Содержание к диссертации
Введение 7
Глава. 1 Обзор литературы
1.1 Распространение и функции липазы в живых организмах 13
1.1.1 Катализируемая реакция 13
1.1.2 Распространение, источники липаз 14
1.1.2.1 Активность липазы в пшеничном зародыше. Химический состав и биологическая ценность зародыша семян пшеницы 16
1.1.3 Изоформы и внутриклеточная локализация липазы 20
1.2 Очистка и физико-химические свойства липаз 21
1.2.1 Очистка липаз из различных источников 21
1.2.2 Молекулярная масса, субъеденичное строение . 24
1.2.3 Идентификация функциональных групп активного центра фермента 24
1.2.4 Механизм каталитического действия на липиды 27
1.3 Кинетическое поведение и регуляция активности липазы 30
1.3.1 Влияние рН и температуры на активность фермента 30
1.3.2 Активаторы и ингибиторы липолитической активности 33
1.3.3 Субстратная специфичность липазы 37
1.3.4 Зависимость активности липазы от концентрации субстрата 38
1.4 Липаза и её роль при хранении сельхозсырья и пищевых продуктов 40
1.5 Факторы, влияющие на качество пшеничных зародышей 42
1.5.1 Влияние условий переработки и хранения 42
1.5.2 Влияние ферментативных процессов. Роль липазы и липоксигеназы 44
1.5.3 Способы повышения стабильности зародышей пшеницы при хранении. Основные направления применения в промышленности 47
Заключение 52с.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1 Объект исследования 53
2.2 Методы определения активности ферментов 54
2.2.1 Определение активности липазы 54
2.2.1.1 Подбор субстратов и их характеристика 55
2.2.2 Определение активности липоксигеназы 57
2.3 Методы оценки качества пшеничного зародыша 57
2.3.1 Определение кислотности и активной кислотности 57
2.3.2 Определение перекисного числа 58
2.3.3 Определение количества белка и жира 58
2.3.4 Определение суммы естественных токоферолов 59
2.3.5 Определение жирно-кислотного состава жиров и масел 60
2.3.6 Определение аминокислотного состава 61
2.3.7 Фракционирование нейтральных липидов 62
2.3.8 Оценка интенсивности процессов свободнорадикального окис- 52 ления методом биохемилюминесценции
2.3.9 Анализ качества сырья и готовых изделий 63
2.4 Выделение и очистка липазы из зародышей семян пшеницы 64
2-4-1 Предварительная обработка зародышей семян пшеницы "4
2.4.2 Экстракция 65
2.4.3 Методы осаждения ферментов 65
2.4.4 Ионообменная хроматография 66
2.4.5 Гель-хроматография 67
2.4.6 Определение содержания белка в ферментных препаратах 67
2.5 Электрофоретические исследования 68
2.6 Определение молекулярной массы 68
2.7 Определение изоэлектрической точки 69
2-8 Дифференциально-термический и термогравиметрический анализ ""
2.9 Математическое планирование эксперимента и статистическая обработка результатов 70
Глава 3. Препаративное получение и некоторые физико-химические характеристики липазы зародышей семян пшеницы
3.1 Разработка метода получения высокоочищенного препарата липазы 72
3.2 Определение изоэлектрической точки 80
3.3 Определение молекулярной массы 80
Кинетические параметры каталитического действия липазы зародышей пшеницы 80
3.4.1 Исследование влияния рН и температуры на активность липазы... 80
3.4.2 Исследование влияния рН и температуры на стабильность липазы... 84
3.4.3 Влияние концентрации фермента и субстрата на скорость
реакции гидролиза, катализируемой липазой 94
3.4.4 Исследование влияния продуктов гидролиза на активность фермента
3.4.5 Влияние ионов металлов на активность липазы 105
3.4.6 Влияние солей желчных кислот на активность липазы 108
3.4.7 Субстратная специфичность действия фермента НО
Глава 4. Структура активного центра липазы зародышей семян пшеницы
4.1 Идентификация аминокислотных остатков активного центра фермента... 116
4.1.1 Определение значений рК и теплот ионизации функциональных групп липазы 117
4.1.2 Фотоокисление липазы в присутствии метиленовой сини 121
4.1.3 Модификация аминокислотных остатков активного центра с помощью специфических реагентов 123
4.2 Возможная роль функциональных групп активного центра липазы 132
5 с. Глава 5. Разработка способов стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении
5.1 Применение аскорбиновой кислоты как стабилизатора качества
зародышей семян пшеницы 139
5.1.1 Обоснование способа стабилизации и выбор пределов измене-
139
ния входных параметров процесса
5.1.2 Оптимизация процесса стабилизации пшеничных зародышей... 148
5.1.3 Анализ эффективности способа стабилизации в лабораторных и производственных испытаниях 152
5.2 Осциллирующий режим сушки - способ стабилизации качества зародышей пшеницы при хранении 159
5.2.1 Исследование состояния влаги в зародышах пшеницы 159
5.2.2 Подбор режимов тепловой обработки зародышей семян пшеницы 164
5.2.3 Изменение показателей качества стабилизированных зародышей пшеницы при хранении 168
5.3 Использование стабилизированных зародышей пшеницы при производстве мучных кондитерских изделий 170
Заключение 173
Общие выводы 177
Список литературы 179
Приложение 203
Введение к работе
Актуальность работы. Исследование функционирования ферментов представляет как самостоятельный научный интерес в связи с их значением для организации и регуляции клеточного метаболизма, так и служит ключом к прояснению путей оптимизации биотехнологических процессов, поскольку ферментативные реакции часто играют ключевую роль в определении их эффективности, оказывая как положительное, так и отрицательное воздействие. Особый интерес представляют ферменты растений, нашедшие применение в различных отраслях промышленности. В этой связи исследование структуры, специфичности действия, а также физико-химических свойств и регуляции активности ферментов имеет как теоретическое, так и практическое значение.
Среди гидролитических ферментов, участвующих в метаболизме липи-дов, важное место занимает липаза (триацилглицерол эфиргидролаза, К.Ф. 3.1.1.3), которая расщепляет сложноэфирные связи глицерина и жирных кислот в молекулах триацилглицеролов (ТАГ). Исследованию и использованию липаз посвящены многочисленные работы отечественных и зарубежных авторов (Arpigny J.L. et al., 1999; Pandey A. et al., 1999; Неклюдов А.Д. и др.. 2002). Имеются некоторые данные о негативном действии липаз в процессах хранения и переработки семян масличных растений: подсолнечника, рапса, хлопчатника (Корчагина Л.Н. и др., 1979; Ананьева О.Н. и др., 1978; Beisson F. et al., 2000). Однако исследования в этом плане немногочисленны, что связано с методическими трудностями, возникающими при выделении и изучении растительных ферментов по сравнению с ферментами из других источников. Среди особенностей тканей растений, обуславливающих экспериментальные затруднения, следует отметить: освобождение и выход из клеточных компартментов при гомогенизации материала вакуолярного сока с низким значением рН, а также таннинов, полифенолоксидаз, протеаз, снижающих активность ферментов (Гильманов М.К., 1981).
В настоящее время, как источник новых натуральных компонентов, применяемых в отечественной и зарубежной пищевой, медицинской и комбикормовой промышленности, особое внимание привлекает пшеничный зародыш - побочный продукт мукомольного производства, являющийся биологически ценным продуктом, содержащим витамины, белки с незаменимыми аминокислотами, липиды. Однако широкое использование пшеничного зародыша ограничено ввиду нестойкости его при хранении.
Одной из причин порчи зародышей пшеницы является сопряженное действие гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов: липаза гидролизует триглицериды ненасыщенных жирных кислот, а липоксигеназа, при непосредственном участии кислорода воздуха, осуществляет их окисление. Образующиеся при этом перекиси, гидроперекиси и другие более глубокие продукты распада резко снижают качество зародышей пшеницы. Образующиеся при этом пероксиды, гидропероксиды и другие продукты распада резко снижают качество зародышей пшеницы. Если изучению действия липоксигеназы уделялось значительное внимание (Зяблова Т.В., 2000; Prakash R.B. et al., 1993) , то исследованию липазы зародышей пшеницы посвящены лишь некоторые работы (Stauffer СЕ. et al., 1966; Sauhders СМ. et al., 1998).
В этой связи вызывает значительный интерес выделение и исследование каталитических и регуляторных свойств липазы. Это имеет существенное значение для понимания путей сопряжения и регуляции липидного обмена в клетке, а также решения задач по лимитированию активности липазы и разработке рациональных методов стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении.
Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось получение липазы зародышей семян пшеницы в гомогенном состоянии, исследование её физико-химических характеристик, регуляции активности, а также разработка и обоснование рациональных режимов хранения и использования пшеничных зародышей в пищевой промышленности с учётом каталитических свойств фермента.
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:
• разработка эффективного метода выделения и очистки липазы зародышей пшеницы;
• характеристика кинетических параметров каталитического действия и некоторых физико-химических свойств липазы зародышей пшеницы;
• изучение влияния рН среды и температуры на активность и стабильность липазы. Определение основных термодинамических параметров;
• исследование регуляции активности липазы под действием ингибиторов и активаторов;
• исследование субстратной специфичности фермента по отношению к синтетическим и природным субстратам;
• идентификация функциональных групп активного центра фермента, исследование механизма действия липазы зародышей пшеницы;
• разработка рациональных методов стабилизации зародышей пшеницы при хранении, с учётом каталитических свойств липазы, апробация их в лабораторных и производственных условиях; изыскание путей и способов использования зародышей пшеницы в пищевой промышленности.
Научная новизна. Разработана схема очистки и получен гомогенный ферментный препарат липазы зародышей пшеницы. Изучено влияние различных факторов на активность фермента: действие ингибиторов и активаторов, рН и температуры. Исследованы кинетическое поведение и регуляция активности фермента липазы зародышей пшеницы, в том числе, субстратная специфичность по отношению к природным и синтетическим субстратам. Впервые получена информация о кинетике процесса термолиза зародышей пшеницы, определены формы связи влаги в них. С учётом каталитических свойств фермента разработаны способы стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении, основанные на применении обладающей антиокислительной способностью аскорбиновой кислоты,
а также тепловой обработки с использованием осциллирующих режимов. Доказана эффективность предложенных способов стабилизации в промышленных условиях. Показана целесообразность использования стабилизированных зародышей пшеницы в пищевой промышленности.
Практическая значимость работы. Предложенная схема очистки ферментного препарата дает возможность широко использовать его в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием ферментных систем, в том числе и сопряженных, in vitro. Полученные в работе данные способствуют созданию более глубоких представлений о механизмах ферментативной регуляции липидного обмена, что расширяет возможности поиска оптимальных путей интенсификации технологии растениеводства в сельском хозяйстве.
Разработанные способы стабилизации и предложенные режимы хранения зародышей пшеницы апробированы в производственных условиях на экспериментальной базе ООО «Воронежмельсервис» г. Воронежа, ОАО «Бутурлинов-ский мелькомбинат» г. Бутурлиновка. На способы стабилизации зародышей пшеницы получены приоритеты на изобретения №2002133774/13 (приоритет от 15.12.02) и №2003101790/13 (приоритет от 7.02.2003)
Стабилизированный пшеничный зародышевый продукт апробирован в качестве обогатителя при производстве мучных кондитерских изделий на ОАО "Заинский хлебозавод" г. Заинек. За разработку «Способ производства пищевых добавок на основе пшеничных зародышевых хлопьев» получен диплом выставки «Современное хлебопечение. Сладкоежка».
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 6-ой и 7-ой Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002-2003 гг.), международной конференции молодых учёных «От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии" (Тверь, 2002 г.), международной научно-практической конференции "Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции (Воронеж, 2002 г.), ежегодных научных сессиях Воронежской государственной технологической академии (2001-2003 гг.).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 15 публикациях - 6 статьях и 9 тезисах докладов конференций.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Впервые разработан способ очистки липазы зародышей пшеницы до гомогенного состояния, включающий следующие стадии очистки: экстракция, кислотное осаждение, гель-фильтрация на сефадексе G-25, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-хроматография на сефадексе G-150.
2. Исследования, проведенное на высокоочищенных препаратах липазы из зародышей пшеницы показали, что в регуляции активности фермента могут принимать участие ионы Са2+, соли желчных кислот (в концентрации до 20 мМ), стимулирующие ферментативную активность, а также продукты реакции - жирные кислоты, диглицериды, а также холат и дезоксихолат натрия (в концентрациях выше 20 мМ), ионы К+, Mn2+, Си2+, подавляющие активность липазы.
3. На основе идентификации функциональных групп активного центра липазы зародышей семян пшеницы: имидазольной группы гистидина, гидроксильной группы серина, карбоксильной группы глютаминовой или аспарагиновой кислот, предложена гипотетическая модель механизма действия фермента, согласно которой акт катализа обеспечивается "системой с переносом заряда".
Исследования кинетических и термодинамических параметров термической и кислотной инактивации фермента показало относительно низкую термо- и кислотную стабильность липазы. С учётом свойств липазы разработаны рациональные режимы хранения зародышей семян пшеницы, позволяющие сохранить качество продукта и расширить возможности его использования в промышленности.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 202 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, списка литературы (292 источника) и приложения. Иллюстрационный материал включает 47 рисунков и 31 таблицу; в приложении - 9 рисунков и 7 таблиц.
