнала. При сканировании в каждой точке система обратной связи удерживает амплитуду колебаний зонда на величине, заданной оператором (рабочая амплитуда), перемещая зонд по нормали к поверхности, тем самым, отображая ее рельеф. По сравнению с амплитудой фаза колебаний является более чувствительным параметром к изменениям взаимодействия зонда и поверхности. Получение изображения сигнала фазы одновременно с топографическим изображением поверхности дает некоторую дополнительную информацию о деталях поверхностной структуры. Данный режим получил название «метод фазового контраста». Более того, сдвиг фазы определяется не только рельефом, он обнаруживает также и сильную зависимость от таких свойств образца, как адгезия, упругость и вязкость (Миронов, 2004). Полуконтактный режим АСМ повсеместно используется для характеризации ДНК-содержащих пленок для модификации биосенсоров. (Yip, 2001; Legay et al., 2005; van den Beucken et al., 2006).
Пьезокварцевая масс-чувствительность в жидкой среде
Визуализацию поверхности электродов осуществляли на кафедре оптики и нанофотоники КГУ под руководством к.ф-м.н. доц. Коноваловой О.А. на оборудовании Федерального центра коллективного пользования (г. Казань).
Визуализацию проводили в полуконтактном режиме на воздухе при комнатной температуре на атомно-силовом микроскопе (ACM) Solver Р47Н (ЗАО «НТ-МДТ»), сканер - 50 мкм. Прибор оснащен сканирующей измерительной головкой «Смена Б». Использовали кремниевые стандартные кантилеверы (ЗАО «НТ-МДТ»), типичный радиус кривизны острия - менее 10 нм, резонансная частота колебаний зонда составляла 190+225 кГц. Сканирование проводили с разрешением 1024x1024 точек. Обработку изображений сканированных объектов производили с помощью программного обеспечения «Nova» для зондовых микроскопов (ЗАО «НТ-МДТ»).
Нативная ДНК была иммобилизована на поверхности золотого электрода, модифицированного поли-Ь-лизином. Определение оптимальных условий иммобилизации ДНК производили в следующей последовательности.
Чистоту препарата ДНК (отсутствие белка) оценивали при измерении оптической плотности (ОП) раствора. Измеряли поглощение образца при 260 и 280 нм. Оценка чистоты препарата определяется отношением ОП бо/ ОП о), которое составляет не менее 1.8 для выскоочищенных препаратов.
Для определения однородности препарата нативной ДНК использовали метод электрофореза в 1,5 % агарозном геле (Остерман, 1981). Пробы ДНК смешивали с 2 мкл красителя бромфенолового синего и вносили в лунки геля. Электрофорез осуществляли в горизонтальном направлении на пластинах размером 10 х 11 х 3 мм при напряжении 5 В/см в течение 1 ч при 20С. Гель окрашивали в течение 40 мин раствором бромистого этидия в концентрации 2 мкг/мл и фотографировали в ультрафиолете при помощи видеосистемы для регистрации гелей "DNA Analyzer" (Кузнецова, Винтер, 1997). 2.10.2. Определение буферного раствора для иммобилизации ДНК
ДНК растворяли до концентрации 50 мкг/мл в 0,05 М НС1-глициновом буфере (рН 3,0), 0,05 М Tris-HCl буфере (рН 7,2) и 0,05 М NaOH-глициновом буфере (рН 10,6), содержащих 0,15 М NaCl и 0,001 М ЭДТА, наносили на электрод 20 мкл раствора и инкубировали в течение часа. Затем электрод отмывали последовательно в указанном буфере, воде, высушивали и определяли сдвиг частоты.
ДНК растворяли в 0,05 М Tris-HCl буфере (рН 7,2), содержащем 0,15 М NaCl и 0,001 М ЭДТА до концентрации 10, 50, 100, 500 и 1000 мкг/мл, наносили на электрод 20 мкл и инкубировали в течение часа. Затем электрод отмывали последовательно в указанном буфере, воде, высушивали и определяли сдвиг частоты.
На электрод наносили 20 мкл ДНК в 0,05 М Tris-HCl буфере (рН 7,2), содержащем 0,15 М NaCl и 0,001 М ЭДТА и инкубировали в течение часа при температуре +4С, +25 С, +37С. Затем электрод отмывали последовательно в буфере, воде, высушивали и определяли сдвиг частоты.
Для изучения формирования и свойств ДНК-содержащей пленки на основе иммобилизованного поли-Ь-лизина применяли метод проточно-инжекционного наногравиметрического анализа. Иммобилизацию полипептидного слоя-предшественника осуществляли с учетом результатов, полученных ранее методом газового наногравиметрического анализа. Поли-L-лизин был иммобилизован из 0,05 М NaOH-глицинового буфера (рН 10,6), содержащего 0,15 М NaCl. 200 мкл раствора (0,1 мг/мл) наносили на рабочий электрод ПКР фирмы SRS, закрепленный в зонде, помещали во влажную камеру и инкубировали в течение часа при комнатной (+25 С) температуре. Затем жидкость удаляли, ополаскивали электрод в воде, высушивали и помещали в проточную ячейку.
В предварительных экспериментах были определены оптимальные условия для проведения проточно-инжекционного исследования, такие как скорость потока, объем пробы и зависимость от термостатирования ячейки.
После иммобилизации поли-Ь-лизина резонатор помещали в проточную ячейку. Температура жидкости составляла +37 С. Через ячейку пропускали рабочий буфер до стабилизации сигнала и фиксации базовой линии. Затем в систему вносили раствор нативной или денатурированной ДНК (50 мкг/мл). Неприсоединившиеся молекулы удаляли, пропуская рабочий буфер. В качестве контроля была определена сорбция ДНК на золотой электрод, не обработанный поли-Ь-лизином.
Также определяли зависимость связывания ДНК поли-Ь-лизином от молекулярной массы полипептида. Для этого на поверхности электрода ПКР формировали пленку из поли-Ь-лизина с молекулярной массой в 9 000, 58 000 и 190 000 Да, и затем пропускали через ячейку раствор ДНК
Кроме того, была определена зависимость связывания иммобилизованным поли-Ь-лизином нативной и денатурированной ДНК. Денатурированную ДНК получали термической денатурацией. Раствор нативной ДНК (100 мкг/мл) инкубировали в течение 30 мин в водяной бане, затем немедленно помещали в ледяную баню. Концентрацию ДНК в растворах определяли на спектрофотометре.
Устройство кварцевых микровесов QCM 200 и программы LabView позволяет получать информацию о присоединении вещества из раствора к поверхности ПКР с частотой от 0,1 до 10 с"1. Использовали режим считывания, позволяющий строить графики масс-присоединения с разрешением 1 точка (значение частоты и сопротивления) в секунду., Информация о взаимодействии поли-Ь-лизина и ДНК, таким образом, поступала в реальном времени, что позволяет оценить кинетику связывания. Для этого графики сохраняли в виде текстовых log-файлов, которые затем были преобразованы в соответствующие уравнения с помощью функции нелинейного приближения программы Prizm 4.
Формирование поли-Ь-лизинового слоя-предшественника на серебряных электродах в газовом режиме
Разработка высокоселективных методов анализа является актуальной задачей современной биологии и медицины. Повышенное внимание, уделяемое созданию новых технологий распознавания биологических макромолекул, связано с тем, что в клинической и лабораторной диагностике критически важным этапом является эффективность анализа, от чего непосредственно зависит постановка диагноза, правильность лечения, и, в конечном счете, жизнь человека. Сегодня многие из предложенных ранее методов лабораторной диагностики, основанных на применении биосенсоров, проходят клинические испытания и, по всей видимости, недалек тот день, когда они смогут частично или полностью заменить принятые ныне методы.
Ряд аутоиммунных заболеваний, таких, например, как системная красная волчанка, характеризуются патологическим повышением уровня антител к ДНК в сыворотке крови больного. Обнаружение аутоантител к ДНК является одним из подходов в диагностике аутоиммунных заболеваний (Pincus et al., 2002; Kim et al, 2003). В связи с этим необходима разработка высокоточных методов детекции аутоантител к ДНК, например, с использованием пьезокварцевых биосенсоров, позволяющих проводить иммуноанализ в одну стадию, без применения дорогостоящих и токсичных радиоактивных, флуоресцентных или ферментных меток (Marx, 2003).
В настоящей работе показано формирование ДНК-содержащей нанопленки для модификации электродов пьезокварцевых резонаторов. Установлено, что биосенсор, основанный на использовании разработанной ДНК-содержащей нанопленки, позволяет определять уровень содержания AT к нДНК в образцах крови человека и животных. Полученная в работе нанопленка может служить чувствительным компонентом не только в пьезокварцевых, но и в любых других сенсорах, рабочий участок которых выполнен из золота или серебра, например, в некоторых оптических сенсорах.
Основываясь как на данных литературы (MannelH et al., 2005), так и на собственных предварительных экспериментах, мы исходили из того, что нативная ДНК не может быть закреплена на металлической (серебряной или золотой) поверхности в процессе физической сорбции. Введение тиольной группы в молекулу высокополимерной ДНК или использование кросс-линкеров могло вызвать денатурацию полинуклеотида или привести к образованию поперечных кросс-сшивок, что отразилось бы негативно на антигенных свойствах молекулы. Соответственно, нами был намечен путь нековалентной иммобилизации ДНК. Потребовалось создать на поверхности металлического электрода слой-предшественник, позволяющий присоединить ДНК без ковалентной модификации.
Нами был выбран ряд веществ, образующих комплексы с нДНК -спермин, спермидин, фибронектин, поли-Ь-лизин, а также, перфторсульфонатный полимер нафион, формирующий тонкие наноструктурированные пленки на поверхности металлов (Zhou et al., 2003), и определена возможность их использования в качестве слоя-предшественника. При изучении характера сорбции вышеперечисленных веществ было установлено, что некоторые из них не могут быть использованы для иммобилизации ДНК. Это обусловлено тем, что, например, спермин и спермидин невозможно закрепить на поверхности металлического электрода, вероятно, по причине их небольшой молекулярной массы и неразветвленной структуры. В то же время из числа полимеров, сорбирующихся на электродах, нафион не связывал нДНК. Нафион формирует на поверхности электродов (как металлических, так и стеклоуглеродных) однородные пленки, что позволяет использовать его при конструировании биосенсоров, особенно электрохимических (Jang et al., 2004). По-видимому, отрицательный поверхностный заряд нанокластерной пленки нафиона препятствует включению нДНК в состав полимерной матрицы. Тем не менее, не исключается возможность ковалентного присоединения нДНК посредством предварительно активизированных - SO3-групп. Однако ковалентная иммобилизация, по ряду вышеуказанных причин, не могла быть применена для разработки ДНК-содержащей нанопленки в данной работе.
Фибронектин и поли-Ь-лизин, согласно нашим результатам, могут использоваться для присоединения ДНК. Однако применение поли-Ь-лизина для формирования слоя-предшественника представляется более предпочтительным, в связи с тем, что поли-Ь-лизин связывает ДНК гораздо эффективнее. Кроме того, фибронектин характеризуется способностью связывать не только нДНК, но и многие другие вещества, например, иммуноглобулины, что отрицательно скажется на селективности анализа (Rostagno et al., 1996).
Поли-Ь-лизин - полипептид, состоящий из остатков лизина, широко используется для иммобилизации нуклеиновых кислот, а также в качестве модельного полипептида в исследованиях взаимодействия ДНК и белков (Niwa et al., 2002). Например, распространено применение поли-Ь-лизинового слоя для закрепления ДНК при проведении экспериментов по визуализации ДНК при помощи атомно-силовой микроскопии, например, описано его использование для обработки слюдяной пластинки при иммобилизации ДНК (Bussiek, 2003). Кроме того, в последние годы появились сообщения о применении поли-Ь-лизина в генной инженерии в качестве посредника, облегчающего поступление чужеродной ДНК в ядро клетки (Kim et al., 2005) и в качестве структурного элемента для создания ДНК-нанопроводов (Patolsky et al., 2002). Таким образом, изучение взаимодействия ДНК и поли-Ь-лизина представляет самостоятельный интерес для исследователей.
Использование полипептидов как посредников для иммобилизации нуклеиновых кислот позволяет избежать неблагоприятного воздействия на биологические макромолекулы, неизбежно возникающего при ковалентном присоединении их к твердым поверхностям. Поэтому поли-Ь-лизин активно применяется в тех исследованиях, когда важную роль играет прочное присоединение нуклеиновых кислот к подложке. Описано использование поли-Ь-лизина для модификации стеклянных и кварцевых поверхностей (Shi et al., 2002; Lavalle et al., 2004). Кроме того, в работе (Frey, Corn, 1996) предлагается методика ковалентной иммобилизации поли-Ь-лизина на золотых поверхностях посредством их предварительной модификации алкантиоловым монослоем и обработкой гидроксисульфосукцинимидом. Данная методика не только сложна в исполнении, но и приводит к изменению структуры полипептида. В нашей работе впервые показано применение поли-Ь-лизина для иммобилизации ДНК на серебряных и золотых электродах пьезокварцевых резонаторов.
