Введение к работе
Актуальность проблемы
Воздействие умеренного холода на организм в целом – на уровне поведенческих, метаболических, физиологических реакций достаточно хорошо изучено и описано во множестве работ. Однако только в последние несколько лет процессы, происходящие при воздействии холода, стали активно изучаться на молекулярном уровне. Было выявлено, что воздействие умеренного холода (снижение температуры тела на несколько градусов) на клетки млекопитающих вызывает комплексный ответ, включающий, помимо активации компенсаторных механизмов, таких, как убиквитин-протеосомный путь и синтез белков холодового шока, замедление многих процессов: происходит ингибирование транскрипции большинства генов и трансляции большинства белков, процессинга и деградации РНК, ферментативных реакций (Sonna L.A. et al., 2002; Al-Fageeh M.B., Smales C.M., 2006). В этой связи представляется интересным выявленный в опытах на крысах факт, что на фоне воздействия умеренного холода происходит, напротив, увеличение активности ферментов метаболизма ксенобиотиков, и, в частности, цитохрома P450 1A1 (CYP1A1) (Громова О.А. и др., 2002). Механизм этого явления остается неизвестным. Других сведений о влиянии умеренного холода на индукцию CYP1A у теплокровных животных в литературе нет. Известны только немногочисленные работы по изучению индукции CYP1A при совместном воздействии холода и сильных индукторов CYP1A на рыбах (Kloepper-Sams P.J., Stegeman J.J., 1992; Sleiderink H.M., Boon J.P., 1996).
Подсемейство цитохромов CYP1A состоит из двух членов: CYP1A1 и CYP1A2. CYP1A1 конститутивно экспрессируется на очень низком уровне, CYP1A2 - на достаточно высоком, но оба фермента индуцируются при воздействии таких соединений, как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и ариламины, которые являются “классическими” индукторами CYP1A. В последние десятилетия накоплено множество сведений о том, что индукторами CYP1A могут быть не только ксенобиотики типа ПАУ, но и вещества с совершенно иными физико-химическими свойствами, в том числе, эндогенного происхождения (Denison M.S., Nagy S.R., 2003). Физические воздействия тоже способны активировать ферменты метаболизма ксенобиотиков: была показана индукция CYP1A при таких воздействиях, как гидродинамический удар, ультрафиолет, ультразвук, гипероксия (Marin E. et al., 1988; Okamoto T. et al., 1993; Гришанова А.Ю., Зуева Т.В., 2000; Gonzalez M.C. et al., 2001; Monk S.A. et al., 2001; Feng Q. et al., 2002). В ответ на воздействие физических факторов в организме происходит запуск различных биохимических реакций биологически активными веществами, полученными из окружающей среды или освобожденными из физиологических «депо». В случае индукции цитохромов Р450 при действии физических факторов логично предполагать наличие эндогенных медиаторов, опосредующих запуск экспрессии соответствующих генов.
Если активация CYP1A2 может осуществляться как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровне, то для СYP1A1 на данный момент доказан единственный путь активации: путь сигнальной трансдукции, зависимый от арилгидрокарбонового рецептора (AhR).
AhR представляет собой лиганд-активируемый транскрипционный фактор. В неактивном состоянии AhR находится в цитоплазме в комплексе с двумя молекулами Hsp90, кошаперонами и тирозинкиназой c-Src. После связывания с лигандом происходит диссоциация комплекса, перенос AhR в ядро и димеризация с белком Arnt (Ah receptor nuclear translocator, ядерный переносчик арилгидрокарбонового рецептора). Затем гетеродимер AhR/Arnt взаимодействует с элементами, чувствительными к ксенобиотикам (XRE) энхансера гена CYP1A1/2, что приводит к инициации транскрипции CYP1A1/2.
Hsp90 поддерживает AhR в конформации, облегчающей взаимодействие с лигандом, но препятствующей связыванию с ДНК. Hsp90 относится к белкам теплового шока и выполняет функцию шаперона. Известно, что Hsp90 растений могут активироваться и при воздействии холода (Krishna P. et al., 1995), но данных о влиянии холода на Hsp90 животных в литературе нет.
AhR и Arnt являются фосфопротеинами, поэтому процессы фосфорилирования и дефосфорилирования играют важную роль в Ah-рецепторном пути. Известно, что для димеризации Arnt c AhR необходимо фосфорилирование Arnt, а для связывания комплекса AhR/Arnt с ДНК - фосфорилирование AhR и осуществляется оно по тирозиновому остатку (Ma Q., 2001). Ряд литературных источников свидетельствует о том, что ингибиторы тирозиновых киназ (ТК) семейства Src снижают экспрессию CYР1A, при этом аналогичные данные о действии на CYР1A неспецифических ингибиторов ТК противоречивы. Имеющиеся в литературе сведения о влиянии на экспрессию CYР1A ингибиторов ТК получены при работе с клеточными культурами и не могут быть экстраполированы на животных. Литературные данные свидетельствуют также о том, что киназы осуществляют посттрансляционную модификацию некоторых форм цитохромов P450, например, CYP2B1/2 (Oesch-Bartlomowicz B., Oesch F., 2005), однако данных о роли ТК в фосфорилировании CYP1A в литературе нет.
Известно, что интенсификация метаболизма в условиях холода приводит к возрастанию уровня окислительных процессов в клетке (Куликов В.Ю. и др., 1998; Шустанова Т.А., и др., 2001; Бородин Е.А. и.др., 1992; Sahin E., Gml S., 2007). Это может приводить к накоплению в клетке поврежденных белков и к активации протеосомной системы, осуществляющей их деградацию. Протеосомная система также опосредует процесс деградации и негативной регуляции AhR. Известно, что под действием “классических” индукторов CYP1A in vitro наблюдается усиление деградации AhR протеосомами, что обеспечивает отрицательную обратную связь, приводящую к уменьшению периода полужизни AhR и, следовательно, к ослаблению гиперэкспрессии CYP1A (Ma Q., Baldwin K.T., 2000; Santiago-Josefat B.E. et al., 2001). Данных о том, происходит ли аналогичный процесс in vivo, в литературе нет.
Цель и задачи исследования
Цель данной работы состояла в исследовании механизма, лежащего в основе увеличения активностей цитохромов Р450 подсемейства 1А в печени крыс при воздействии на организм умеренного холода.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить относительное содержание мРНК и количество белка CYP1A в печени крыс при разной длительности пребывания животных при 4С.
-
Исследовать относительное содержание мРНК, функциональную активность и количество белка AhR в печени крыс при разной длительности пребывания животных при 4С.
-
Исследовать относительное содержание мРНК Arnt, AhRR и Hsp90 в печени крыс при разной длительности пребывания животных при 4С.
-
Исследование возможности участия эндогенных соединений в качестве посредников в процессе индукции CYP1A в печени крыс при разной длительности пребывания животных при 4С.
-
Исследовать возможную роль протеосом и тирозиновых протеинкиназ (используя в качестве инструмента исследования ингибиторы тирозиновых киназ) в активации CYP1A под действием холода.
Научная новизна
Впервые установлены механизмы индукции CYP1A под действием холода: индуцирующее влияние холода на CYP1A1 реализуется на транскрипционном уровне через AhR-зависимый путь сигнальной трансдукции, а CYP1A2 - на посттранскрипционном уровне. Впервые выявлено, что при холодовом воздействии происходит снижение экспрессии таких компонентов AhR-сигнального пути, как Arnt и Hsp90. Показано, что эндогенным посредником в процессе регуляции экспрессии CYP1A1 под действием холода может быть токоферол. Показано, что при этом происходит повышение относительного содержания мРНК токоферол-переносящего белка (-ТПБ), осуществляющего перераспределение токоферола в организме. Впервые показано разнонаправленное изменение активностей протеосом в печени крыс под действием холода: повышение химотрипсиновой и пептидилглутамин-пептидгидролазной протеосомных активностей и уменьшение трипсиновой протеосомной активности. Впервые показана взаимосвязь ТК семейства Src с уменьшением активности CYР1A1 в печени крыс, подвергнутых воздействию холода, на посттранскрипционном уровне. ТК (но не семейства Src) связаны с увеличением активности CYР1A2 в печени крыс при воздействии на крыс умеренного холода (4С) на посттранскрипционном уровне.
Научно-практическая значимость
По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование молекулярного механизма индукции CYP1A в печени крыс под действием холода. Полученные результаты имеют значение для понимания механизмов активации экспрессии генов CYP1A.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Воздействие на крыс умеренного холода приводит к увеличению в печени крыс активности CYP1A1 в результате активации транскрипции гена CYP1A1 с вовлечением Ah-рецептор зависимого пути сигнальной трансдукции, а также к увеличению активности CYP1A2, регулируемой на посттранскрипционном уровне.
-
a-Токоферол может участвовать в индукции CYP1A1 в печени крыс под действием холода в качестве одного из эндогенных посредников.
-
При воздействии на крыс умеренного холода происходит повышение химотрипсиновой и пептидилглутамин-пептидгидролазной протеосомных активностей, и понижение трипсиновой протеосомной активности.
-
К факторам, негативно регулирующим активность CYP1A1 в печени крыс на фоне воздействия холодом, можно отнести ТК. ТК семейства Src уменьшают активность CYР1A1 в печени крыс, подвергнутых воздействию холода, на посттранскрипционном уровне. ТК (но не семейства Src) участвуют в увеличении активности CYР1A2 в печени крыс при воздействии на крыс умеренного холода на посттранскрипционном уровне. Лимитирующими индукцию CYР1A холодом факторами являются Arnt и Hsp90.
Апробация работы Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология – наука XXI века”, Пущино, 2004; IX Дальневосточная молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2005; XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов - 2006”, Москва, 2006; девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей “Человек и его здоровье”, Санкт-Петербург, 2006; VI Всероссийская конференция молодых ученых “Проблемы фундаментальной и прикладной медицины” в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине, Новосибирск, 2006; международная научная конференция “свободные радикалы, антиоксиданты и старение”, Астрахань, 2006.
Публикации
По теме диссертации опубликованы 3 статьи и 6 тезисов в сборниках конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 17 таблиц. Список литературы включает 298 источников, в том числе 275 иностранных.
