Введение к работе
Актуальность проблемы. Полимерных системы с иммобилизованным в них биоматериалом находят все более широкое применение в битехнологии и биомедицине. Биоматериал может быть представлен различными биологически активными веществами (белками, в том числе ферментами, ДНК, пептидами, низкомолекулярными гормонами и др.), а также живыми клетками-продуцентами различных биологически акт ивных веществ (БАВ). Наиболее перспективными в ближайшем будущем, на наш взгляд, являются следующие области применения таких иммобилизованных систем в биотехнологии и биомедицине 1) создание новых высокоэффективных технологий с использованием иммобилизованных клеток-продуцентов и биокат&чизаторов на основе иммобилизованных ферментов для получения различных БАВ; 2) получение полимерных покрытий (в виде пленок или микрочастиц) с иммобилизованными в них различными лекарственными препаратами (ферментами, пептидами, аншбиотиками, антиоксидантами и др.) для терапии ран; 3) разработка препаратов с конторолируемым пролонгированным высвобождением лекарств (БАВ) из полимерной матрицы; 4) получение пероральных и назальных вакцин пролонгированного действия; 5) конструироние ДНК-содержащих носителей для получения генетически модифицированных клеток; 6) трансплантация генноинженерных животных клеток-продуцентов белков, ферментов, факторов роста, гормонов, пептидов и др. для лечения наследственных и ненаследственных болезней.
Особое внимание исследователей привлекают так называемые «умные» (smart) полимеры, которые способны изменять свои свойства в ответ на внешний сигнал (изменение различных факторов, например, рН, температуры, химический сигнал, электрическое поле и др) Особенно интересны водорастворимые полимеры, чувствительные к изменению
температуры или рН в физиологическом интервале» поскольку их свойства
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА 1 СПетец
"її і штат Ф
идеально подходят для включения в гидрогелевую матрицу различного биоматериала (клеток, белков, пептидов, ДНК и др.). Введение "умных" полимеров в состав композитных матриц позволяет получать полимерные системы с новыми или заранее заданными свойствами. Такими системами с включенным в них биоматериалом можно управлять путем изменения внешнего сигнала (рН, температуры и т.д.), тем самым создавая новые эффективные методы иммобилизации биоматериала при максимально возможном сохранении его биологической активности (например, ферментативной активности в случае иммобилизации ферментов) или жизнеспособности (в случае иммобилизации клеток). Цель и задачи исследования. Целью работы было создание новых методов с использованием композитных гидрогелей (в виде микрогранул, микрокапсул или пленок) на основе природных и биосовместимых синтетических полимеров для иммобилизации клеток, белков (в том числе ферментов) или пептидов; исследование свойств таких иммобилизованных объектов и возможностей их применения в биотехнологии и биомедицине. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
Получить новые композитные микрогранулы/микрокапсулы из природных и синтетических smart-поуіимеров с иммобилизованными в них клетками.
Всесторонне исследовать морфологические особенности иммобилизованных клеток, их рост и пролиферацию, способность продуцировать биологически активные вещества (например, моноклональные антитела в случае гидридом) в процессе длительного in vitro культивирования в зависимости от состава, физико-химических свойств и структуры микрогранул/микрокапсул.
Разработать новые биокатализаторы - протеолитические ферменты,
иммобилизованные в микрогранулы композитного гидроіеля (в том
числе микрогранулы с магнитными свойствами).
Исследовать эпзиматические свойства иммобилизованных ферментов (на примере трипсина, химотрипсина, тромбина, карбоксипепшдазы В), в частности, рН- и температурную зависимости, термостабилыюсть, устойчивость в различных водно-органических средах; определить кинетические параметры ферментативных реакций при различных температурах и в различных водно-органических средах
Изучить возможность применения полученных гранул композитного гидрогеля с иммобилизованным в них протеазами в качестве биокатализаторов.
Получить новые препараты на основе тромбина и/или пептидов (которые могут имитировать механизм действия тромбина в процессе репарации тканей), иммобилизованные в биосовместимые полимерные матрицы (пленки композитного гидрогеля и биодеградируемые микросферы).
Изучить ранозаживляющие эффекты иммобилизованных тромбина и/или пептидов и продемонстрировать эффективность этих полимерных покрытий в процессах репарации тканей в моделях in vivo (мыши. крысы).
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые для иммобилизации животных клеток предложены микрогранулы композитных іидрогелей на основе биосовместимых синтетических полимеров класса N-виниламидов и природных полисахаридов-альгинатов. Методом проточной цитометрии (совместно с лабораюрией иммунохимии ИБХ РАН) исследованы морфологические особенности иммобилизованных гибридом. Новые методы иммобилизации клеток в композитные гидрогели могут найги применение в биотехнологии для получения различных биологически активных веществ (моноклональных антител, рекомбинантных белков и пептидов и др.), а также в биомедицинских исследованиях, в частности при создании искусе і венных
органов, в генной терапии и трансплантологии Впервые получены
микрокапсулы на основе альгината и олигохитозанов для длительного т
vitro культивирования животных клеток. На основе инкапсулированных
раковых клеточных линий продемонстрирован новый метод для получения
мильтиклеточных раковых сфероидов, которые имитируют малые
солидные опухоли in vivo, и могут быть использованы в биомедицине для
исследования механизмов действия различных видов противораковой
терапии (радио-, химо- и фотодинамической терапии). Разработаны новые
биокатализаторы - протеолитические ферменты (трипсин, химогрипсин,
тромбин, карбоксипептидаза В), иммобилизованные в микрогранулы
композитного гидрогеля на основе поли-Ы-винилкапролактама (ГГВК) и
альгината кальция (CaAlg), в том числе и обладающие магнитными
свойствами, а также исследованы энзиматические свойства
иммобилизованных ферментов. Предложенные системы на основе различных иммобилизованных ферментов могут найти применение в различных химико-ферментативных реакциях, протекающих в водпо-органических средах в широком интервале температур, для получения оптически чистых продуктов для фармакологии и пищевой промышленности Созданы новые полимерные системы - композитные пленки на основе ПВК и альгината кальция (ПВК-CaAlg). а также биодергадируемые микросферы - на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (poly(D,L-lactide-co-glycolide, PLGA)- с иммобилизованными в них тромбином или пептидами, имитирующими ранозаживляющий эффект тромбина Показано, что данные покрытия являются перспективными материалами для получения новых препаратов пролонгированного действия для терапии ран.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены более, чем на 75 конференциях и симпозиумах в России и за рубежом, в частности на XX, XXII и XXIII конференциях FEBS
(Будапешт, 1990; Стокгольм 1993; Базель 1995), 40, 41 и 43 Международных конференциях Европейского общества клеточных культур ETCS (Ренн, Франция, 1993; Верона, 1994; Гранада 2001), III Международном симпозиуме ШРАС по биоорганической химии (Дагомыс, 1995), на Международном симпозиуме по иммобилизованным клеткам (Ноордвикерхоут, Голландия, 1995), ежегодных Международных конференциях немецкого общества клеточной биологии Deutsche Gesellschaft fuer Zellbiologie (Гамбург, 1996; Штутгарт 1997, Заарбрюкен, 1998; Бонн, 2002; Берлин, 2004; Гейдельберг, 2005), на ежегодных V-XT Международных конференциях по биокапсулированию (Потсдам, 1996; Барселона, 1997; Истон, США, 1998; Тронхейм, 1999; Варшава, 2000; Прага, 2002; Страсбург, 2003; Витория, Испания, 2004, Кинісюн, Канада, 2005), на IV и V симпозиумах по химии протеолитических ферментов (Москва, 1997, 2002), на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (С-Петербург, 1998), на VIII и IX Европейских конгрессах по биотехнологии (Будапешт 1997, Брюссель 1999), Международной конференции по биокатализу (Пущино-на-Оке,1998-Москва.2000), на XII Международном симпозиуме по микрокапсулированию (Лондон, 1999), на ТІ Европейском конгрессе по химической инженерии (Монпепье, 1999), Всемирном конгрессе по фибринолизу и протеолизу (Химамацу, Япония 2000), на XI Всемирном конгрессе "Биотехнология 2000" (Берлин, 2000), на 18 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирмишем, 2000), на VI-VII Международных конференциях по исследованию хитина и хитозана, (Москва-Щелково, 2001; С-Петербург-Репино, 2003); Международном симпозиуме по использованию мультиклеточных сфероидов в раковой биологии и терапии (Рим, 2002, приглашенный лектор) ), на IX Конгрессе французского общества химической инженерии (С-Назэр, Франция, 2003), на конференции экспертов COST "Применение
иммобшшзации/биокапсулирования в медицине, фармакологии и биотехнологии (Белград, 2004, приглашенный лектор), на Международной конференции ШРАС ICOB-4 & ISCNP-24 (Дели, 2004, приглашенный лектор), на VII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004), на ПТ Международном симпозиуме по биоматериалам ISAB 2005 (Монреаль, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 120 работ, в том числе 6 глав в книгах, 27 статей, получено 4 авторских свидетельства СССР.
Личный вклад автора. Автором предложены основные направления исследования и разработаны основные подходы для экспериментального подтверждения предложенных идей, ему же принадлежит решающая роль при обсуждении и литературном оформлении полученных результатов Все основные эксперименты выполнены автором, аспиратами и студентами (под руководством автора). В исследованиях, которые были выполнены в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, непосредственном проведении экспериментов как в России, так и в зарубежных лабораториях (во Франции, Бельгии, Германии), и оформлении полученных результашв в виде печатных работ. Автор благодарит всех сотрудников, студентов и аспирантов своей группы, а также всех своих российских и зарубежных коллег за плодотворное сотрудничество.
