Введение к работе
Актуальность проблемы. В пищеварительных органах всех живых организмов присутствует широкий набор гидролитических ферментов. Огромный интерес к изучению физиологических функций этих ферментов и механизмов гидролиза объясняется их значительной ролью в обмене веществ у животных.
К настоящему времени данные, имеющиеся в литературе, в большей степени посвящены протеолитическим ферментам рыб и практически не касаются хитиназ беспозвоночных (Сидоров, 1980; Немова, 1996; Высоцкая, 1999; Кузьмина, 2005). Вместе с тем моллюски, ракообразные и иглокожие являются одними из наиболее древних и многочисленных в видовом отношении животных. Изучение биохимических принципов, обеспечивающих их жизнедеятельность, облегчает понимание биохимических процессов у организмов высших таксонов (Мухин, 1999).
Важным направлением использования хитинолитических ферментов в медицине является получение различных неогликоконъюгатов, применяемых в медицине для ингибирования процесса метастазирова-ния при онкопатологии. Производные хитина, такие как хитоолигоса-хариды и олигосахариды хитозана, получаемые с помощью хитинолитических ферментов, также обладают многими важными и полезными для здоровья свойствами, проявляют противоопухолевое действие, улучшают функции кишечника (последнее объясняется способностью стимулировать рост Bifidobacteria— полезной кишечной бактерии, которая помогает справляться со многими болезнями желудочно-кишечного тракта (Журавлева, 2004).
Кроме того, в последние десятилетия широкое распространение получил микробиологический метод защиты растений — использование препаратов на основе Bacillus thuringiensis, выделяющей хитино-литические ферменты. Перенос гена хитиназы в клетки растений позволил сделать их носителями собственного инсектицида (Журавлева, 2004).
Пищеварительные органы различных морских беспозвоночных, и, особенно, гепатопанкреас ракообразных являются уникальным сырьем для получения ферментов. Этот вопрос является предметом детального изучения огромного количества научных работ (Jeuniaux, 1963; Сахаров, 1992; Руденская, 1995; Климова, 1999). В ПИНРО также проводятся работы по исследованию протеолитической и хитинолитической активности гепатопанкреаса камчатского краба (Мухин, 1999; Новиков, 2007).
Цель и задачи исследования. Цель данной работы — исследование хитинолитической активности в пищеварительных органах некоторых беспозвоночных Баренцева моря и выделение фракций белков, ответственных за проявление этого вида активности.
Реализация данной цели потребовала решения следующих задач:
-
Провести сравнительное изучение хитиназной активности у морских беспозвоночных (камчатского краба, серрипеса, трубача, ку-кумарии, морской звезды).
-
Изучить динамику ферментативного гидролиза хитина и хитозана под действием ФП (ферментного препарата) из гепатопанкреаса камчатского краба при различных условиях проведения анализа.
-
Сравнить кинетические характеристики гидролиза хитина /хитозана под действием ФП из гепатопанкреаса камчатского краба.
4. Исследовать природу хитинолитических и протеолитических
ферментов и охарактеризовать их молекулярные массы (ММ).
Научная новизна. Впервые установлены основные характери
стики хитинолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского кра
ба. Определены оптимальные условия гидролиза хитина. Проведено
сравнительное исследование хитинолитической активности у морских
беспозвоночных различных таксономических групп.
Установлено, что наибольшей хитиназной активностью обладают ферменты, выделенные из камчатского краба и морской звезды. Причем эндохитиназная активность выше у фермента, выделенного из морской звезды, а экзохитиназная— из краба. Показано отсутствие экзохитозаназной активности у камчатского краба. Доказано, что за хитинолитическую и протеолитическую активности ФП из гепатопанкреаса камчатского краба отвечают различные ферменты. Подтверждена различная природа экзо- и эндохитиназ ФП. Впервые также установлена молекулярная масса (50,9 кД) хитиназы, выделенной из гепатопанкреаса камчатского краба.
Практическое значение работы.
Результаты настоящих исследований и сделанные на их основании выводы расширяют представление о ферментативных системах беспозвоночных и позволяют лучше понять их физиологические особенности.
Получение хитиназ из отходов переработки морских гидробио-нтов может способствовать решению проблемы комплексного использования водных ресурсов.
Обнаружение хитинолитических ферментов в гепатопанкреасе камчатского краба, позволит расширить области его применения, что повысит рентабельность использования отходов крабового промысла.
Определенные в ходе исследования оптимальные условия гидролиза хитина, могут быть использованы для совершенствования процесса получения олигомеров и мономера хитина — N-ацетилгліокозамина (GlcNAc), имеющих практическую ценность. При ферментативном гидролизе хитина, по сравнению с химическим гидролизом, происходит образование GlcNAc и не наблюдается выход D-глюкозамина (GlcN), что позволяет получать чистый ацетилирован-ный моносахарид. Мягкие условия ферментативного гидролиза и его избирательность обеспечивают получение целевых и побочных продуктов реакции, соответствующих требованиям экологической безопасности производства.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Российских, региональных и международных конференциях: Пятой региональной науч. студенческой конф. «Естественнонаучные проблемы Арктического региона», Мурманск, 2004; Между-нар. конф. «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2004; 2-ой науч. конф. с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2007; XXV юбилейной конф. молодых ученых ММБИ РАН, Мурманск 2007; Межд. науч.— техн. конференциях «Наука и образование», Мурманск, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008; Межд. науч. — практ. конференции «Техника и технологии переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья», Мурманск, 2008; 10th Int. Chemical and Biological Engineering Conf. — CHEMPOR 2008, Braga, Portugal, 2008; Девятой Междунар. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Ставрополь, 2008; Всеросс. конф. молодых ученых и специалистов, посвященной 90-летию со дня рождения К. Г. Константинова, Мурманск, 2008 г.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 145 страницах, включает 4 таблицы и 33 рисунка. Работа состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы, включающего 184 публикации, из них 105 иностранных.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, включающих 7 статей, из которых 4 — в реферируемых источниках.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своим наставникам: Новикову В. Ю. и Мухину В. А., а также всей лаборатории биохимии и технологии ПИНРО за помощь в организации и проведении исследований. Особая признательность Карасевой Т. А. и Жилину А. Ю. за поддержку и ценные замечания.
