Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОСНОВНЫЕ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ХОЛЕРНОЙ ДИАРЕИ 9
1.1. Строение холерного энтеротоксина 9
1.2. Механизм действия холерного энтеротоксина через посредство внутриклеточных медиаторов 10
1.3. Возможные молекулярные механизмы энте-ротоксического действия холерного токсина 13
ГЛАВА 2. ИЗМЕНЕНИЕ СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ ДЕТОКСИКАЦИИ ПЕРЕКИСЕЙ ПРИ ПАТОЛОГИИ 18
2.1, Влияние индукторов, ингибиторов и факторов повреждения на глутатионтрансферазную активность 18
2.I.I. Глутатионтрансферазная активность при воспалительных процессах 22
2.2. Состояние редокс-системы глутатиона и супероксиддисмутазы в экстремальных
условиях 24
ГЛАВА 3. АНТИТОКСИЧЕСКАЯ ФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА В ТОН КОЙ КИШКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ : 42
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ТОНКОЙ КИПІКИ И ПЕЧЕНИ ИНТАКТНЫХ КРЫС 59
ГЛАВА 6. СОСТОЯНИЕ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ТОНКОЙ КИШКИ И ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ХОЛЕРНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА 63
6.1. Динамика ферментатичной активности в тонкой кишке при воздействии холерного энтеротоксина 63
6.2. Динамика активности ферментов антиокислительной системы в печени крыс при воздействии холерного энтеротоксина 73
ГЛАВА 7. КОРРЕКЦИЯ СОСТОЯНИЯ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ТОНКОЙ КИШКИ И ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ХОЛЕРНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ 83
7.1. Влияние глутатиона на степень развития диарейного синдрома 83
7.2. Влияние глутатиона на состояние ферментов антиокислительной системы в условиях холерной интоксикации 86
7.3. Изменение коэффициентов соотношений активности ферментов при введении глутатиона на фоне действия холерного токсина 93
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 101
ВЫВОДЫ 106
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 108
Приложение 132
- Строение холерного энтеротоксина
- Влияние индукторов, ингибиторов и факторов повреждения на глутатионтрансферазную активность
- АНТИТОКСИЧЕСКАЯ ФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА В ТОН КОЙ КИШКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
- ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ТОНКОЙ КИПІКИ И ПЕЧЕНИ ИНТАКТНЫХ КРЫС
Введение к работе
Для современного этапа развития медицины характерно изучение молекулярных аспектов патологических процессов. Выделение бактериальных токсинов, их очистка, изучение свойств, выяснение характера вызываемых ими повреждений вскрывают новые патохимические и патофизиологические основы заболеваний, в том числе, кишечных инфекций. Было показано, что энтеро-токсины включают сложную цепь структурных, функциональных, биохимических изменений на уровне мембран энтероцитов, приводящих в конечном счете к нарушению проницаемости и избыточной секреции одновалентных ионов и воды, что определяет развитие диарейного синдрома. К ряду этих веществ относится холерный токсин (XT), молекулярные механизмы действия которого, несмотря на большой интерес исследователей к этому вопросу, до конца не ясны.
Связь процессов метаболизма аденилатциклазной (АЦ) и простагландин (ІІГ) - синтетазной систем - отправных пунктов комплекса патохимических и функциональных проявлений холерной интоксикации, - с активированными формами кислорода, а также роль перекисного и свободнорадикального окисления в патологии /132/ определяет наш интерес к состоянию антитоксической системы тонкой кишки при воздействии XT.
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Система детоксикации токсических веществ и активированных форм кислорода предназначена для выполнения двух функций: инактивации вредных веществ и реакци-онноспособных интермедиатов кислорода, а) образующихся в процессе жизнедеятельности организма, и б) поступающих в организм извне. Что касается первой, то она представляется достаточно изученной в печени, почках, форменных элементах крови, сердце. Вторая функция освещена фрагментарно или остается в тени.
Взаимосвязь перекисных и свободнорадикальных процессов с формированием иммунного ответа организма на бактериальные токсины и проявлениями токсичности на организменном уровне получает все более существенное подтверждение. Так, известно а) усиление генерации Н202 и супероксидных анион-радикалов (О^-) фагоцитами при их контакте с микробными клетками /163/, б) изменение активности ферментов системы детоксикации в лейкоцитах и макрофагах при воспалительных процессах / 64,79,152,161/; в) развитие воспаления вследствие энзимопении /160/, г) способность антиоксидантов оказывать защитный эффект при введении животным микробных клеток и их токсинов, д) накопление продуктов перекисного окисления в тканях при бактериальной интоксикации /39, 132/.
Однако функционирование антитоксической системы в тонкой кишке - основной мишени бактериальных токсинов, и, более того, ее участие в защите организма от инфекционного повреждения осталось без внимания исследователей.
В связи с этим целью работы было установить реакцию ферментной системы детоксикации органических токсических веществ и активированных форм кислорода на воздействие холерного токсина и изыскать возможность коррекции выявленных нарушений воздействием на данную систему.
Для достижения этой цели было необходимо в первую очередь решить следующие задачи:
I) выявить количественное и качественное соотношение -. 7 - активностей ферментов редокс-системы глутатиона и суперокси-ддисмутазы в цитозоле тонкой кишки нормальных животных; определить степень повреждения антитоксической системы тонкой кишки при воздействии холерного токсина; сравнить выявленные изменения с состоянием ферментной системы печени - основного детоксицирующего органа - в моделируемом патологическом процессе; разработать экспериментальные подходы к восстановлению обнаруженных нарушений в системе детоксикации органических токсических веществ и активированных форм кислорода.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые проведено изучение антитоксической системы в тонкой кишке. Исследовано количественное соотношение ферментов редокс-системы глутатиона и суперок-сиддисмутазы в разных отделах тонкой кишки, проведено сравнение с таковыми в печени крыс и показано, что активности большинстве, изученных ферментов в печени, в большей или в меньшей степени, превышают таковые в тонкой кишке, что говорит о большей интенсивности перекисных процессов в печени.
Показано, что холерный токсин вызывает изменение активностей ферментов системы детоксикации не только в слизистой оболочке тонкий кишки, но и в печени.
Внутрибрюшинное введение восстановленного глутатиона (Гв) на фоне действия XT эффективно уменьшает диарейный синдром. Впервые установлен факт нарушения баланса мощностей ферментной антитоксической системы воздействием холерного токсина и его частичное восстановление посредством экзогенного глутатиона.
НАУЧНАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Полученные в настоящем исследовании данные позволяют охарактеризовать ферментную систему детоксикации органических токсических веществ и интермедиатов кислорода в тонкой кишке.
Выявленные изменения антитоксической системы тонкой кишки вскрывают новые механизмы метаболических основ патофизиологических проявлений действия холерного экзотоксина. Установление нарушения баланса мощностей изучаемой системы как в слизистой оболочке тонкой кишки, так и в печени, и восстановление его экзогенным восстановленным глутатионом открывает новые возможности для поисков целенаправленной патогенетической терапии инфекционной патологии.
Положения, которые выносятся на защиту:
Тонкая кишка крыс обладает мощным резервом антитоксических ферментов.
Холерный токсин вызывает изменения в функционировании антитоксической системы тонкой кишки и печени крыс.
Выявленные нарушения системы детоксикации вскрывают новые механизмы метаболических основ патофизиологических проявлений действия XT.
Частичное восстановление нарушения баланса ферментативных резервов антитоксической системы кишки и печени посредством экзогенного глутатиона.
ОБЗОР ЛИТЕРА1УРЫ
Строение холерного энтеротоксина
В настоящее время общепризнана роль холерогена /экзотоксин холерного вибриона/ в развитии характерного для холеры синдрома-электролитной диареи.
Молекула холерного токсина с молекулярной массой 84 кдаль-тон состоит из двух белков А и В с молекулярными массами 27 и 58 кдальтон, соответственно. Компонент А представлен двумя полипептидами, соединенными дисульфидной связью - А-г /М.в. = = 22 кдальтон/ и Ag /М.в. = 5 кдальтон/.
Компонент В состоит из 5 одинаковых субъединиц / с М.в, = 11,6 кдальтон/, каждая из которых имеет в своём составе по одному дисульфидному мостику /126,127/.
Предполагается, что каждая из субъединиц В обеспечивает связывание XT с ганглиозидом G-Mj клеточной мембраны, результатом чего является проникновение субъединицы А внутрь клетки /126/, Расщепление дисульфидной связи в субъединице А приводит к образованию пептидов АуИ Ag. Пептид Ag, по-видимому, нужен для проникновения молекулы XT внутрь клетки. Отщепление Ag приводит пептид А-г в активное состояние /91,92/. Проявление биологического эффекта XT обусловлено каталитической активностью пептида Ay /1,2,3/.
class2 Изменение состояния системы детоксикации перекисей при патологии class2
Влияние индукторов, ингибиторов и факторов повреждения на глутатионтрансферазную активность
Глутатионтрансфераза (ГТ-К.Ф.2,5.1.18) - привычный путь биодеградации эпоксидов в тонкой кишке /72,116/ и один из основных ферментов обезвреживания органических соединений в печени.
Система детоксикации, одним из представителей которой является ГТ, эволюционно предназначена для выполнения 2-х функций: I/ обезвреживания токсических веществ, образующихся в процессе жизнедеятельности организма; 2/ и токсинов, поступающих извне. Что касается первой функции, то она представляется достаточно изученной /63,113,115,119,125,140/. Что касается второй, то она находится на начальном этапе исследования. Большая часть экспериментальных работ направлена на выяснение эффекта индукторов и ингибиторов на активность ГТ. Так, JOUnes et OLt /178/ изучали влияние метаболических индукторов /фенобарбитал - ФБ, рифампицин, ДЦТ/ на содержание глутатиона и активность ГТ к арил- и эпоксид-субстратам в ци-тозоле печени крыс. Авторы показали, что под воздействием этих веществ так же, как и при голодании, наблюдается повышение ГТ-активности к обоим субстратам. Содержание глутатиона снижается цри голодании, а при введении ФБ его уровень медленно нарастает. Частичная гепатэктомия, острая и хроническая алкогольные обработки, экспериментальный диабет и тиреоидная дисфункция проявляются в более или менее длительном повышении эпоксид-трансферазной активности, в то время как арил-транс-феразная активность не изменяется. При экспериментальном хо-лестазе и повреждении печени четыреххлористым углеродом эпок-сид-трансферазная активность снижается.
Уровень глутатиона при частичной гепатэктомии возрастает ко 2 дню после операции и снижается к 7 дню. В холестати-ческой печени концентрация его медленно нарастает. В случае тиреоидной дисфункции отсутствует корреляция между содержанием глутатиона и ГТ-активностью. Авторы объясняют это тем, что при данной патологии метаболитическая конъюгация парацетамола и глутатиона и его экскреция в виде коньюгатов меркаптуро-новой кислоты не изменяется.
Работа других авторов /77/ посвящена сравнению эффектов ФБ и ДЦТ на активность ГТ печени у грызунов и обезьян. Установлено, что индуцибельность данного фермента у нечеловекообразных приматов /бабуин, макака-резус/ много меньше, чем у грызунов /крыс/.
В этом же направлении проведено исследование Ъог&вхаС /76/, которые установили увеличение ГТ активности и содержания глутатиона в печени крыс после фенобарбитальной обработки. Результаты позволили авторам предположить, что ФБ может изменять функциональную активность фермента не только посредством повышения скорости образования менее токсичных метаболитов, но и за счет роста уровня глутатиона, необходимого для формирования этих коньюгатов.
Антитоксическая ферментная система в тонкой кишке экспериментальная часть
О состоянии ферментов антитоксической системы в тонкой кишке нормальных животных мало что известно. Из интересующих нас ферментов достаточно изучена глутатионтрансфераза.
Mtfbn ЄІ ПІ I 72/ исследовали ГТ-активность в цито-золе трех отделов тонкой кишки нормальных животных к следующим субстратам: п - нитробензилхлориду /аралкил/, 1,2-эпокси-З/п-нитрофенокси/-пропану /эпоксид/ и этакриновой кислоте /алкин/. Установлено, что уровень ГТ-активности ко всем субстратам в проксимальном отделе тонкой кишки превышает таковой в среднем и дистальном отделах. Кроме того, уровни специфической активности ГТ в проксимальном отделе тонкой кишки значительно ниже таковых для печени и почек. 18-час голодание вызывает падение глутатионтрансферазной активности к 3-м указанным субстратам, причем, в проксимальном и дистальном отделах - более всего снижается её активность к эпоксид- и аралкил-субстратам, а к алкин-субстрату - только в проксимальном участке. В среднем отделе тонкой кишки все обнаруженные активности были значительно подавлены. Авторы подчеркивают различную ферментативную обеспеченность отделов тонкой кишки, и, естественно, неодинаковую реакцию этих отделов на действие индукторов. Так, обработка бенз-пиреном вызывает 49$ увеличение алкин-трансферазной активности в дистальном отделе тонкой кишки, и повышение на 53 и 23$ арал-кил-трансферазной активности - в среднем и дистальном, соответственно. 3-МХ обуславливает 33$ и 37$ превышение активности к алкин-субстрату и 23$ и 21$ - к аралкил-субстрату в среднем и дистальном отделах, соответственно. Фенобарбитал увеличивает уровни /26$ и 33$ :/ аралкил-трансферазы в этих же отделах. В проксимальном участке ферментативная активность не изменялась ни одним из исследованных индукторов. Ни в одном из отделов не наблюдалось изменений эпоксид-трансферазной активности. Авторы указывают на сходство в распределении глутатионтрансфера-зы и бензпирен-гидроксилирующей системы по длиннику тонкой кишки /176/. У голодающих животных также отмечается сходство этих ферментных систем /177/.
В тонкой кишке ферментная детоксикация эпоксид-промежу-точных соединений осуществляется, в основном, глутатионтрансфе-разой. Влияние диеты и индуцирующих агентов на активность ГТ играет роль в метаболизме и действии канцерогенов в этом органе. На основную роль ГТ в системе детоксикации тонкой кишки указывают авторы работы /120/.
Материалы и методы результаты исследования и их обсуждение
Дальнейшие эксперименты посвящены исследованию состояния антиокислительной системы во фракции цитозоля слизистой оболочки тонкой кишки и ткани печени крыс при различных воздействиях. Для отбора экспериментального материала было взято 5 групп крыс, по 7-Ю в каждой. Животные первой группы служили интактным контролем, их забивали декапитациеи под легкой эфирной анестезией. Крысам 2-й группы вводили внутрибрю-шинно по I мл раствора Гв /из расчета I г/кг массы/, рН=7,4. Животных 3,4,5-х групп оперировали под гексеналовым наркозом по методу, описанному в главе 4.2. Крысам 3-й группы в лиги-рованную тощую кишку вводили по 0,5 мл физиологического раствора /контроль на операцию/, 4-й группы - по 0,5 мл раствора XT /70 мкг/100 г массы/, 5-й группы - по 0,5 мл того же раствора XT, и, через 15 минут перед закрытием брюшины по I мл раствора Гв /1г/кг массы/, рН = 7,4 - в/б. Через 4 часа животных 2-5 групп забивали декапитациеи. Перевязанный отдел тонкой кишки / у животных первой группы - проксимальный, средний и дистальний отделы/ крыс 1-5 групп промывали, а печень перфузировали буфером, указанным в главе 4.2. Из слизистой оболочки кишки и ткани печени выделяли фракцию цитозоля.
Исследование активности ферментов антиокислительной системы тонкой кипіки и печени интактных крыс
Данные о ГП-ГТБ, 141-. СОД, ГР-активности в тонкой кишке интактных крыс в доступной литературе отсутствуют (глава 3). Поэтому начальным этапом работы явилось изучение активности ферментов антиокислительной системы в слизистой оболочке тонкой кишки - мишени бактериальных токсинов, и сравнение ее с уровнем таковых в печени - основном детоксицирую-щем органе организма.
Предварительно определена ГТ, ГП-ГТБ, ССД активность в проксимальном, среднем и диетальном отделах тонкой кишки.
Таким образом, впервые проведено изучение активности глутатион-зависимых ферментов и супероксиддсмутазы в разных отделах тонкой кишки нормальных крыс. Установлено, что ГТ-ак-тивность к СДНБ в питозоле тонкой кишки убывает от проксимального к дистальному отделам, что согласуется с указанным ранее /72/ характером распределения уровня активности данного фермента к р- нитробензилхлориду, 1,2-эпокси-3/-нитрофенокси/--пропану и этакриновой кислоте по длиннику кишечника. Установленные различия в ферментной обеспеченности отделов тонкой кишки связаны, по-видимому, с разной функциональной значимостью этих отделов. Наибольшая активность ГТ в проксимальном отделе может быть связана с тем, что клетки этого участка кишки подвергаются воздействию основной массы токсических веществ, поступающих в организм извне.
Для сравнения ферментативных резервов тонкой кишки и печени выбран тощий (средний) отдел, который в дальнейших экспериментах подвергается действию холерного токсина.
Из таблицы 2 видно, что активность ГТ /в расчете на мг растворимого белка/ в печени в 5 раз превышает таковую в слизистой оболочке тощей кишки, в расчете на г сырой массы ткани - в 20 раз. ГП-ГТБ и ГП-Н2О2 уровни в печени также выше, чем в тощей кишке, в 9 и 3-4 раза, соответственно. Активность ГР, напротив, в печени в 2 раза ниже, чем в слизистой оболочке тощей кишки.
