Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современные првдставленйя о биохимии воспалительных и репаративбых реакций (обзор литературы) 8
1.1. Биохимические аспекты структуры и функций соединительной ткани 8
1.2. Биохимические свойства репаративной функции соединительной ткани 19
1.3. Биохимические изменения в организме при локальных Холодовых воздействиях 24
ГЛАВА 2. Материалы и методы 28
2.1. Характеристика групп животных, методика воспроизведения Холодовых поражений, получение материалов и подготовка их к анализу 28
2.2. Методы изучения белков и.гидролазной активности ферментов 30
2.3. Методы анализа углеводов гликопротеинов и протеогликанов 36
2.4. Методы иммунохимического анализа белков.плазмы крови 40
ГЛАВА 3. Коллагеновые белки и активность февдвнтов кожи, крови и мочи кроликов при локальных холодовых воздействиях 46
3.1. Влияние холодового повреждения на коллагеновые белки кожи кроликов 46
3.2. Гидролазная активность ферментов кожи и сыворотки крови кроликов при поражении холодом 48
3.3. Динамика оксинролинсодержащих компонентов в плазме крови и моче кроликов при локальных холодових воздействиях различной степени тяжести 51
ГЛАВА 4. Влияние локальных холодовых воздействий на углеводные компоненты глжопротеинов и протеогликанов кожи, крови и мочи кроликов 59
4.1. Гликопротеины, протеогликаны и активность гиалуронидазы кожи кроликов при холодовом поражении 59
4.2. Динамика глицидных компонентов гликопротеинов и гликозаминогликанов в плазме крови и моче кроликов при Холодовых воздействиях различной степени тяжести . 64
ГЛАВА 5. Распределение белков плаэш крови в коже, крови и моче кроликов при поражении холодом 73
5.1. Действие локального холодового воздействия на концентрации белков в плазме крови кроликов 73
5.2. Проницаемость кожи кроликов для белков плазмы крови при локальном холодовом воздействии 77
5.3. Выделение белков плазмы крови с мочой при локальном холодовом воздействии .81
Обсуждение 87
Рекомендаций в практику 110
Выводы 111
Указатель литературы 112
- Биохимические аспекты структуры и функций соединительной ткани
- Методы изучения белков и.гидролазной активности ферментов
- Гидролазная активность ферментов кожи и сыворотки крови кроликов при поражении холодом
- Гликопротеины, протеогликаны и активность гиалуронидазы кожи кроликов при холодовом поражении
Введение к работе
В настоящее время освоение северных районов земного шара приняло широкие масштабы, поэтому проблема жизнеобеспечения живых организмов в условиях холодного климата приобрела особую актуальность. Однако, действие холода на одноклеточные и многоклеточные организмы, отличающееся многообразием форм, еще относительно мало изучено.
Холодовые поражения вызывают развитие воспалительных и ре-паративных реакций, которые направлены на устранение повреждений (Т.Я. Арьев, 1971; Г.Н. Клинцевич, 1973; Ю.С. Винник, и соавт., 1978; Р.И. Муразян, СВ. Смирнов, 1982; ttu к х , 1965; П&тВег , 1982 и другие). Эти реакции являются типичным проявлением репаративной функции соединительной ткани, но ее биохимические аспекты при локальных Холодовых воздействиях остаются практически неизученными. Сравнительные исследования биосинтеза коллагена при различных видах повреждений кожи позволили установить, что холодовые поражения отличаются от других травм медленными темпами восстановительных процессов ( &. и соавт., 1980; aCl , ftooty» 1981). Можно полагать, что это явление свойственно всем звеньям метаболизма соединительной ткани в условиях Холодовых воздействий, но для решения этой проблемы необходимо проведение соответствующих биохимических исследований.
Повреждение кожи действием холода вызывает гибель клеток соединительной ткани и разрушение межклеточного вещества, а также накопление крови за счет эксудации (М.М. Ковалев и соавт., 1964; Ю.И. Исаеви соавт., 1977; Б.С. Вихриев, В.М. Бурмистров, 1980; jC&U) is , 1952). Однако, гидролазная активность ферментов и проницаемость кожи для белков плазмы крови в этих случаях не изучались.
Локальные холодовые поражения, несмотря на относительно небольшие масштабы повреждений, вызывают существенные изменения в организме. Для них свойственны нарушения кровообращения, явления гиперкоагуляции крови, токсемия и протеинурия (Т.Я. Арьев, 1940; М.П. Вжлянский и соавт., 1973; Б.С. Бихриев и соавт., 1982; Ю.М. Щтыхно и соавт., 1983; jC&uSlx , 1951; tLi/tAet, 1956; /Jejyieei , 1982 и другие). Эти нарушения связывают с выделением продуктов распада тканей в систему кровообращения, поэтому изучение метаболитов соединительной ткани в составе крови и мочи при Холодовых травмах является актуальной проблемой.
Локальные холодовые воздействия являются многофакторным процессом, что порождает многообразные формы повреждений (Т.Я. Арьев, 1966; Г.А. Орлов, 1978; Н.С. Пушкарь, A.M. Белоус, 1975; Л.К. Лозина-Лозинский, 1982; еСеїЛіз ,.1952; /ииСАа. , 1965; ScLmnei и соавт., 1970; /Тё/т? •&., 1982 и другие). Следовательно, при изучении вопросов биохимии репаративных реакций, вызванных действием холода, необходимо учитывать степень тяжести повреждений.
Целью работы было изучение локальных Холодовых воздействий на гликопротеины и гидролазную активность ферментов кожи, крови и мочи кроликов.
В задачи работы входило:
1. Изучить концентрации и состав коллагеновых белков, гликопротеинов и протеогликанов кожи кроликов при холодовом воздействии;
2. Установить динамику изучаемых показателей в крови и моче кроликов при локальных Холодовых воздействиях различной степени тяжести;
3. Исследовать влияние холода на гидролазную активность ферментов в коже и крови кроликов;
4. Оценить проницаемость кожи кроликов, поврежденной холодом, для белков плазмы крови;
5. Определить действие холодового, повреждения на выделение белков плазмы крови с мочой.
Научная новизна полученных результатов определяется прежде всего тем, что впервые изучены биохимические изменения при воспалительных и репаративных реакциях, вызванных локальными Холодовыми воздействиями. Показано, что холодовое поражение активирует гидролазную активность ферментов и повышает проницаемость кожи для белков плазмы крови. Активация репаративных реакций ингибирует активность протеолитических ферментов и стимулирует биосинтез межклеточного вещества соединительной ткани. Впервые установлено, что на каждой из стадий репаратив-ного процесса доминирует биосинтез определенных макромолекул соединительной ткани. Доказано, что локальное повреждение кожи -і холодом вызывает выброс продуктов распада из очага поражения в систему кровообращения и с мочой, а также активирует биосинтез гликопротеинов, входящих в состав плазмы крови. Показано, что холодовое поражение кожи повышает экскрецию с мочой продуктов катаболизма соединительной ткани и белков плазмы крови. Впервые обнаружен феномен несоответствия степени тяжести холодового поражения и выделения продуктов распада тканей в кровь и мочу. При поражении кожи концентрация соединительнотканных компонентов в крови и моче достигает максимума, тогда как при гангрене конечностей практически не отличается от нормы.
Практическая ценность работы вытекает из вышеуказанных элементов научной новизны. Биохимические свойства воспалительных и репаративных реакций при локальных Холодовых воздействиях могут быть использованы для профилактики, диагностики и лечения Холодовых поражений в области медицины и ветиринарии. Разработанный комплекс методов может применяться для изучения метаболизма соединительной ткани при различных видах репаративных реакций. Модификации методов количественного иммуноэлектрофоре-за, изложенные в работе, могут использоваться как в научных исследованиях, так и в работе клинических лабораторий.
В соответствии с полученными результатами на защиту выносятся следующие положения:
- Локальное холодовое воздействие стимулирует гидролазную активность ферментов и вызывает снижение концентраций специфических компонентов соединительной ткани кожи кроликов;
- Репаративные реакции после холодового поражения кожи кроликов угнетают гидролазную активность ферментов и стимулируют биосинтез белков соединительной ткани;
- Холодовое повреждение кожи кроликов повышает ее проницаемость для белков плазмы крови;
- Локальное холодовое воздействие стамулирует.биосинтез_ гликопротеинов плазмы крови и выделение их с мочой;
- При некрозе кожи, вызванном действием холода, биохимические изменения в составе крови и мочи более выражены, чем при гангрене конечностей.
Биохимические аспекты структуры и функций соединительной ткани
Соединительная ткань занимает в организме человека и животных особое место, поскольку составляет около 50$ массы тела. В ее систему объединяют весьма различные по строению и функциям ткани, не говоря уже о значительной степени полиморфизма клеток, входящих в их состав. Среди них выделяют три основных типа клеточных элементов: фибробласты и их разновидности в специализированных тканях, макрофаги (гистиоциты) и тучные клетки (лаброциты). другие клетки, имеющие гематогенное происхождение, проникают в соединительную ткань преимущественно при патологических процессах (Л.И. Слуцкий, 1969; В.В. Серов, А.Б. Шехтер, 1981; %еKitting , 1968; Яору , 1975).
Важным отличием соединительной ткани является значительное преобладание межклеточного вещества над клеточными элементами. Межклеточное вещество представлено волокнистыми структурами и основным веществом, окружающим клетки и волокна. Волокна состоят из надмолекулярных комплексов коллагена и эластина со стабилизирующими макромолекулами - структурными глико-протеинами и протеогликанами. В основном веществе преобладают гликопротеины и протеогликаны, а также присутствуют белки плазмы крови (Б.Б. Фукс, Б.И. Фукс, 1968; В.Н. Никитин и соавт., 1977; Mcvthtufis, 1977).
Сложность морфологической структуры и химического состава позволяют соединительной ткани выполнять многие функции, среди которых Л.И. Слуцкий (1969) выделяет следующие: - опорную (каркасную) функцию, благодаря которой осуществляется "связывание" и "поддержание" организма; - барьерную функцию, обеспечивающую защиту от внешней среды и регуляцию биотранспорта; - функцию депонирования, регулирующую накопление инород-них и запасаемых веществ в специализированных клетках; - метаболическую (трофическую) функцию, обеспечивающую помимо обычных обменных реакций биосинтез молекул межклеточного вещества, метаболизма липидов и других соединений; - репаративную функцию, направленную на устранение повреждений и инфекционных очагов. В.В. Серов и А.Б. Шехтер (1981) выделяют также структуро-образовательную функцию, которая позволяет осуществлять слож -ІО нне процессы реіуляции дифференпировки друтих тканей. В осуществлении этих функций участвуют все клеточные и неклеточные элементы соединительной ткани. Поэтому, соединительная ткань представляет собой классический пример функциональной системы, где дефект одного из звеньев приводит к дискоординации всей системы (Д.А. Лебедев, 1979; А.Б. Шехтер, 1981; Яоп , 1975).
В метаболизме и выполнении основных функций соединительной ткани главная роль принадлежит клеточным элементам. Среди них основное значение имеют фибробласты. Вопрос о происхождении их до сих пор не решен, хотя известно, что они трансформируются из мезенхимальных предшественников. В зависимости от степени дифференпировки В.В. Серов и А.Б. Шехтер (1981) рекомендуют различать: малодифференцированные, юные и зрелые фибробласты, миофибробласты и фиброциты. Первые их этапы дифференцировки начинаются с трансформации малодифференцированных клеток в по-липотентные юные фибробласты, которые превращаются в зрелые фибробласты, фиброкласты и миофибробласты. Все эти клетки либо разрушаются при старении, либо переходят в неактивные фиброциты.
Каждая из популяций фибробластов характеризуется определенными ультраструктурными признаками, соответствующими основным функциям: малодифференцированные фибробласты - размножение; юные фибробласты - размножение, миграция и синтез глико-протеинов, протеогликанов и коллагена; зрелые фибробласты -продукция коллагена; фиброкласты - резорбция коллагена; миофибробласты - контракция; фиброциты - регуляция метаболизма и механической стабильности соединительной ткани.
Второй популяцией клеток соединительной ткани являются макрофаги. Их предшественниками являются моноциты крови, но функции, выполняемые макрофагами в составе соединительной ткани, позволяют отнести их к специфическим клеткагл этой ткани. Мм принадлежит главная роль в реализации защитной функции и большое значение в обменных процессах. Защитная функция макрофагов реализуется как через участие в естественном иммунитете, так и при кооперации с иммунокомпетентными клетками. Макрофаги как секреторные клетки играют важную роль в процессах пролиферации и дифференцировки других клеток (Б.П. Казначеев, Д.И. Маянс-кий, 1978; А.И. Струков, 1981; Р.В. Петров, 1982; Д.Н. Маян-ский, 1982 и другие).
Третьей группой специфических клеток соединительной ткани являются тучные клетки (лаброциты). Вопрос об их происхождении пока не решен, но известно, что обновление их популяций происходит за счет клеток-предшественников. В число предшественников лаброцитов включают лимфоциты, фибробласты и макрофаги. Функция этих клеток связана с биосинтезом и секрецией биологически активных веществ, особенно гепарина и гистамина. функции тучных клеток изучены еще недостаточно полно (В.В. Серов, А.Б. Шехтер, 1981; Р.В. Петров, 1982).
Клетки соединительной ткани осуществляют биосинтетические и катаболические процессы, а также регулируют свойства межклеточного вещества. Основным компонентом волокон межклеточного вещества является коллаген. Для его аминокислотного состава характерно преобладание глицина, пролина и оксипролина, а также наличие оксилизина. В настоящее время общепринята тропокол-лагеновая теория строения коллагеновых белков (6oirL$iei./i_t 1974; Яо%% , 1975; JlLCLbfvtufy 1977). Тропоколлаген представляет собой линейную макромолекулу длиной около 280 нм и диамет - 12 ром около 1,5 ни. Она состоит из трех полипептидных цепей, скрученных в своеобразную трехспиральную спираль, удерживаемую поперечными связями. Полипептидные цепи коллагена называются цепями. Известно 5 типов этих цепей, из которых формируются 4 типа тропоколлагеновых молекул (Soit iteL - , 1974; Ліагк » 1981; Ріп,иіІІ , 1982). Они синтезируются на гигантских полирибосомах фибробластов при участии специфической рибосомальной РНК. Коллаген типа I формируется из двух цепей и одной oL2 цепи. Коллаген типа П состоит из идентичных (Х1(П) цепей, коллаген типа Ш - из трех Я1(Ш), а коллаген типа ІУ - из трех І(ІУ) цепей.
Отделившиеся от рибосом молекулы коллагена имеют неспиральный характер и не содержат оксипролина и оксилизина. Эти аминокислоты гидроксилируются при помощи проколлагенгидрокси-лаз, после чего к оксилизину специфические трансферази присоединяют радикалы галактозы и глюкозы. Скручивание молекулы тропоколлагена происходит вследствие формирования дисульфидных связей в концевых пептидах. Эта транспортная форма коллагена (проколлаген) не способна к агрегации ( #10% , 1974; 3?2--le.4. % ?&$%t\ , 1978), Предполагается, что проколлаген секретируется из фибробластов либо через пластинчатый комплекс, либо путем разрыва цистерн эндоплазматического ретикулума (В.В. Виноградов, 1971; В.И. Мазуров, 1974; #Ws , 1974; ЛіоА-ке,и 2.» 1977). После секреции проколлагенпептидазы удаляют концевые пептиды и коллаген приобретает способность агрегировать {%сМ р , Рог t 1975; Яот\ , 1975).
Методы изучения белков и.гидролазной активности ферментов
При повреждении соединительной ткани наблюдается высвобождение различных медиаторов воспаления: гистамина, серото-нина, лимфокинов и монокинов, а также активации каликреинкини-новой системы. В результате повышается проницаемость сосудов и ингибируется биосинтез межішеточного вещества соединительной ткани. Это приводит к эксудации плазмы крови и образованию фибрина из фибриногена в очаге поражения под действием ткане--вых киназ. Это способствует отграничению очага некроза от организма и развитию в нем гипоксии. Она вызывает развитие ацидоза, что приводит к гибели клеток в зоне некроза. Разрушение клеток способствует высвобождению их содержимого, в том числе лизосомальных кислых гидролаз, которые разрушают мембраны клеток и межклеточное вещество (Б.Б. Фукс, Б.И. Фукс, 1968; Б.И. Шумаков и соавт., 1975; A.M. Чернух, 1979; А.И. Струков, 1981; Ночек, , 1968 и другие). Воспаление стимулирует миграцию в очаг нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов, которые окружают зону некроза и устраняют повреждение путем фагоцитоза, секреции протеолитических ферментов и специфических факторов иммунной системы (A.M. Чернух, 1979; В.В. Серов, А.Б. Шех-тер, 1981; Р.В. Петров, 1982).
Для резорбции межклеточного вещества необходимыми условиями являются денатурация его макромолекул, а также действие специфических или неспецифических гидролаз ( Ьйо Цпе 1967; S&h.LlLh.Q , 1968; $40М. » 1974). Темпы снижения концентраций различных макромолекул соединительной ткани при этом неодинаковы, что определяется их структурной.организацией. В первую очередь расщепляется основное вещество, затем - структурные гликопротеины и протеогликаны и лишь после этого коллаген и эластин. В условиях ацидоза основную роль в этом процессе играют неспецифические лизосомальные гидролазы. Кроме того, снижение концентраций специфических компонентов соединительной ткани связано и с накоплением в очаге белков плазмы крови (Л.И. Слуцкий, 1969; Е.А. Ефимов, 1975; Н-отк , 1963; Вг Мьу, 1969).
Повреждение тканей стимулирует развитие репаративных процессов как за счет действия продуктов распада на уцелевшие клетки, так и за счет секреции макрофагами, лимфоцитами, тромбоцитами, тучными клетками и фибробластами специфических мито-генных факторов (A.M. Хилькин и соавт., 1975; А.Б. Шехтер и соавт., 1977; O H tL и соавт., 1983). Пролиферирующие юные фибробласты секретируют гиалуронат и растворимые экстрацеллю-лярные гликопротеины, т.е. формируют новое основное вещество соединительной ткани ({Гигірк-у , Uolu/oO. , 1955; JiA CLotottn. и соавт., 1970; Ь&пЛс( , 1969). При этом синтезируется и коллаген, но образования волокон еще не происходит. Предполагается, что этому препятствует отсутствие активаторов фибрилло-генеза -. структурных гликопротеинов и сульфатированных ГАГ (В.И. Мазуров, 1974; jLLcLdde n, 1Ш\ Aede - , 1973). Поскольку активность нейтральных гидролаз остается еще высокой, новообразованный коллаген практически полностью резорбируется (Л.И. Слуцкий, Л.Э. Домбровска, 1972; О.Г. Оглоблина, 1984; «fu&uhcc ui% 1972; jUciiAeJs , 1977).
Следующим этапом пролиферативно-репаративных реакций является формирование грануляционной ткани. Биосинтетическая активность фибробластов в это время достигает максимальной интенсивности. Происходит активный синтез структурных гликопро-теинов и сульфатированных ГАГ, что способствует преобладанию аккумуляции коллагена в волокнах над процессами его расщепления. Некротический струп на поверхности раны начинает отторгаться; процессы метаболизма в нем отсутствуют (Т.Л. Заец, Т.А. Борисова, 1971; Т.Л. Заец и соавт., 1978; А.Б. Шехтер, Г.Н. Берченко, 1978; faculty , ІЇеІсшиЛ у- 1964; Са-ІаЛісьм І981 и другие).
Постепенно юные фибробласты трансформируются в зрелые фибробласты, фиброкласты и миофибробласты. Одновременно прогрессируют процессы фибриллогенеза. Первоначально рыхлые волокна уплотняются, а освободившееся пространство заполняется основным веществом. В процессах формирования коллагеновых волокон участвуют фиброкласты и макрофаги, которые устраняют избыток межклеточного вещества (А.Б. Шехтер, З.П. Милованова, 1975; &ь Мо , 1964; Я ОН- » 1975). Репаративная реакция завершается созреванием коллагеновых волокон и трансформацией фибробластов в фиброциты. Дефекты тканей восполняются рубцами соединительноЕканного происхождения.
Все вышеизложенное является сводной характеристикой биохимических изменений при различных видах пролиферативно-репа-ративных реакций, имеющих универсальный характер. Универсальность, т.е. строгая последовательность биохимических изменений в ходе репаративного процесса, независящая от свойств повреждающих факторов, впервые обоснована (1963) и Л.И. Слуцким (1969). Она наблюдается при механических травмах, ожогах и экспериментальных подкожных гранулемах. Тем не менее, темпы биохимических изменений определяются как размерами и конфигурацией повреждений, так и свойствами повреждающего фактора. Первое общеизвестно, так как линейные раны заживают быстрее ран, покрытых струпом. Решающим фактором в этом случае является скорость контракции краев раны. Во втором случае главная роль принадлежит механизму действия повреждающего фактора на метаболизм соединительной ткани. Установлено, что механические раны по темпам репаративного процесса значительно превосходят заживление ожогов равной площади {fctuotiiKika-etvoitiALtr 1973). При ожогах щелочью репаративный процесс идет медленнее, чем при термических или лучевых ожогах (Ak t/ ,Ae АГЪ%Р1О, 1962; ZcLrujOuL и соавт., 1975; Іе ди/оіО-ж соавт., 1975). Подкожное введение терпентина {&Огік. , frctem t c u » 1964; Houcl и соавт., 1968), каррагенана { ue uft t iCLt 1972) и производных целлюлозы (Л.И. Слуцкий и соавт., 1974, 1977) еще более замедляют темпы биохимических изменений.
Гидролазная активность ферментов кожи и сыворотки крови кроликов при поражении холодом
При гангрене конечностей кроликов вследствие холодового поражения выделение оксипролина с мочой не отличается от нормы во все периоды наблюдений (табл.7). Следовательно, и в этом случае имеются четкие различия между Холодовыми воздействиями неодинаковой интенсивности. Наблюдается парадокс -при наиболее тяжелых повреждениях биохимические изменения в составе плазмы крови и мочи наименее выражены.
Выраженные изменения в коже, крови и моче при некрозе кожи диктуют необходимость анализа зависимостей в изменениях концентраций оксипролина, содержащегося в данных субстратах. В течение первой недели после холодового воздействия между изменениями концентраций оксипролина в коже и в плазме крови имеется статистически достоверная обратная взаимосвязь (табл.8). Следует указать, что она более выражена между динамикой свободного оксипролина плазмы крови, а не белковосвя-занной аминокислоты, и изменениями концентраций оксипролина кожи. Аналогичная корреляция имеется между динамикой оксипролина мочи и кожи. Корреляция между свободным и белково-связанным оксипролином плазмы крови, хотя и статистически достоверна, но относительно невелика. Изменения концентраций свободного оксипролина плазмы крови и оксипролина мочи хорошо согласуются между собой, тогда как динамика последнего относительно мало зависит от изменений концентраций белковосвязанно-го оксипролина плазмы крови. Если же сопоставить вышеизложенные корреляции с характером изменений оксипролина в составе кожи, крови и мочи, то получится следующее. Снижение концентраций оксипролина в поврежденной коже, связанное с увеличением гидролазной активности ферментов, вызывает повышение концентраций этой аминокислоты в плазме крови и моче. Одновременно увеличивается и гидролазная активность ферментов в плазме крови. Увеличение концентрации оксипролина в коже, связанное с уменьшением гидролазной активности ферментов, сопровождается снижением его концентраций в крови и моче.
Таким образом, локальное холодовое воздействие оказывает существенное влияние на метаболизм коллагеновых белков в организме кроликов. При некрозе кожи оно выражается в увеличении активности коллагеназы и неспещфических кислых гидролаз - ка-телсинов, что способствует снижению концентраций коллагеновых белков, особенно не входящих в состав зрелых коллагеновых волокон. Одновременно увеличивается количество оксипролина в составе плазмы крови и мочи, а также активность гидролаз в сыворотке крови. Снижение концентрации коллагена в коже статистически достоверно коррелирует с увеличением концентраций свободного оксипролина в плазме крови и в моче, а в меньшей степени - с увеличением содержания белковосвязанного оксипролина в плазме крови. В это время увеличение активности ферментов в очаге повреждения хорошо согласуется с повышением общей про-теолитической и катепсиновой активности плазмы крови.
Снижение гидролазной активности в зоне повреждения сопровоадается накоплением в коже растворимых форм коллагена, а затем и общей концентрации этой группы белков. Нужно отметить, что катепсиновая активность ферментов в сыворотке крови нормализуется ранее общей протеолитической активности и активности гидролаз в зоне повреждения. Это статистически достоверно коррелирует с уменьшением уровня оксипролина в составе крови и мочи.
При гангрене конечностей кроликов, вызванной Холодовым воздействием, наблюдается парадоксальное явление: концентрации оксипролина в плазме крови и моче в течение всего периода наблюдений практически не изменяются и не отличаются от содержания этой аминокислоты в плазме крови и моче интактных животных. Следовательно, при максимальных повреждениях изменения изучаемых показателей отсутствуют, хотя они отчетливо выражены при холодовом воздействии меньшей степени тяжести.
Коллагеновые белки имеют большое значение в обеспечении репаративнои функции соединительной ткани, но в процессах реализации ее активно участвуют и другие макромолекулы соединительной ткани, такие как структурные гликопротеины и протео-гликаны. Эти белки тесно связаны с метаболизмом коллагена, что диктует необходимость их исследования при локальных Холодовых воздействиях.
Гликопротеины, протеогликаны и активность гиалуронидазы кожи кроликов при холодовом поражении
При гангрене конечностей кроликов экскреция ГАГ с мочой не отличается от нормы во все периоды наблюдений (табл.15). Таким образом, динамика гликопротеинов и ГАГ в плазме крови и моче кроликов при Холодовых воздействиях различной степени тяжести во многом совпадает.
В заключение следует сопоставить изменения концентраций ГАГ в коже, крови и моче кроликов, чтобы выявить возможные взаимосвязи между ними. В течение первых трех суток после холодового воздействия между динамикой концентраций ГАГ в коже и в плазме крови имеется статистически достоверная обратная корреляция (2 = - 0,92, Р 0,001). Следовательно, увеличение концентраций полисахаридов в плазме крови тесно связано с уменьшением их количества в поврежденной коже. В период с 7 по 21 сутки между этими показателями существует уже достоверная положительная корреляция ( = + 0,81, Р 0,01), что позволяет предполагать существование единого фактора, способствующего снижению концентраций ГАГ в коже и плазме крови. 8 последующие сроки изменения этих показателей уже не коррелируют.
В течение первых трех суток после холодового поражения кожи динамика концентраций ГАГ в моче в большей степени связана с изменениями их в плазме крови ( = + 0,93, Р 0,01), чем в коже ( = - 0,67, Р 0,01). Следовательно, повышение экскреции ГАГ с мочой в большей степени связано с увеличением концентрации полисахаридов в плазме крови, чем с уменьшением их количества в поврежденной коже. С 7 по 21 сутки выделение ГАГ с мочой связано как с изменениями концентраций их в плазме крови ( = + 0,97, Р 0,01), так и в коже ( = + 0,64, Р 0,01). С 21 по 60 сутки коррелируют лишь изменения концентраций ГАГ в плазме крови и в моче ( = + 0,52, Р 0,05).
Холод, как поражающий фактор, оказывает существенное влияние на обмен глицидных компонентов гликолротеинов и про-теогликанов в коже, плазме крови и моче кроликов. Локальное холодовое воздействие активирует гиалуронидазную активность в очаге поражения, что способствует снижению концентраций ГАГ. Одновременно в коже резко возрастает концентрация гликопротеи-нов. С этим связано увеличение концентраций гликопротеинов и ГАГ в плазме крови и моче, а также повышение активности гиалу-ронидазы в сыворотке крови. Снижение активности этого фермента способствует накоплению в коже ГАГ. Первоначально увеличивается концентрация несульфатированных полисахаридов, а после ее повторного снижения - и концентрация сульфатированных ГАГ. Одновременно снижается содержание гликопротеинов в коже, сыворотке крови и моче, а также концентрации ГАГ в плазме крови и моче. Все эти явления выражены при некрозе кожи, вызванном действием холода, тогда как гангрена конечностей кроликов стимулирует лишь кратковременное увеличение концентраций гликопротеинов в плазме крови и моче.
Как уже указывалось ранее, гликопротеины соединительной ткани довольно трудно отличить по химическому составу от белков плазмы крови. Поэтому в следующем разделе работы необходимо привести данные о влиянии холодового воздействия на распределение белков плазмы крови в коже, крови и моче кроликов.
Гангрена конечностей оказывает минимальное влияние на химический состав крови и мочи кроликов, из-за чего было решено ограничиться изучением метаболизма белков плазмы крови при некрозе кожи, вызванном локальным Холодовым воздействием.
Перекрестный иммуноэлектрофорез позволяет обнаружить в сыворотке крови интактных животных около 20 антигенов (рис.3). Большая часть из них связывается с конканавалином А, вследствие чего их преципитаты исчезают с участка иммуноэлектрофоре-граммы, где в промежуточный гель-образец был внесен данный лектин (рис.3). Следовательно, глобулины сыворотки крови кроликов являются гликопротеинами, в состав которых входят моно- и (или) аминосахара. Поскольку с лектином в этих условиях должны реагировать не менее двух углеводных рецепторов каждого из гликопротеинов, содержание в них углеводов должно быть не менее 5%.
При диск-электрофорезе в 7,5% полиакриламидном геле сыворотка крови интактных кроликов разделяется на 15-20 белковых фракций (рис.4). Некроз кожи, вызванный, холодовой травмой, практически не влияет на количество фракций белков в сыворотке крови, независимо от срока наблюдений (рис.4). Не изменяется и спектр специфических белков антигенов при иммуноэлектрофоре-зе (рис.5). Однако, концентрации глобулинов-гликопротеинов увеличивается уже через сутки после поражения холодом.
