Содержание к диссертации
Введение
1.1. Молекулярные механизмы апоптоза и его биологическая роль в поддержании тканевого гомеостаза 8
1.2. Влияние токсических и алиментарных факторов на систему программируемой гибели клетки 20
1.3. Современные методические подходы к исследованию активности апоптоза 23
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Экспериментальные животные 31
2.2. Схемы экспериментов 34
2.3. Биохимический метод определения активности каспазы -3 4
2.4. Морфометрические исследования 41
2.5. Гель-электрофореза изолированных клеток «ДНК-комет» 43
2.6. Статистическая обработка результатов исследований 45
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 46
3.1. Сравнительная характеристика методов определения активности апоптоза у крыс на экспериментальных моделях токсического воздействия 46
3.1.1. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия адренокортикотропного гормона 46
3.1.2. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия CCl4 51
3.2. Оценка чувствительности различных методов определения активности апоптоза при внутрибрюшинном введении низких и минимально действующих доз CCl4 лабораторным животным 57
3.3. Оценка чувствительности различных органов лабораторных животных к действию низких и минимально действующих доз CCl4.. 59
3.4. Определение активности апоптоза у крыс как биомаркер при оценке влияния алиментарных факторов 63
3.4.1. Влияние дефицита пантотеновой кислоты на активность апоптоза в органах крыс на модели сочетанного действия CCl4 и витаминной недостаточности 63
3.4.2. Влияние фитостероидов на активность апоптоза у крыс 66
3.4.3. Определение активности апоптоза у крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена vip3Aa20 70
Глава 4. Заключение 75
Выводы 83
Список литературы 85
- Влияние токсических и алиментарных факторов на систему программируемой гибели клетки
- Современные методические подходы к исследованию активности апоптоза
- Биохимический метод определения активности каспазы
- Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия адренокортикотропного гормона
Влияние токсических и алиментарных факторов на систему программируемой гибели клетки
Современные знания о молекулярных механизмах развития апоптоза не оставляют сомнений , что регуляция апоптоза находится в прямой зависимости от пищевого статуса [99, 151], однако в научной литературе сведения по данному вопросу разрозненны и противоречивы , и для их систематизации необходимо проведение целого ряда дополнительных исследований. Так, очевидно, что обеспеченность организма полноценным белком является необходимым условием для нормального развития процесса апоптоза, поскольку все апоптоз-специфические рецепторы и ферменты представляют собой белковые молекулы , тем не менее , в литературе практически отсутствуют экспериментальные данные о влиянии диет с различным содержанием белка на изменение активности апоптоза [117, 151]. Липиды также принимают активное участие в регуляции программы клеточной смерти: в качестве структурных компонентов липиды определяют функциональное состояние мембран клеток и клеточных органелл, а также функциональное состояние рецепторных систем, реализующих апоптогенный сигнал внеклеточного воздействия. B исследовании [143] п оказано, что сфинголипиды индуцируют апоптоз, тогда как фосфолипиды и полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) препятствуют реализации программы гибели клетки, выступая в роли факторов роста . Вместе с тем, ПНЖК, как потенциальные субстраты перекисного окисления липидов , в определенных условиях (окислительный стресс) могут оказывать апоптоз-индуцирующее действие. Некоторые классы липидов оказывают влияние на экспрессию генов апоптоза (АРОE, АРОС3, LPL, PON1 и MTHFR), непосредственно взаимодействуя с факторами транскрипции (NF-B, HNF4, PPAR, и SREBP1) [147, 148], или действуя опосредованно, путем изменения генерации вторичных липидных мессенджеров (церамида, сфингозина и др.).
Углеводы не оказывают прямого действия на изменение активности апоптоза, однако, их избыточное или недостаточное поступление с рационом, как и нарушения углеводного обмена, способствуют развитию патологических состояний, провоцирующих сбой механизмов гибели клеток [109].
Влияние ви таминов и микроэлементов на регуляцию апоптоза в большинстве случаев зависит от их антиоксидантных/прооксидантных свойств. Так, токоферол, ретинол и аскорбиновая кислота оказывают антиоксидантное действие за счет способности инактивировать кислородные метаболиты, ограничивая их накопление и повреждающее действие. Следовательно, при дефиците этих витаминов, возрастает вероятность инициации кислород-зависимых типов апоптоза. Кроме того, по данным [82], аскорбиновая кислота участвует в регуляции синтеза белка p53 и процессах репарации генетического материала клетки.
Одним из механизмов влияния эргокальциферола на апоптоз является активация специфических Bcl-2-подобных белков апоптоза (Bak, Bax и др.), а также непосредственное участие в синтезе необходимых для апоптоза цитокинов. Пиридоксин, цианокобаламин и фолиевая кислота участвуют в обеспечении защиты митохондриального генома, а также участвуют в нейтрализации клеточного токсического эффекта ряда ксенобиотиков . В исследованиях [95] показана способность цианкобаламина к снижению активности апоптоза , вызванного кортикостероидами, в период эмбрионального развития . Пантотеновая кислота оказывает мембраностабилизирующий эффект, участвует в процессах окисления и ацетилирования липидов и углеводов , в синтезе ацетилхолина, стимулирует образование кортикостероидов в коре надпочечников, входит в состав кофермента А. Недостаток пантотеновой кислоты в организме приводит к нарушению обмена веществ, что также может являться одним из факторов запуска апоптоза.
Одной из основных функций микроэлементов в программируемой гибели клетки является их участие в качестве ко -факторов или катализаторов ферментов свободно-радикального окисления . Натрий (Na+) играет весьма важную роль в регуляции водного обмена , его выведение из клеток ос уществляется Na+/K+-АТФазой, которая является мишенью активных форм кислорода (АФК), поэтому повышение уровня АФК приводит к обратимому ингибированию данного фермента [60]. Кроме того, АФК являются причиной поражения мембран клеток и нарушения их проницаемости, что , в свою очередь , приводит к накоплению кальция (Са2+) и магния (Mg2+) в клетке [68]. Увеличение концентрации Са2+ и Mg2+ в цитоплазме ведет к активации Са 2+/Mg2+-зависимой эндонуклеазы, Са2+-зависимой трансглутаминазы, вызывает повышение активности клеточных протеиназ, что также может стать причиной активации апоптоза [18, 60].
Калий (K+) – основной внутриклеточный катион, важнейшая биологическая роль которого заключается в поддержании трансмембранного потенциала . Нормальный потенциал мембраны или ее гиперполяризация обеспечивают пролиферативную активность клетки, тогда как деполяризация мембраны служит обязательным условием реализации апоптоза . Известно, что церамид (медиатор липидного пути апоптоза) способствует инактивации К+-каналов, накоплению ионов калия в клетке и деполяризации мембраны [96].
Медь (Cu2+), цинк (Zn2+) и марганец (Mn2+), являясь компонентами активного центра медь-цинковой (Cu,Zn)- и марганец (Mn)- зависимой супероксиддисмутазы (СОД), принимают участие в торможении свободнорадикального оксиления и эндонуклеазной активности. Кроме того, Cu,Zn-СОД стабилизирует спиральную структуру ДНК , блокирует транскрипционные факторы Fas, с-myc, и стимулирует ген bcl-2, способствуя торможению эндонуклеаз и предупреждению апоптоза [78]. Железо (Fe3+) – важный эссенциальный микроэлемент , катализирующий реакции, в которых генерируются АФК (например, реакция Фентона и реакция Осипова), вызывающие повреждениz хромосом, накопление белка p53, и , как следствие, инициацию апоптоза [69]. Алюминий (Al3+) принимает участие в построении эпителиальной и соединительной тканей, участвует в процессе регенерации костной ткани, влияет на реакционную способность пищеварительных ферментов. Увеличение концентрации ионов Al3+ в клетках служит причиной выраженной интоксикации и нарушения процессов внутриклеточного обмена. Высокая способность к образованию токсичных комплексных соединений обусловливает роль Al3+ в снижении активности внутриклеточных ферментных систем, что приводит к гибели клетки [86]. Большинство из наиболее изученных к настоящему времени токсических факторов оказывает влияние на молекулярные механизмы регуляции апоптоза [113]. Процесс программируемой гибели клетки может быть инициирован в результате прямого или опосредованного повреждающего действия в зависимости от свойств, дозы и времени экспозиции токсического агента [113, 122]. Впервые влияние токсических факторов на изменение активности апоптоза было продемонстрированно на модели гибели тимоцитов и лимфоцитов под действием глюкокортикоидов. Впоследствии было установлено, что 2,3,7,8-тетрахлородибензо-п-диоксин также вызывает апоптоз тимоцитов [90, 113, 158, 159].
В последние годы широкое распространение получила гипотеза активации апоптоза в условиях умеренных токсических воздействий, недостаточных для развития некроза. Действительно, на примере действия оксида мышьяка (As2O3) и 2,3-диметокси-1,4-нафтохинона на клетки поджелудочной железы, а также четыреххлористого углерода (ССl4) – на клетки печени, было показало, что низкие дозы этих веществ инициируют апоптоз, тогда как более высокие дозы приводят к некрозу. Аналогичные результаты были получены в исследованиях целого ряда других соединений : микотоксинов (фумонизины, охратоксин А), а нтибиотиков (циклогексимид, гигромицин и др.), солей тяжелых металлов (хлорид ртути, сульфат кадмия и др.) – изучено действие на клетки печени и почек; некоторых соединений свинца – на нейроны, астроциты и фоторецепторы сетчатки глаза; Т-2 токсина и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты – на клетки тимуса и селезенки; катехоламинов – на кардиальные и скелетные миоциты [113].
Современные методические подходы к исследованию активности апоптоза
Основными критериями, характерными для апоптоза, являются: функционально – необратимое прекращение жизнедеятельности клетки; морфологически – потеря микроворсинок и межклеточных контактов, конденсация хроматина, уменьшение объема клетки, ее фрагментация и образование апоптозных телец; биохимиче ски – гидролиз белков цитоплазмы и межнуклеосомный распад ДНК; генетически – структурно-функциональная перестройка генетического аппарата клетки [16, 90]. В настоящее время в научных исследованиях используются следующие основные методы определения активности апоптоза: 1. Биохимические методы определения степени фрагментации ДНК и активности каспаз. 2. Микроскопические методы регистрации морфологических изменений в клетке. 3. Методы проточной цитофлюориметрии выявления числа апоптотических клеток. Биохимические методы исследования активности апоптоза
Метод ДНК-комет («DNA-comet assay»), впервые описанный Ostling и Johansson в 1984 г . [114], является быстрым и весьма чувствительным методом регистрации повреждений ДНК и изучения репарации ДНК на уровне одиночных клеток. Усовершенствования и модификации метода ДНК-комет позволили значительно повысить его чувствительность и расширить сферу применения, однако практически не затронули основные принципы, положенные в его основу [133].
Метод ДНК-комет постепенно становится неотъемлемой частью программ по биомониторингу — оценке влияния пищевого рациона , факторов внешней среды, изменений метаболизма и физиологического состояния, старения организма на накопление и репарацию повреждений ДНК; по изучению механизмов радиопротекторных воздействий, формирования радиоадаптивного ответа ; исследований по экологии. В настоящее время метод широко используется в исследованиях генотоксичности фармацевтических препаратов и промышленных химических веществ, репарации ДНК, апоптоза [34].
Известно, что в клетках, гибнущих по механизму апоптоза, ДНК, как правило, претерпевает межнуклеосомную деградацию, являющуюся характерным маркером процесса. Апоптотические клетки имеют вид слабо флуоресцирующих «ДНК-комет» с широким диффузным «хвостом» и практически отсутствующей «головой». Использование метода ДНК -комет для регистрации апоптотических клеток в популяциях особенно актуально в случае, когда доступным является только небольшое количество образца. С помощью метода ДНК-комет удается получать информацию не только о содержании ДНК в апоптотических клетках , но и о размерах фрагментов ДНК, вышедших из клетки при действии электрического поля [11].
Возможности метода ДНК -комет, его преимущества и недостатки наиболее наглядно продемонстрированы в работе по исследованию генотоксичности 208
химических соединений , выбранных из различных групп канцерогенных веществ. Тестирование проводилось на мышах (в 8 органах) и продемонстрировало преимущества этого метода, в первую очередь связанные с возможностью определять повреждения ДНК и активность апоптоза в любом органе, независимо от степени митотической активности в нем. Результаты исследования показали, что метод обладает наибольшей эффективностью при определении фрагментации молекул ДНК как вследствие однонитевых разрывов индуцированных химическими веществами, так и образующихся из щелочелабильных сайтов ДНК, что в свою очередь является характерным признаком необратимой фазы апоптоза [34].
Важным аспектом в исследованиях генотоксичности и канцерогенности химических соединений является их причастность к формированию радикальных форм кислорода и азота, которые могут инициировать канцерогенез благодаря своей способности реагировать с ДНК, вызывая мутации. Так, в ряде экспериментов показано, что оксид азота (NO) и е го производные могут содействовать процессу канцерогенеза. Генотоксичность NO определяется как его концентрацией, так и механизмами попадания в организм. NO и его реактивный радикал пероксинитрит (ONOO-) индуцируют однонитевые разрывы ДНК, вызывают как процессы репарации ДНК, так и гибели, путем некроза или апоптоза. Кроме того, ускорение апоптоза в клетках является прямым ответом на проникновение NO. Метод ДНК-комет позволяет определять мутагенное действие экзогенного NO. Количество повреждений ДНК росло п ропорционально увеличению концентрации NO, как в нормальных клетках, так и в клетках аденокарценомы легкого. Такие исследования подтверждают, что метод ДНК-комет является надежным методом для оценки генотоксичностии и изменения активности апоптоза при дейс твии различных химиопрепаратов in vitro . Использование метода ДНК -комет позволяет учитывать гетерогенность сложных популяций, изучать выход повреждений ДНК и репарацию практически в любых эукариотических клетках . В ряде работ было показано , что использова ние метода ДНК-комет оказывается полезным для разделения субпопуляций апоптотических клеток и клеток на ранних стадиях некроза. При некрозе нарушение целостности клеточных мембран предшествует деградации ДНК, а при апоптозе деградация ДНК развивается раньш е процесса разрушения клеточной мембраны. Поэтому метод ДНК-комет не менее информативен, чем другие методы, основанные на оценке степени деградации ДНК, такие как проточная цитометрия [34, 133]. Колориметрический и флуориметрический метод определения активности каспаз Определение активности каспаз биохимическим методом основан на использовании в качестве субстрата каспазы-3 синтетического пептида DEVD (Asp-Glu-Val-Asp). Для флуориметрического метода используется DEVD-AFC субстрат, для колориметрическог о метода – DEVD-pNA субстрат . Два метода определения активности каспазы-3 в целом демонстрируют сопоставимые результаты [87, 116].
Так в работе [116] с использованием колориметрического метода, было установлено снижение активности каспазы -3 в гепатоцитах мышей линии 129S6, подвергавшихся длительному воздействию этанола при включении в их рацион сульфата цинка. В другом исследовании [87] определяли активность каспазы-3 после моделирования артериальной гипертензии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что хроническая перегрузка левого желудочка сердца , вызванная вазоренальной артериальной гипертензией , усиливает апоптотическую гибель клеток миокарда в правом желудочке. Таким образом, определение активности каспазы-3 позволяет установить сам факт а поптоза и его интенсивность. Помимо применения биохимического исследования, целесообразно использование других методов определения апоптоза, однако преимуществом биохимического метода является возможность определения путей инициации клеточной гибели [116]. Также следует отметить, что биохимический метод определения активности каспазы-3 может быть эффективно использован при исследовании неапоптотических функций данного фермента в организме. Так появляются свидетельства того , что каспаза-3 может выполнять р яд важных функций в организме. В частности, в нейронах каспаза-3 принимает участие в нейропротекции при ишемическом прекондиционировании. Каспаза-3 быстро активируется в ограниченных внутриклеточных компартментах при формировании конусов роста клеток сетчатки и необходима для установления правильных нейрональных связей. Можно предположить, что каспаза-3 не только необходима для реализации большинства сценариев апоптоза , но и принципиально важна для реализации важнейших неапоптотических процессов. Использование данного метода позволяет продемонстрировать плейотропность каспазы-3 и понять адаптивные преимущества такой плейотропности для клетки и целого организма [23].
Микроскопические методы определения апоптоза Все микроскопические методы морфологической идентификации апоптоза можно подразделить на следующие группы: 1) рутинное свето-микроскопическое исследование; 2) флуоресцентно-микроскопическое исследование; 3) электронно-микроскопическое исследование; 4) выявление олигонуклеосомной деградации ДНК in situ; 5) иммуногистохимическое выявление белков апоптоза. Наиболее доступным и простым методом выявления апоптических клеток и изучения их морфологических особенностей служит световая микроскопия гистологических препаратов . Для этого используют тонкослойные срезы, окрашенные азуром А (для идентификации формы хроматина) или гематоксилином и эозином (для выявления структур цитоплазмы). Результаты микроскопических исследований свидетельствуют о конденсации цитоплазмы и ядерного материала в клетках после индукции апоптоза in vitro. Критериями отличия апоптоза от некроза выступают распад клеток на фрагменты , содержащие гранулярные отмешивания красителя и не имеющие диффузного прокрашивания цитоплазмы. Так , при апоптозе мембранные структуры клеток остаются неповрежденными, что препятствует распространению красителя в цитозоле. Низкая эффективность данного метода связана , с одной стороны, с незначительной длительностью специфичной для апоптоза стадии фрагментации клеток (всего 1—1,5 ч [90]), а с другой стороны, с трудностями изучен ия в данных условиях морфологии погибающих клеток и апоптотических телец [16].
Биохимический метод определения активности каспазы
Эксперимент 2. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия CCl4. В данной серии исследований на модели токсического действия низких доз тетрахлорметана (CCl4) определены наиболее чувствительные методы оценки активности апоптоза. Эксперимент проведен на 70 половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 312,4±10,8 г . Животные были разделены на 3 группы: Первой опытной группе (исходно – 30 крыс) внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в дозе 0,08 мг на кг массы тела, второй опытной группе (исходно – 30 крыс ) внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в дозе 0,48 мг на кг массы тела . Контрольной группе животных (исходно – 10 крыс) вводили равный объем жидкого парафина. Эвтаназию животных первой и второй опытных групп проводили через 6, 12 и 24 часов после введения раствора . Животных контрольной группы подвергали эвтаназии через 24 часа после введения раствора. После выведения животных из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов (печень, почки , тимус , мозг, костный мозг). Активность апотоза определяли биохимическим методом (определение активности каспазы -3), иммуногистохимическим методом (определение белков апоптоза p53, Bax, Bcl-2) методом ДНК-комет (определение степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза).
Эксперимент 3. Оценка чувствительности различных методов определения активности апоптоза при внутрибрюшинном введении низких и минимально действующих доз CCl4 лабораторным животным. Эксперимент проведен на 40 половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 304,0±8,3 г. Животные были разделены на 3 опытные и 1 контрольную группу по 10 животных в каждой из них. 3 опытным группам животных внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в дозе 0,04. 0,02 и 0,01 мг на кг массы тела соответвенно. Контрольной группе животных вводили равный объем жидкого парафина. Животных всех группы подвергали эвтаназии через 24 часа после введения раствора. При выведении животных из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов (печень, почки , тимус , мозг, костный мозг). Активность апотоза определяли биохимическим методом (определение активности каспазы-3), иммуногистохимическим методом (определение белков апоптоза p53, Bax, Bcl-2) методом ДНК-комет (определение степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза).
Эксперимент 4. Оценка чувствительности различных органов лабораторных животных к действию низких и минимально действующих доз CCl4 Эксперимент проведен на 30 половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 289,5±7,9 г . Животные были разделены на 2 опытные и 1 контрольную группу по 10 животных в каждой из них. Первой опытной группе внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в дозе 0,08 мг на кг массы тела, второй опытной группе внутрибрюшинно вводили раствор CCl4 в жидком парафине в минимально действующей дозе 0,04 мг на кг массы тела. Контрольной группе животных вводили равный объем жидкого парафина. Животных всех группы подвергали эвтаназии через 24 часа после введения раствора. При выведении животных из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов (печень, почки, тиму с, мозг, костный мозг, селезенка, семенники, тонкая и толстая кишка). Активность апотоза определяли методом ДНК-комет по степени фрагментации ДНК и индексу апоптоза. Эксперимент 5. Изучение влияния дефицита пантотеновой кислоты на активность апоптоза в органах крыс на модели сочетанного действия CCl4 и витаминной недостаточности. Эксперимент длительностью 30 дней проведен на 30 половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 325,0±11,3 г. Животные были разделены на 2 опытные и 1 контрольную группу по 10 животных в каждой из них. Животные первой и второй опытной группы получали полусинтетический казеиновый рацион дефицитный по пантотеновой кислоте, животные конторольной группы получали полноценный рацион. Второй опытной группе за 24 часа до эвтаназии вводили раствор ССІ4 в жидком парафине в дозе 0,08 мг на кг массы тела. При выведении животных из эксперимента у них отбирали для исследовний образцы внутренних оранов (печень, почки, тимус, мозг, костный мозг, селезенка, семенники, тонкая и толстая кишка). Активность апотоза определяли методом ДНК-комет по степени фрагментации ДНК.
Эксперимент 6 1. Влияние фитостероидов на изменение активности апоптоза в норме. Исследование, продолжительностью 30 дней проводили на 24 половозрелых крысах-самцах линии Вистар полученных из питомника «Столбовая». После семидневного карантина животные были взвешены и разделены на 3 группы, по 8 животных в каждой из них. Средние значения исходной массы тела животных контрольной группы, опытной группы №1 и опытной группы №2 достоверно не различались и составляли 111,0±2,1 и 109,0±1,7 соответственно. Все животные содержались в отдельных клетках и получали стандартный общевиварный рацион (ОВР). Животным опытных групп №1 и №2 ежедневно в воду добавляли экстракт из листьев Серпухи Венценосной (Serrafula coronata) из расчета 5,0 и 15,0 мг фитостероидов (20 гидроксиэкдизона (20Е) и 258-инокостерона) на кг массы тела соответственно. Контроль выпитой жидкости проводили ежедневно. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента питьевую воду. На 30 сутки животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. У животных отбирали для исследований образцы внутренних органов (тимус, мозг, сердце). Активность апоптоза определяли методом ДНК-комет по степени фрагментации ДНК и индексу апоптоза.
1 Выполнено совместно с научным сотрудником лаборатории физиологии и биохимии пищеварения Сидоровой Ю.С. Эксперимент 71. Влияние фтостероидов на изменение активности апоптоза после стрессорного воздействия электрическим током. Исследование, длительностью 30 дней проводили на 16 половозрелых крысах-самцах линии Вистар. После семидневного карантина животные были взвешены и разделены на 2 группы, по 8 животных в каждой из них. Средние значения исходной массы тела животных контрольной и опытной группы достоверно не различались и составляли 111,0±2,1 и 109,8±1,8 г соответственно. Животные содержались в отдельных клетках и получали стандартный общевиварный рацион (ОВР). Животным опытной группы ежедневно в воду добавляли экстракт из листьев Серпухи Венценосной (Serrafula coronata) из расчета 2 мг фитостероидов (20 гидроксиэкдизона (20Е) и 25 S-инокостерона) на кг массы тела соответственно. Контроль выпитой жидкости проводили ежедневно. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента питьевую воду.
В последний день эксперимента крыс обеих групп подвергали стрессорному воздействию. Их помещали в светлый отсек специальной камеры камеры спиной к темному отсеку (стартовое положение). Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 секунд). Затем крысу переводили в жилую клетку Для определения активности апотоза методом ДНК-комет по степени фрагментации ДНК и индексу апотоза отбирали образцы внутренних органов: тимус, мозг, сердце.
Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия адренокортикотропного гормона
Изучены изменения показателей апоптоза через 6, 12, 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 4 и 75 МЕ/кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были изучены показатели, характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза – содержание белков Bcl-2, Bax и p53, завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза – активность каспазы-3, а также этап деструкции – уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза. После введения АКТГ у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось каких-либо патологических проявлений. На вскрытии также не было выявлено каких -либо макроскопических изменений внутренних органов , массы внутренних органов крыс контрольной и опытных групп не имели статистически значимых различий на всех сроках отбора материала (табл. 10). Результаты исследований уровня апоптоза в тканях и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 4 и 75 МЕ/кг представлены в табл. 11-13. Как видно из табл. 11, после введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг, содержание белков Bcl-2, Bax и p53 в печени крыс опытной группы не отличалось от контрольных значений на всех сроках отбора материала. Через 24 часа после введения АКТГ в доз е 75 МЕ/кг отмечено повышение содержания белка Bcl-2 на 61% (p 0,05) по сравнению с контрольным уровнем, содержание данного белка через 6 и 12 часов не имело различий с контролем. Содержание белков Bax и p53 не отличалось от контрольных величин на всех сроках отбора материала. Таблица 10
Как видно из табл. 13-14, характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тканях крыс после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг в целом соответствовал характеру изменений активности каспазы-3 (табл. 11): достоверное повышение уровня фрагментации ДНК отмечено в почках (через 12 часов - на 11%, через 24 часа - на 13%) и тимусе (через 12 часов - на 8%, через 24 часа - на 12%); достоверное повышение индекса апоптоза отмечено в почках (через 12 часов - на 46%, через 24 часа - на 38%) и тимусе (через 12 часов - на 28%, через 24 часа - на 27%). Изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в печени, головном мозге и костном мозге крыс не выявлено.
Характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тканях крыс после введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг несколько отличался от изменений активности каспазы-3: остоверное озрастание ровня рагментации ДНК отмечено в почках (на 12%) через 24 часа после введения АКТГ, индекса апоптоза на 35%, тогда как изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе не выявлено на всех сроках отбора материала. Также не наблюдалось изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в печени, головном мозге и костном мозге крыс на протяжении всего периода исследований. Известно, что адренокортикотропный гормон (АКТГ), оказывает стимулирующее действие на кору надпочечников. В большей степени его влияние выражено пучковую зону, о иводит увеличению разования глюкокортикоидов. Так, в работах Kerr и Willey, 1969-1972, посвященных изучению механизма гибели клетки путем апоптоза было показано значительное увеличение числа апоптотических клеток в тимоцитах при экзогенном введении АКТГ. В исследованиях [79] показано, то АКТГ-индуцированный апоптоз имоцитов сопровождается увеличением уровня проапоптозного белка Вах; АКТГ также способен увеличивать уровень мРНК некоторых каспаз, в том числе и каспазы-3 [57], однако в данном случае механизм индукции экспрессии генов неясен.
Моделирование токсического воздействия в эксперименте путем внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг массы тела приводит к увеличению активности апоптоза в тимусе и почках крыс, при этом динамика изменений активности каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе имеет сходный характер: значения этих показателей возрастают постепенно, достигая максимума через 24 часа после введения АКТГ. Определение содержание белков Bcl-2, Bax и p53 не выявили какой-либо динамики: на всех сроках отбора проб содержание белков Bax и p53 оставалось в пределах контрольных значений, некоторое повышение содержания белка Bcl-2 через 24 часа после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг не позволяет расценивать этот факт, как свидетельство усиления процессов апоптоза: поскольку реализация апоптоза – комплексное явление, только комплексная реакция всех рассмотренных ключевых белков эффекторного эта па может быть принята как доказательство активации апоптоза.
Введение АКТГ в дозе 4 МЕ/кг массы тела через 24 часа приводит к повышению активности каспазы-3 в тимусе крыс и повышению уровня фрагментации ДНК и апоптозного индекса в почках крыс. Поскольку реакция изученных показателей на введение 4 МЕ/кг находилась на грани диагностического порога и практически не отличалась от фонового уровня апоптоза, такая доза АКТГ не является предпочтительным индуктором апоптоза для постановки модельных экспериментов. На основании полученных данных можно сделать вывод, что показатели, характеризующие завершающие этапы апоптоза, достигают максимальных значений через 24 часа, поэтому оптимальное время отбора образцов ткани для исследований данных показателей составляет 24 часа после однократного воздействия, при этом чувствительность изученных показателей снижается в ряду индекс апоптоза уровень фрагментации ДНК активность каспазы.
