Введение к работе
I.I. Актуальность темы. Изучение ферментных механизмов защчтіі
клетки от токсического действия ксенобиотиков представляется весьма
актуальной и вашюй для биохимии проблемой. Многочисленныш работами
послодшсх лет, выполненными как у нас в стране, так и за рубежом, рас
шифрованы основные пути детоксикации чужеродных соединений; достагну-
тк значительные успехи в исследование структуры, свойств, молекуляр
ной организации ферментных систем, ответственных за биотрансформацшо
ксенобиотиков /Парк Д.Б., 1973; Арчаков В.Й., 1975; Покровский А.А.,
1977; Панченко Л".Ф.и др.1981;1яхович В.В., Цкрлов. Й.Б., 1981; Archakov,
Baclmanova, 1990; Palkonen, Vegakangaa, I9S0/. Однако, остается
много неясного в механизмах регуляции ферментативной актшзпосга.роли
отдельных ферментов в процессах биотрансйормации к детоксикации ряда
ксенобиотиков, загрязняющих скружагацузо среду и представлякьгих реаль
ную опасность для здоровья человека.
Б последние гсды все большее внимание спедиалистов в области ох-. ранн окружающей среды и токсикологии привлекают.химические соединения, имеющие в своей структуре эпоксидную группу. Это вниглашю к эпокоидам обусловлено их высокой биологической активностью:.являясь шсокореак-тивными электрофильньши соединениями, эдсксиды способны вступать в нуклеофнльные взаимодействия с такими макромолекулами клетки, как ДНК и ЭДК, что и обуславливает их токсическое, .мутагенное и канцерогенное действие Доблякоз В.А., Коляда А.Ю., 1986; Ibrnandez, в«пд, 1982; IAEC, Monographs , IS85; Pluramr.r <>.t аї., 1987; Наіялкаг et al., 1989/. Соединения этого класса шрока распространены в природе и могут, поступать в организм человека в виде лекарственных веществ а зш> рязнигелей пищевых продуктов, как биологического, так-и антропогенного происхождения /Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; U.RO Monog- .. raphs,I985; Hegnaud et al., 1988/. Эпоксидные соединения могут образовываться эндогенно в процессе метаболического превращения различных субстратов монооксигеназной. системой клеток печени, леигих, почек, желудочно-кишечного тракта И.др. органов /Halankav *t al., 1989; Archa-kov, BechEiaiova , 1990/. Учитывая високув биологическую активность эпокеидов, внимание.специалистов в области ксенобиохимии сконцентрировано на ферментах, участвующих в процессах юс обезвреживания, в
частности на-эдоксадгидролазах /ЭГ/.. . .. - ~
-I.2.. Цель .работы..Целью настоящей работы.является изучение влияния различных алиментарных.и-токсических факторов на активность мин-? росомной. ЭГ и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени ж . слизистой оболочки тонкой кишки крыо. Дія ее реализации сформулирова-
ш слєдущиб задачи: . * .
Дать сравнительную характеристику микросомной ЗГ печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс;
Изучить влияние алиментарных факторов /уровня пищевого белка рациона, качественных различий жирового компонента рациона и различного обеспечения.рациона соленом/на активность и свойства ЭГ печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс; . * '
Изучить влияние некоторых конташнантов пищевых продуктов биологической природы /апоксвдсодеркащх микогоксанов: 1-2 токсина, "де-зоксиниваледала /ДОН/ и афлатоксина Bj/ на. активность и свойства ЭГ печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс. . .
1.3. Научная новизна и теоретическое значение твботн. Впервые -дана сравнительная характеристика свойств ЭГ макросом печени и ели- . зистоп тонкой кишки крнс. При этом установлено, что оба-фермента имеют одинаковый оптимум ptt, близкие значения кажущейся Ку, но отличаются по У'уех' Удельная'активность ЭГ слизистой кишечника составляет 4,8-IO/S от активности з печени. Мякросомная ЗГ печени и слизистой кишечника различаются по стелеш индуцибельности і» vivo но в равной степени подвержены модулирующему действию активаторов in vitro.
При.выделении ЭГ из макросом печени был разработан метод, с помощью которого удалось получить высоксочищетшй /в 63 раза/ препарат ЭГ печени и. частичноочщешнй /в 11,6 раза/ препарат фермента из макросом слизистой.оболочки тонкой кишки крыс. Установлено, что характер питания оказывает выраженное регулиругацее действие на активность микросомной ЭГ и. других, ферментов метаболизма ксенобиотиков печени,., крыс, и, в значительно меньшей степени, на активность Фермента слизистой оболочки тонкой кишки,
-
Научно-практическая. значимость тзаботы. В опытах на животных доказана.высокая чувствительность микросомной.ЗГ к воздействию раз- . личных токсических факторов. В частности показано, что длительное поступление низких доз эпокоядсодержащих микотоксинов - Т-2 токсина.и . ДОН, а также афяатоксина Вр метаболизирувдегося в печени с образованием эпокевда, вызывает значительное .увеличение активности ЭГ как в печени, так-и. в слизистой оболочке тонкой кашки, крыс*. Предложено использовать определение активности ЭГ.цри токсиколого-гигиенической оценке.пищевых добавок я конташнантов пищевых".продуктов.
-
Внедрение -результатов в птактику.Иа основании проведенных . токсикслохо-бшхижіческих исследований, .вклгчаащих-изучение^.активности ЭГ и других ферментов метаболизма ксенобиотиков, дано заключение. о безвредности пищевой добавки - интенсивного подсластителя асиарта-
ма /регистрационные удостоверения Минздрава СССР - ГЕ-8-242 lb 01630 от 30 мая. 1989' г. и.ІГ-8-242 0І90І от 6 июля 1990 г./.
Апробация -работа. Результаты исследований докладывались на У Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модафшация макромолекул" /Ялта, ноябрь 1989/; на 7-м Медпупародиом симпозиуме "Микроэлементы у человека и животных" /Дубровник, май 1990/; научной конференции с кеддународшал участием "Питание: здоровье и болезнь" /Москва, ноябрь 1990/.
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано. 15 научных работ, перечень которых приводится в конце автореферата, .
Структура и объем диссертация. Диссертационная работа изложена на,- страницах машинописного текста, включающих 3 схеш, 53 таблицу, '41.рисунок . и состоит.из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы / источника, в том числе отечественных/.
Исследования проводились на крысах-самцах линии Вистар. Всего в работе было использовано более 700 животных.
В качестве исследуемого материала использовали шкросомную фракцию печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс, полученную методом дифференциального центрифугирования / stohs et al., 1976; lake, 1987/. В микросомах печена определяли активность ЭГ /НФ 3.3.2.3/ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя в.качестве субстрата стиреноксид /Кравченко Л.В., Соболев B.C., 1989/; содержание цитохрома Р-450 /НФ 1.14.14.1/ по методу Омура и Сато / Omura, Sato, 1984/; активность ?-этоксикумаринде&тилазы по.методу Лэйка /bake, 1987/ и.активность карбоксилэстеразы /Ш 3.1.1.I/ по методу Мендоса с соавт. / Mendoza et al., 1971/. В микросомах слизистой . оболочки кишки определяли активность ЭГ к карбоксилэстеразы. Содержание белка в микросомных фракциях определяли по методу Лоури и соавт.
/Lowiy et al., 1951/.
Величины каяущихся К^ ж У}лах определяли в координатах Лаинуиве-* ра-Бэрка и Зди-^Хофсти в пределах изменения концентрации субстрата от 0,03 до 0,6 мМ.
В опытах in vivo изучали действие бензила /вводили.в/бр; 5 да.; 210 да/кг/; трансэпоксистильбена /в/ср; 3 дн.; 400 мг/кг/; 2-ацето-амидсфгуорена /в/бр; однократно; 35 мг/кг/;-бутилокситолуола/в/бр; 4 дн.; I г/кг/ и зикеорина /в/ж; однократно; 120 мг/кг/. В огшгах
іл vitro бензил, трансэпоксистяльбен и бушпокситолуол добавляли в инкубационную среду в конечной концентрации 1,5 Ш /в 4 шел ДЛСО/ за 5 ыин до внесения субстрата /2 мЭД/. Эпоксициклогексен /1,6 ыМ в ДОО/ и Т,2-эюкси-3,3,3-трихлорпропан /0,4 ьМ з ацетонитриде/ одновременно с субстратом; 2-бром-4-шітроацотофєноя /0,3 мМ.в ацетояитриле/ за 10 мин до внесения субстрата /Оевсії e't al., І97І; Du Boies et el., І97Б; Bants .Sobnell, 1981/. Тйл кнтибирования и величины Ги ЭГ апоксиївжтогсксенои определяли в двойных обратных координатах при концентрации субстрата 0,02-0,25 гМ и концентрациях ингибитора 0,15 и 0,25 Ш.
Выделение и очистку ЭГ из макросом печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс осуществляли по следующей схеме:
МЖ?0С0?ЖЯ ФРАКЦІЮ . .
Солюбилпзация /1% тиствор холата натшя, , .0,1% раствор Тритона Х-ЮО/
12 мг. бєлкаД'Л,- 3 часч
ЖГЕРГВНТ-СОЛІОБІШ^ЗНРОБАИМІ МЕМБРАННИЙ МАТЕРИАЛ
I. Высаливание сульфатом аммония /0 - 25$/
центрифугирование 23 000 х g, 30 шв
ФРАКЦИЯ /сультат аммония/'- s 25
II. Высаливание сульфатом аммония /25 - 3S&/
центрифугирование 23 000 х g , 30 тк
ФРАКЦИЯ /сульйат аммония/ - s gg
III. Высаливание сульфатом аммония /36 - 60#/
центрифугирование 23 000 х g , 30 мин
ФРАКШИ /после внеалявзння сульфатом аммония/ - Sgo
Диализ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ДЕАЕ - Sephacol : 65 фракций
/Snulgen Е - 913; 0 - 0,5^; V ОС5Щ.-500 м*/
Чистоту и молекулярную массу белковых фракций проверяли гель-электрофорезом по методу Лэммли Дэсвзаи:, 1970/; гели окрашивали по методу Ньахоффа /ffeuhoff et «a. , I2S5/; в качества стандарта использовали набор белков /"Signa.", США/.
При изучении влияния алиментарных факторов на активность ЭГ, животине содержались ка изокалорийных полусинтеткческих рационах, разработанных Институтом питания Affi СССР.
При изучении влияния уровня пищевого белка животные в течение 2 мес. получали рационы с содержавием балка 5%, 18$ и 33$ белка казеина. Изокалорийность обеспечивалась sa счет изменения количества углеводов /маисового крахмала/. При изучении влияния качественно раз-
личных аиров рациона крысы были разделены на 5 групп и в точение і нед. получали полноценные рационы, жировой комсонеит которых был представлен кукурузным маслом, лярдом и.ихтиеновш маслом, полученным из мышечной ткани сельди "Иваси" /1,П и ІУ. г?.,соотаетс'гвеняо/. В рационы крыс Ш и 7 .гр. .кнровоЗ; компонент которых был представлен лярдом, и-рыбьим лиром, добавляли с^-токоферол в концентрации, эквивалентной его содержанию в кукурузном масло. При.изучении влияния обогащения рациона селеном, крысы в.течение 6 нед. получали рационы с различным содержанием селена - 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 мг селена на I кг рациона., Б качестве источника селена.добавляли дрожжевую муку с вы-? .. соким содержанием селена, селеномвтионин /"ліко ", Фншткдяд/ и селенит натрия. При.изучении хронического действия мнкотоксинов животные в течение 6 мес. получали Т-2 токсин /0,063 мг/кг массы.тела - 0,021 И) 50/, ДОН Д,6 мг/кг - 0,024 . Ы>50/, афлатонеяя 2г /0,008 мг/кг -0,001. Ы) 5q/. Токсины-вводили в/ж а 0,1-0,5$ растворе этанола 5 раз в нед. При изучении возмогших механизмов.возрастания активности. ЭГ при действии трихотецяиовых мшеотоксинов, подостркй Т-2 токсикоз у животных вызывали введением Т-2 токсина в/я в течение 9 дней в дозе. 0,64 мг/кг массы тела. При изучении влияния актиношщина D на сте--пень возрастания активности ЭГ, вызванное Т-2 токсином; апвотнш зво- . дали.фенобарбитал /в/бр; 75 мг/кг; 5 дней/.и актиноміцин D /0,1 шз/кг; в/бр; за 30 мин до введения фенобарбитала/. Бо второй серии.эксперимента животным вводили Т-2 токсин /в/а;. I от/кг - 3 дня и 0,7 мг/кг - 4 дня/ и актиношцин D за 30 мин до введения Т-2 токсина,
