Содержание к диссертации
Введение
1.1. Фосфатазы 11
1.2. Распределение и физиологическая роль щелочных фосфатаз 12
1.3. Генетическая регуляция биосинтеза щелочных фосфатаз 15
1.4. Физико-химические и каталитические характеристики щелочных фосфатаз и их пространстфенная организация
1.4.1. Молекулярная масса (Mr) и изоэлектрическая точка (pI) 19
1.4.2. Влияние значений рН и температуры 21
1.4.3. Влияние ингибиторов 29
1.4.4. Субстратная специфичность
1.5. Структурно-функциональные особенности щелочных фосфатаз 33
1.6. Структурно-функциональные особенности психрофильных щелочных фосфатаз морских бактерий 38
1.7. Практическое применение щелочных фосфатаз 42
2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Реагенты и материалы, использованные в работе 46
2.2. Выделение геномной ДНК 47
2.3. Гель-электрофорез ДНК 47
2.4. Амплификация структурных генов белков 48
2.5. Рестрикция 49
2.6. Лигирование фрагментов ДНК в плазмиду 50
2.7. Подготовка компетентных клеток и трансформация E.coli 51
2.8. Выделение и секвенирование рекомбинантных плазмид 52
2.9. Получение мутантных генов
2.10. Гетерологическая экспрессия рекомбинантных генов в E. coli 54
2.11. Выделение и очистка рекомбинантных белков 55
2.12. Анализ белковой фракции телец включения 56
2.13. Гель-электрофорез белков в полиакриламидном геле 56
2.14. Определение концентрации белков 57
2.15. Определение активности ЩФ 57
2.16. Определение активности лектинов 58
2.17. Определение активности силикатеиноподобного катепсина и анализ наноструктур 60
2.18. Определение каталитических параметров CmAP 60
2.19. Определение pH-стабильности, pH-оптимума и влияние некоторых буферов на активность CmAP 61
2.20. Определение температурного оптимума и температурной стабильности, влияния ионов магния на температурную стабильность CmAP 62
2.21. Влияние ионов натрия и калия на активность CmAP 62
2.22. Изучение влияния ЭДТА и ДСН на активность и стабильность CmAP 63
2.23. Субстратная специфичность щелочной фосфатазы 63
2.24. Статистика 63
2.25. Атомно-адсорбционная спектроскопия 64
2.26. 3D-Компьютерное моделирование пространственной структуры и молекулярный докинг 64
3. Результаты и обсуждения 66
3.1. Получение рекомбинантной щелочной фосфатазы CmAP 66
3.1.1. Получение плазмидных конструкций 66
3.1.2. Гетерологическая экспрессия и оптимизация экспрессии CmAP 70
3.1.3. Выделение и очистка рекомбинантной CmAP 73
3.2. Физико-химические свойства CmAP 75
3.2.1. Молекулярная масса и изоэлектрическая точка 75
3.2.2. Оптимум рН, термостабильность и зависимость активности CmAP от присутствия ионов 77
3.2.3. Влияние ингибиторов 85
3.2.4. Субстратная специфичность
3.3. Каталитические параметры CmAP 90
3.4. Моделирование пространственной структуры CmAP 92
3.5. Сайт-направленный мутагенез CmAP 104
3.6. Перспективы применения рекомбинантной CmAP
3.6.1. Применение CmAP для дефосфорилирования векторов 109
3.6.2. Получение гибридного бифункционального силикатеиноподобного катепсина CmAP/LoC 111
3.6.3. Получение гибридных бифункциональных белков на основе генов CmAP и лектинов 1 3.6.3.1. Получение гибридного бифункционального галактозосвязывающего лектина CmAP/CGL 118
3.6.3.2. Моделирование пространственной структуры гибрида CmAP/CGL 123
3.6.3.3. Получение гибридного бифункционального маннан-связывающего лектина CmAP/MBL-AJ 125
3.6.3.4. Моделирование пространственной структуры маннан-связывающего лектина и его гибридного аналога CmAP/MBL-AJ 130 3.6.3.5. Молекулярный докинг in silico и мутагенез лектина в гибридном
бифункциональном белке CmAP/MBL-AJ 136
Выводы
Список литературы 145
- Молекулярная масса (Mr) и изоэлектрическая точка (pI)
- Определение pH-стабильности, pH-оптимума и влияние некоторых буферов на активность CmAP
- Гетерологическая экспрессия и оптимизация экспрессии CmAP
- Получение гибридного бифункционального силикатеиноподобного катепсина CmAP/LoC
Молекулярная масса (Mr) и изоэлектрическая точка (pI)
Помимо внешнего дефицита фосфатов на уровень формирования транскриптов оперона pst влияют и другие факторы, такие как внутренняя концентрация фосфора в клетке и значение рН среды – чем выше рН, тем больше уровень мRNA (Fischer et al., 2006). Сверхэкспрессия ЩФ в клетках E. coli, например, наблюдали наряду с одновременным увеличением транскрипции гена индуцибельной сериновой протеиназы, вовлеченной в процесс деструкции аберрантных белков в периплазматическом пространстве, когда их концентрация выходила за пределы допустимой (Kadokura et al., 2001). Доказательства одномоментности работы генов
ЩФ и протеиназы были получены при попытке индукции сверхэкспрессии ЩФ в мутантном штамме, дефицитном по гену сериновой протеиназы. В результате в мутантном штамме наблюдалось скопление молекул предшественников ЩФ, а активной формы фермента было в несколько раз меньше, чем в тех же условиях в диком штамме. Полученные данные показывают, что ЩФ вовлечена в процесс, сопряженный с процессом протеолиза в момент увеличения экспорта белков через мембрану в стрессовых ситуациях (Darmon et al., 2006). Вероятно, по той же причине в некоторых бактериях структурный ген, кодирующий ЩФ, ассоциирован с геном, кодирующим белок, индуцируемый при повреждении ДНК (DNA-damage-inducible protein) (Рис. 2).
Близкое расположение гена ацилредуктазы с геном PhoА авторы объясняют тем, что ЩФ микобактерий является мембраносвязанным белком и дополнительно ацилируется по С-концу для крепления на внешней мембране клеток (Kriakov et al., 2003). В некоторых бактериях эволюционная адаптация пошла дальше в усовершенствовании механизмов регуляции биосинтеза эссенциальных белков - на уровне активации и транслокации. Обычно ЩФ экспрессируются в виде предшественника, имея классическую сигнальную последовательность для транслокации в периплазму, где претерпевают пострансляционную модификацию, после чего молекулы мономеров формируют активный гомодимер за счет образования двух дисульфидных мостиков (Karamyshev et al., 1998). Такой путь экспорта ЩФ через мембрану называется Sec-механизмом. Но существует укороченный путь биосинтеза ЩФ – Tat–механизм (twin-argenine translocation). В том случае, когда требуется экстренный экспорт белка или, в случае экстремофилов, у которых условия среды обитания усложняет экспорт белков, запускается синтез белка без лидерного пептида, после чего белок сразу же сворачивается в нужную пространственную структуру, правда, часто без кофактора. Такая практически функциональная форма белка направляется к специальному трансмембранному каналу. Гены белков (поринов), ответственных за транспорт белков, осуществляющих укладку пространственной структуры ("фолдинг") в цитозоле клетки, находятся в отдельном опероне tatABCD. Однако такая транспортная система встречается не во всех геномах (Angelina et al., 2001), так, в клетках E.coli был выделен и охарактеризован TatABCD-комплекс (Sargent et al., 2001).
Наряду с индуцибельными существуют и конститутивные ЩФ, уровень экспрессии и активность которых не зависит от концентрации фосфатов. Некоторые микроорганизмы имеют в своем арсенале оба типа ферментов, при этом, когда избытком фосфатов репрессируется индуцибельная ЩФ, продолжает экспрессироваться конститутивная ЩФ (Bhatti et al., 2000; Wagner et al., 1995). Такая картина в целом характерна для обитателей морской среды (Hoppe, 2003; Mudrik, 2004; Sebastin et al., 2004). В других микроорганизмах известны только конститутивные ЩФ (Nikata et al., 1996). Анализ аминокислотных последовательностей таких ЩФ показал, что они имеют необычную структуру и эволюционно далеко отстоят от остальных своих сородичей, поэтому их можно выделить в отдельное семейство. Структурные особенности таких ЩФ, вероятно, кроются в наличии каких-либо дополнительных функций помимо транспорта фосфора. Так, например, ЩФ Chryseobacterium meningosepticum очень хорошо расщепляет как АМФ, так и АТФ, а по гомологии первичной структуры этот фермент занимает промежуточное положение между Ca2+-зависимой АТФазой и другими ЩФ (26). В морской бактерии Arthrobacter sp. были обнаружены две термолабильные ЩФ, одна из которых тоже дефосфорилировала АТФ со скоростью, равной скорости расщепления АМФ и ГТФ, тогда как другая ЩФ предпочтительно гидролизовала АМФ, глицерол-фосфат и глюкозо-6-фосфат, что более типично для ЩФ (De Prada, Brenchley, 1997). Анаэробная бактерия Prevotella intermedia, вызывающая заболевания пародонта, обладает специфической активностью по отношению к тирозин-фосфат-содержащим соединениям (De Prada, Brenchley, 1997) и имеет ближайшие структурные аналоги – фосфат-независимые ЩФ из Synechococcus sp. и Zymomonas mobilis (Wagner et al., 1995; Gomez, Ingram, 1995).
Молекулярные массы активных форм известных микробиальных ЩФ находятся в пределах от 40 до 400000 Да и выше, если фермент образует мультимерные формы. Большинство значений молекулярных масс было рассчитано из аминокислотной последовательности предшественников белков из базы GenBank, которые могут включать 2-2,5 кДа сигнального пептида, что соответствует 20-30 а.о., в зависимости от источника ЩФ (Табл. 1). Кроме того, ЩФ эукариот в разной степени гликозилированы, что тоже отражается на молекулярной массе при ее определении другими способами (гель-фильтрация, ПААГ- электрофорез) (Табл. 1).
Как известно, для проявления ферментативной активности фермент приобретает четвертичную структуру в виде димера, в некоторых случаях образует тетрамер (Wojciechowski et al., 2002) или активные мультимерные агрегаты (Rina et al., 2000; Poltorak et al., Moura, 2001). В последнее время показано существование мономеров ЩФ. Однако некоторые авторы подвергают сомнению факт существования таких форм в природе, по крайней мере, в некоторых случаях (59). Так, у Pyrococcus abyssi, несмотря на то, что в определенных условиях удалось выделить стабильный мономер, у него практически отсутствовала ферментативная активность (60). Установлено, что димеризация субъединиц происходит спонтанно при добавлении ионов двухвалентных металлов (Ме2+), у большинства ЩФ это ионы Mg2+, хотя в редких случаях это может быть Co2+ или Сa2+, что определяется а.о., определяющими поверхность глобулы мономера (Wojciechowski et al., 2002; Moura et al., 2001) (Табл. 1). При проведении эксперимента по мутагенезу определенных а.о. в молекуле ЩФ E. coli был получен мономер, который не смог образовывать димер и проявлял некоторую активность, но его термостабильность была снижена на 50 % по сравнению с термостабильностью ЩФ из дикого штамма (Boulanger, Kantrowitz, 2003). Эти данные показывают, что более высокоорганизованная четвертичная структура прежде всего обеспечивает стабильность фермента, особенно, если его источник экстремотермофил (Wojciechowski, 2002; Yurchenko, 2003; Zappa et al., 2001). Эксперимент по мутагенезу эссенциальных а.о. для образования димеров в индуцибельной ЩФ B. subtilis показал, что димеризация необходима не только для фосфорилирования фермента во время катализа, но также для контролирования регуляции ответа в общей цепи сигнальной трансдукции, который либо активирует, либо подавляет активность промотора ЩФ (Chen et al., 2003).
Определение pH-стабильности, pH-оптимума и влияние некоторых буферов на активность CmAP
Для процедур выделения и манипуляции с ДНК использовали следующие материалы и реактивы: гуанидинизотиоцианат, ацетат натрия, изопропанол, этанол, трисгидроксиметиламинометан (трис), этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА, натриевая соль), додецилсульфат натрия (ДСН), гидроксид натрия (Panreac), бромистый этидий (Amresco), агароза (Bio-Rad, США), дезоксинуклеозидтрифосфаты и набор стандартов для определения молекулярных масс (СибЭнзим, Россия), эндонуклеазы рестрикции NcoI, SacI, SalI, HindIII, Т4-ДНК-лигаза (Thermo scientific, Литва), смесь полимераз для амплификации длинных ПЦР-фрагментов «Long PCR mix”; Taq-, Encyclo- и Tersus-ДНК-полимеразы (Евроген, Россия), агароза (Amresco), реактивы для капиллярного секвенатора ДНК (Applied Biosystems, США), генетический векторы pET-40b(+), pET-22b(+) (Novagen, США).
Для выращивания использованных в работе штаммов E. coli (DH5, Rosetta (DE3), Rosetta gami, BL21), любезно предоставленных сотрудниками фирмы «Евроген» (Москва, Институт биоорганической химии им. Шемякина), использовали триптон, дрожжевой экстракт, агар и хлорид натрия (Amresco).
Для очистки и проведения прочих работ с рекомбинантными белками были использованы следующие реактивы и материалы: ДЭАЭ-52-целлюлоза (Whatman, Англия), Ni-NTA агароза (Qiagen), ДЭАЭoyopearl (Toyo Soda, Япония), сефакрил S-100HR, сефакрил S-200HR, супердекс 200PG (Sigma, Германия), MonoQ (General Electric), хлорид натрия, хлорид калия, ЭДТА, трис, ацетат натрия, гидрокарбонат натрия, , субстрат p-нитрофенилфосфат (п-НФФ) (Serva), диэтаноламин (ДЭА) (Sigma),Тритон X-100, -меркаптоэтанол (ICN Biochemicals, США), ДСН(Sigma), акриламид, бисакриламид, персульфат аммония (ПСА) (ICN Biomedicals), тетраэтилметилендиамин (ТЕМЕД) (Lancaster). Все реактивы отечественного производства имели квалификацию “осч”, реактивы зарубежного производства – «biotechnology grade» и «ultra pure grade».
Для выделения ДНК, содержащей ген высокоактивной ЩФ, использовали клетки бактерий штамма Cobetia marina KММ 296 (Коллекция морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН), выделенного из мидии Crenomytilus grayanus, собранной на глубине 7м в бухте Троица Японского моря.
0,5 мг бактериальных клеток растворяли в 5 мл 4М гуанидинизотиоцианата, добавляли равный объем смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1, перемешивали и центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин при комнатной температуре. Водную фазу отбирали, добавляли 1/10 объема 3М ацетата натрия (pH 5.2) и равный объем изопропанола, и выдерживали 30 мин при температуре -20ОС. Осадок ДНК собирали центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин, несколько раз промывали 70% этанолом, затем один раз 96% этанолом, высушивали при комнатной температуре, либо в термостате при 37оС, и растворяли в 500-1000 мкл бидистиллированной воды.
Результаты каждого этапа работы проверяли методом электрофореза в горизонтальном 1% агарозном геле в 100 мМ Трис-ацетатном буфере (pH 8,0), содержащем 1 мM ЭДТА и 1 мкг/мл бромистого этидия при напряженности 5В/см и комнатной температуре. Для нанесения на гель раствор ДНК смешивали с 50% глицерином в соотношении 1:5, содержащем 0,1% Понсо S (Sigma). По окончании электрофореза окрашенную бромистым этидием ДНК наблюдали в геле с использованием системы анализа изображения Herolab (Германия) при D = 312 нм. 2.4. Амплификация структурных генов белков
Для построения конструкции, определяющей синтез высокоактивной рекомбинантной фосфатазы C. marina (CmAP), амплифицировали кодирующий участок ее гена с использованием геномной ДНК C. marina и двух геноспецифичных праймеров: 5 TTAACCATGGCAGAGATCAAGAATGTCATTCTGAT-3 и 5 TTAAGAATTCCTTCGCTACCACTGTCTTCAGATACTGTCC-3 . Для построения химерных конструкции амплифицировали кодирующий участок гена ЩФ с использованием геномной ДНК C. marina КММ 296, геноспецифичного прямого праймера на начало гена ЩФ, содержащего на концах довески сайтов рестрикции SacI и SalI: 5 TATTCCATGGCAGAGATCAAGAATGTCATTCTGAT-3 ; и двух обратных геноспецифичных праймеров на С-конец ЩФ, содержащих последовательность линкерного участка для слияния с другими белками: 5 – TTAAGAGCTCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCAC CACCCTTCGCTACCACTGTCTTCAGATACTGTCCT–3 (обратный праймер c линкером (G)4S(G)4S(G)4S) (L1)); 5 – TTAAGAGCTCAGGTGCACCACCGCTAGATCCTGGAGGAGTAGAAGGCTTAG GGAACTCCTTCGCTACCACTGTCTTCAGATACTGTCCT-3 (обратный праймер с линкером EFPKPSTPPGSSGGAP (L2)). Амплификацию гена маннан-связывающего лектина С-типа дальневосточного трепанга Apostiсhopus japonicus (MBL-AJ) проводили с использованием рекомбинантной плазмиды pQE/MBL-AJ и геноспецифичных праймеров: X-Lect-pET40revEV: 5 ACTGGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTGAAAATAAA GATTCTCCAAATGATACTCGATACAGGGAAG-3 , pET40-rev: 5 CAGTGTCGACCTCCAAATGATACTCGATACAGGGAAG-3 .
Гетерологическая экспрессия и оптимизация экспрессии CmAP
У мутантного фермента активность полностью отсутствовала (Рис. 35 А, Д) Мутация Glu268Gly приводила к потере ионной связи с Mg2+ и водородных связей с двумя молекулами воды в активном центре, которые должны присутствовать в контактах с Glu268 в активном белке. Такая мутация также приводила к исчезновению активности у CmAP (рис. 35 А, Е). Мутация Asp315Gly приводила к полной потере активности фермента за счет потери ионной связи остатка Asp315 с каталитическим ионом Zn2, а также водородных связей с а.о. Gly13 (рис. 35 А, Ж). Мутация Trp274Gly приводила к потере всего лишь одной водородной связи с молекулой воды в активном центре, которая присутствует в контакте с Trp274 в нативной форме CmAP. Однако эксперимент показал, что этого было достаточно, чтобы фермент стал абсолютно неактивным (рис. 35 А, З). Мутация His316Gly приводила к потере водородной связи с остатком Asp12 (His316.NE2-Asp12.OD1), который, в свою очередь, сам имеет большое количество значимых для катализа контактов (рис. 35 А, И). И, наконец, мутация Asp273Gly приводила к потере активности фермента за счет разрыва связей остатка с ионами Zn1 и Zn2, а также водородной связи с Thr318.OG1, которая присутствует в контактах CmAP природного типа (рис. 35 А, К).
Таким образом, практически все мутантные формы CmAP, в которых был нарушен прямой контакт мутированных остатков или их косвенный контакт через атомы других а.о. или воды с ионом Mg2+, оказались неактивными, что подтверждает наличие эндогенного иона Mg2+ в структуре CmAP. Мутанты Asp64Gly и Asp443Gly, где нарушение контактов происходит на периферии молекулы, проявляли, соответственно, в семь и полтора раза меньшую активности по сравнению с природным типом CmAP.
Перспективы применения рекомбинантной CmAP В настоящее время одним из бурно развивающихся направлений молекулярной генетики является белковая инженерия, включающая в себя разработку методов модификации белков для изучения их структурно-функциональных взаимосвязей, а также конструирование новых белков с заданными свойствами. Впечатляющими результатами применения такого подхода являются гибридные белки.
Гибридный белок (англ. fusion protein, также химерный, составной белок) — белок, полученный объединением функциональных доменов разных белков с использованием генно-инженерных методов. Химерные белки могут включать в себя белковые последовательности любых организмов. Создавая, экспрессируя и оптимизируя генные конструкции, несущие гены, кодирующие последовательности таких белков, которые обладают уникальными свойствами, получают принципиально новые белки с заданными свойствами, представляющие интерес для целей биотехнологии и медицины. Такие белки можно использовать при лечении, профилактике или диагностике различных заболеваний (Арсланбаева, 2011; Lin et al, 2011; Porteus, Baltimor, 2003).
Целью генно-инженерного слияния белков может быть также повышение эффективности мониторинга экспрессии и очистки рекомбинантных целевых белков. В качестве такого индикатора может выступать ферментативная активность одного из доменов гибридного белка или флуоресцирующие белки (de Melo et al., 2007). Мы исследовали перспективы использования CmAP в химерогенезе для получения таких гибридных белков.
Для повышения эффективности лигирования при получении химерных конструкций рестрицированные плазмиды обрабатывали очищенной CmAP для 110 дефосфолирирования её концов с целью предотвращения самолигирования вектора. Скрининг рекомбинантных колоний методом ПЦР показал высокую эффективность получения экспрессионных плазмид, несущих химерную конструкцию, для дальнейшего их использования при получении рекомбинантных белков (Рис. 36). Эффективность получения генетических конструкций с помощью CmAP была намного выше по сравнению с таковой при использовании классической щелочной фосфатазы из E. coli (Fast AP, Fermentas) (рис. 36).
. Электрофореграмма ПЦР-фрагментов трансгенных колоний E. coli, полученных после клонирования лигированного гена лектина (MBL-AJ) в вектор, обработанных ферментом CmAP (А); ПЦР-фрагменты трансгенных колоний E. coli, полученных после клонирования лигированного гена лектина (MBL-AJ) в вектор, обработанных ферментом EСAP (Б). Заполненными стрелками указан уровень электрофоретической подвижности, соответствующий ПЦР-фрагментам, имеющим вставку целевого гена; пустыми стрелками указан уровень, соответствующий ПЦР-фрагментам, не имеющим вставки целевого гена. ПЦР-колоний E. coli проводили с использованием пары коммерческих праймеров для системы pET (Novagen).
Получение гибридного бифункционального силикатеиноподобного катепсина CmAP/LoC Силикатеины, гомологи катепсина L, – белки спикул губок, обладающие способностью в обычных условиях окружающей среды гидролизовать эфиры кремниевой кислоты с образованием аморфного кремнезема и конденсировать молекулы предшественника, тетраэтоксиэтилана, с образованием кремниевых наноструктур определенной формы (Cha et al., 1999). Широкие возможности применения силикатеинов в биотехнологии для получения новых нанокомпозитных материалов на основе кремния делают перспективным исследование свойств новых силикатеинов из разных видов губок и получение их рекомбинантных аналогов методами генной и белковой инженерии (Mller et al., 2009; Schrder et al., 2009; Wang et al., 2012).
Ранее в лаборатории морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН был получен рекомбинантный аналог силикатеиноподобного катепсина морской губки L. oparinae (Ковальчук и др., 2013). Метод определения количества осажденного им кремнезёма из специфического субстрата (THEOS) часто приводит к недостоверным результатам, так как примесные белки способны к неспецифическому агрегированию друг с другом и к неспецифическому осаждению их компонентом самого субстрата (THEOS), что сильно затрудняет определение специфической активности содержащих рекомбинантный силикатеин фракций при хроматографической очистке. Другая проблема метода заключается в том, что при низкой концентрации рекомбинантный силикатеин не способен к осаждению кремнезема, что затрудняет его детекцию. Кроме того, при концентрациях свыше 2 мг/мл рекомбинантный силикатеин полностью выпадал в осадок вместе с примесными белками в течение двух суток.
Получение гибридного бифункционального силикатеиноподобного катепсина CmAP/LoC
Анализ 3-D структуры гибридного белка CmAP/MBL-AJ выявил возможные механизмы олигомеризации. Известно, что в природе маннан-связывающий лектин С-типа является гомодимером и гомотетрамером. Согласно экспериментальным данным, после выделения рекомбинантного химерного белка CmAP/MBL-AJ с помощью гель-фильтрации на калиброванной колонке с супердексом 200PG (1,5 х 170 см) белок имел димерную форму. Каждый мономер лектина, входящего в состав химеры CmAP/MBL-AJ, так же как и природный аналог, стабилизирован двумя внутримолекулярными S-S связями и образует еще два дисульфидных мостика за счет близко расположенных к N-концу остатков цистеина (Рис. 51). При этом N-концы каждого из мономеров лектина расходятся в противоположные стороны под некоторым углом, что позволяет двум молекулам фосфатазы CmAP в составе химеры CmAP/MBL-AJ располагаться в пространстве независимо друг от друга (Рис. 54). Кроме того, выяснилось, что гибридный белок при некоторых условиях (например, при значениях pH 9), как и природный, склонен образовывать тетрамер. Однако механизм тетрамеризации химерного белка CmAP/MBL-AJ, скорее всего, отличается от механизма тертамеризации природного, так как N-концевые остатки цистеина, которые в природном аналоге образуют в тетрамере еще две S-S связи между двумя димерами (Рис. 52), в химерном белке заняты связью с линкером (G4S)3, к которому прикреплен фосфатазный домен (Рис. 54).
Молекулярный докинг in silico и мутагенез лектина в гибридном бифункциональном белке CmAP/MBL-AJ Для выяснения молекулярных особенностей углеводной специфичности лектина был проведен молекулярный докинг лектина с моносахаридом и модельным манноолигосахаридом (рис. 55). Обнаружено, что связывание моносахарида маннозы происходит вне углевод-распознающего домена лектина. Разветвленный пентоманносахарид связывается с углевод-распознающим доменом, и во взаимодействии участвуют остатки маннозы, расположенные в разветвлении олигосахарида, а не в терминальном положении. Активность лектина зависит от температуры (Bulgakov et al, 2007), и поэтому методом молекулярной динамики была изучена начальная термоденатурация функционально активной димерной формы лектина. Методами симуляции молекулярной динамики показано, что начальная термоденатурация проявляется в нарушении межмономерных дисульфидных связей в функционально активном димере, изменении вторичной структуры лектина и конформационных перестройках углевод-распознающего домена.
Модель докинга in silico олигосахарида -D-Manp-(16)-[ -D-Manp-(12)--D-Manp-(12)]--D-Manp(16)-D-Manp внутри углевод-распознающего домена лектина MBL-AJ. Поверхность сайтов связывания гидрофобных областей MSL-AJ выделена зелёным цветом, умеренно полярные участки - синим, участки с водородными связями - фиолетовым, ион Са2+ -бирюзовым.
На основе структурных данных и результатов докинга лектина дикого типа (рис. 55) для изучения его аффинности к олигоманнану и муцину в гибридный лектин CmAP/MBL-AJ методом ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза были введены точечные аминокислотные замены W100A Q103H, A156N, F159K и A156N/F159K. Рассчитанные энергии связывания и аффинности каждого мутанта представлены в таблице 8 и на рисунках 56, 57.
В результате тестирования полученных экспериментально мутантных форм лектина CmAP/MBL-AJ методом ИФА было установлено, что при мутации W100A наблюдается ухудшение связывания лектина с лигандом на 14±3 % , что соответствует расчетным данным мутагенеза in silico (рис. 56, 57 и табл. 8). Мутации Q103H и A156N приводили к ухудшению связывания, соответственно, на 12±2% и 8±2%. Замена F159K улучшала связывание с лигандом на 10±3%. Однако наибольшей лектин-связывающей активностью обладал двойной мутант A156N/F159K, который показывал на 25±5 % большую аффинность к субстрату, чем гибрид CmAP/MBL-AJ с диким типом лектина (Рис. 58).
Результаты ИФА мутантных форм лектина в составе CmAP/MBL-AJ. В качестве лиганда использовали муцин желудка свиньи в одинаковой концентрации, химерные белки были двукратно разведены. По оси абсцисс обозначена концентрация лиганда (нг/мл), по оси ординат – относительная активность CmAP/MBL-AJ, измеренная по активности CmAP (ОП при =400 нм)
Несмотря на тот факт, что мутация A156N ухудшала силу связывания MBL-AJ с лигандами, а F159K её усиливала, двойная мутация A156N/F159K дала неожиданный кумулятивный эффект, в результате которого было достигнуто значительно большее улучшение силы связывания лектина, по сравнению с единичной заменой F159K и, соответственно, в сравнении с лектином дикого типа (Рис. 58).
Таким образом, была получена улучшенная генетическая конструкция в виде рекомбинантной плазмидной ДНК pET40CmAP/MBL-AJ, кодирующей гибридный бифункциональный полипептид CmAP/MBL-AJ со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии и мутантного маннан связывающего лектина С-типа дальневосточного трепанга (с аминокислотными заменами A156N/F159K). Оптимизированная схема экспрессии и выделения рекомбинантного гибрида CmAP/MBL-AJ позволила добиться стабильного выхода гомогенного белка до 1 мг на 1 литр бактериальной культуры с удельной активностью щелочной фосфатазы CmAP до 5000 ед/мг и улучшенными на 25 % иммуногенными свойствами маннан-связывающего лектина С-типа, характерными для природного аналога MBL-AJ. На рисунке 59 представлена схема лектин-иммуноферментного метода диагностики рака для нативного MBL-AJ. Полученный нами гибрид лектина, меченный CmAP, позволил существенно ускорить время проведения ИФА, сократив его на 2 шага (рис. 60), суть которого заключалась в конъюгации нативного MBL-AJ с меченными пероксидазой хрена специфическими антителами к MBL-AJ, которые также приходилось предварительно получать (Bulgakov et al., 2007).
