Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1.1. Липидный и белковый состав мембран митохондрий 10
1.2. Липид -белковые взаимодействия в мембранах митохондрий 15
1.3. Влияние на митохондрии стрессовых факторов и моделей патологических состояний 20
ГЛАВА 2. Материмы и методы исследования 31
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение
1.3. Липидный состав и активность ферментов дыхательной цепи и олигомицинчувствительной АТФ-азы митохондрий печени крыс при аллоксановом диабете 40
3.1.1. Липидный состав мембран митохондрий печени при аллоксановом диабете 40
3.1.2. Активность ферментов дыхательной цепи митохондрий печени при аллоксановом диабете... 56
3.2. Модификация фосфолипидяого состава мембран митохондрий печенш крыс с помощью , ЛПБ 62
3.2.1. Встраивание экзогенных фосфолипидов в мембрану митохондрий печени нормальных и аллоксан-диабетических крыс в присутствии ЛПБ 64
3.2.2. Влияние экзогенных фосфолипидов на активность ферментов дыхательной цепи мембран митохонд-. рий печени аллоксан-диабетических крыс .75
3.2.3. Влияние экзогенных фосфолипидов на активность олигомицинчувствительной АТФ-азы митохондрий печени аллоксан-диабетических крыс 80
3.2.4. Влияние инсулина на активность ферментов дыхательной цепи и липидный состав мембран митохондрий печени аллоксан-диабетических крыс 86
3.2.5. Свойство МБ,выделенных из печени аллоксан- диабетических крыс 92
Заключение 95
Выводы 100
Список литературы 102
- Липидный и белковый состав мембран митохондрий
- Влияние на митохондрии стрессовых факторов и моделей патологических состояний
- Липидный состав мембран митохондрий печени при аллоксановом диабете
- Встраивание экзогенных фосфолипидов в мембрану митохондрий печени нормальных и аллоксан-диабетических крыс в присутствии ЛПБ
Введение к работе
Многочисленные исследования последних лет, направленные на изучение механизма возникновения и протекания различных патологических процессов, свидетельствуют о том, что изменение структуры и функции мембран клетки является важным звеном в цепи возникающих нарушений. При этом независимо от того, действуют-ли повреждающие агенты на саму мембрану, или это действие опосредовано каким-либо промежуточным фактором, мембраны клетки чутко реагируют на воздействие изменением структурных компонентов и активности мембраносвязанных ферментов /1,8,16,19,23,29,30,64, 91/.
В основе этих повреждений во многих случаях лежит нарушение барьерной функции липидного бислоя, что указывает на важную роль липидов в патогенезе различных заболеваний.
Кроме того, важное значение липидов связано с тем, что они образуют гидрофобный матрикс, состояние которого влияет на функциональное состояние мембраны в целом.
Интенсивное изучение роли липидов в функционировании мембраносвязанных ферментов позволило прийти к следующим заключениям.
Липиды могут регулировать активность мембраносвязанных ферментов, оказывая влияние на конформацию белковых молекул, образуя гидрофобную среду, необходимую для протекания различных химических реакций; они также могут выполнять кофакторную роль в различных ферментативных процессах /25,65,83,90,99,141/. Кроме того, липиды влияют на эффективность действия гормонов, токсинов и других физиологически активных веществ, на транспорт ионов и субстратов, а также на процессы энергообразования /2,15,68,112/.
Подобная полифункциональность привлекает большое внимание и в тоже время затрудняет выводы относительно значимости результатов исследований. В частности, остаются открытыми вопросы о роли липидов в обеспечении оптимальных условий для полного функционирования ферментов дыхательной цепи и ион-транспортирующих АТФ-аз.
Какое функциональное значение имеют наблюдаемые при различных стресовых воздействиях изменения количественного и качественного состава липидных компонентов мембран?
Какова роль липидов в процессах рецепции гормонов, транспорта веществ и передаче нервных импульсов и т.д.?
Решение этих проблем должно открыть широкие перспективы в регуляции функционального состояния мембран и, тем самым, даст возможность оказывать влияние на течение различных патологических процессов. Сказанное относится и к одной из важных проблем современной эндокринологии - изучению сахарного диабета.
Благодаря интенсивным исследованиям последних лет достигнуты большие успехи в выяснении патогенеза и этиологии данного заболевания. В частности установлено, что при относительной или абсолютной инсулиновой недостаточности возникают нарушения в поступлении глюкозы в инсулинзависимые ткани , наблюдается снижение окислительного фосфориширования и образования глюкозо-6-фосфата с последующим нарушением гликолитического пути окисления глюкозы, нарушением цикла Кребса и гексозомонофосфатного цикла, угнетение гликогеногенеза, усиление глюконеогенеза и использования свободных жирных кислот в качестве источников энергии.
Наряду с нарушениями углеводного обмена при данном патологическом процессе обнаружены изменения и в липидном обмене.
В частности установлено, что при сахарном диабете, на фоне повышения уровня глюкозы крови, наблюдается высокое содержание НЭЖК, триглицеридов, холестерина, фосфолипидов, j8 -липопротеи-дов и кетоновых тел.
При аллоксановом диабете было обнаружено изменение липидно-го состава различных тканей /48/, а также установлено снижение активности ферментов дыхательной цепи /I/ и изменение фосфоли-пидного состава митохондрий /23/. Эти данные указывают на то, что при диабете наряду с нарушениями углеводного и липидного обмена на уровне целого организма наблюдаются изменения и в липид-ном компоненте мембранных образований клетки и, в частности, в мембранах митохондрии.
Анализ литературы, посвященной диабету, показывает, что в нарушениях углеводного и липидного обмена не-малая роль принадлежит повреждению барьерной функции мембран. Однако, в доступной нам литературе мы не обнаружили работ по исследованию особенностей взаимодействия липидов и мембраносвязанных ферментов митохондрий при данной патологии. В то время как выяснение этого вопроса может дать ключ к пониманию патогенеза и этиологии сахарного диабета на субклеточном уровне. Кроме того, нам кажется, необходимо исследовать свойство липид-первносящих белков при данной патологии, так как работы последних лет показали, что от их функциональной активности во многом зависит липидный состав субклеточных органелл /18/.
Исходя из вышеизложенного, целью данной работы явилось исследование липидного состава мембран митохондрий печени при аллоксановом диабете и выяснение влияния изменений в составе на активность ферментов дыхательной цепи и олигомицинчувствительной АТФазы митохондрий печени.
В соответствии с целью исследования были сформулированы следующие задачи: - изучить качественный и количественный состав липидов
внешней и внутренней мембраны митохондрий печени крыс с алло-ксановым диабетом;
- изучить жирнокислотный состав суммы и отдельных фракций фосфолипидов внешней и внутренней мембраны митохондрий при данной модели патологического состояния;
- определить зависимость между изменением в составе липидов мембран митохондрий и активностью ферментов дыхательной цепи и олигомицинчувствительной АТФазы митохондрий при алло-ксановом диабете;
- исследовать влияние индивидуальных фосфолипидов на активность ферментов дыхательной цепи и олигомицинчувствительной АТФ-азы митохондрий;
- исследовать свойства ЛПБ печени при данной модели патологического состояния;
- исследовать влияние инсулина на липидный состав и активность ферментов дыхательной цепи и олигомицинчувствительной АТФазы митохондрий печени аллоксан-диабетических крыс.
Результаты данной работы позволили установить зависимость между изменением липидного состава и активностью мембраносвязанных ферментов митохондрий печени крыс при аллоксановом диабете. При этом установлена корреляция между низкой активностью исследованных ферментных систем и повышением содержания в мембранах митохондрий ЛФХ, ВЭ1К, холестерина и насыщенных жирных кислот в сумме фосфолипидов.
Модификация фосфолипидного состава мембран митохондрий печени аллоксан-диабетических крыс с помощью ЛПБ и фосфолипидных липосом приводила к повышению активности ферментов дыхательной цепи и олигомицинчувствительной АТФ-азы митохондрий, при этом наибольшее влияние наблюдалось при добавлении суммы фосфолипидов.
Инсулин не восстанавливал исходный липидныи состав мембран митохондрий печени аллоксан-диабетических крыс, что указывает на отсутствие прямого воздействия последнего на липидныи состав мембран митохондрий печени.
В целом, результаты данного исследования показывают, что важным звеном в механизме возникающих нарушений при аллоксано-вом диабете являются изменения в липидном составе мембран митохондрий печени, вызывающие в свою очередь, снижение активности мембраносвязанных ферментов Изменения в липидном составе митохондрий обусловлены, возможно, активацией эндогенной фосфолипазы и изменением свойств ЛПБ.
Липидный и белковый состав мембран мито-хондрий
Липидный и белковый состав мембран митохондрий митохондрии ограничены двумя отдельными мембранами. Внешняя мембрана гладкая, внутренняя имеет нерегулярно чередующиеся складки, так называемые кристы. Внутренняя часть митохондрий называется матриксом. Каждая из частей митохондрий обладает специфическими свойствами и содержит различные типы ферментов, которые необходимы для протекания биохимических процессов.
Внешняя и внутренняя мембраны митохондрий отличаются друг от друга как по морфологическим характеристикам, так и по физическим и химическим свойствам.
Из морфологических признаков можно выделить наличие регулярно расположенных фрагментов на внутренней поверхности мембраны и нерегулярно расположенные каналы на внешней поверхности внешней мембраны. Из физических свойств можно отметить неодинаковую проницаемость внешней и внутренней мембраны для различных веществ.
Так, внешняя мембрана проницаема даже для больших молекул в отличие, от внутренней, для которой характерна селективная проницаемость для малых молекул с использованием специфических переносчиков /105,107/. Из химических свойств мембран митохондрий можно отметить неодинаковое весовое соотношение липидов и белков во внешней и внутренней мембране, разное процентное соотношение отдельных липидов, а также наличие определенных ферментов во внешней и внутр енней мембране /74/.
В митохондриях обнаружены в основном фосфолипиды, нейтральные липиды и холестерин.
Соотношение лиішдов в мембранах митохондрий, колеблется в довольно широких пределах (табл.І). В митохондриях, в отличие от других мембран клетки, обнаружено высокое содержание ДФГ, что позволяет называть этот фосфолипид маркером митохондрий.
В литературе существует весьма противоречивое мнение относительно состава отдельных фракций фосфолипидов. Так, по данным Зембрено /153/ и Карагезяна /23/ в митохондриях на долю ЛФХ приходится до 8$ от общих фосфолипидов, в тоже время Дятловиц-кая и Пальмина /19,36/ не обнаружили этот фосфолипид в мембранах митохондрий. Согласно Карагезяну, Колби, а также раду других авторов /23, 67, 89, 107/ содержание сфингомиелина в митохондриях составляет от 6,5 до 16$ от суммы фосфолипидов, в то время как Дятловицкая /19/ и Робинсон /42/ считают данный фосфолипид характерным для микросом и полагают, что его присутствие в ми-тохондриальных фракциях, указывает на примеси других мембран.
Детальное исследование липидного состава мембран митохондрий позволило установить липидный спектр внешней и внутренней мембраны митохондрий.(табл. 2). Во внешней мембране митохондрий содержание нейтральных фосфолипидов выше, чем во внутренней мембране, и наоборот, во внутренней содержание кислых фосфолипидов выше, чем во внешней. Подобное различие в фосфолипидном составе внешней и внутренней мембраны не случайно и имеет важное значение для проявления мембранами митохондрий их функциональных свойств.
Работы по исследованию жирнокислотного состава фосфолипидов внешних и внутренних мембран митохондрий показали, что соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот также различается /52,92/. Во внешней мембране насыщенные жирные кислоты преобладают над ненасыщенными, а во внутренней ненасыщенных жирных кислот больше, чем насыщенных /108, 92/. Подобное различие в жирнокислотном составе наблюдается и для отдельных фракций фосфолипидов внешней и внутренней мембраны митохондрий. Так, для фосфатидилэтаноламина установлено отношение насыщенных жирных кислот к ненасыщенным во внешней мембране равное 1,28; а для внутренней - 0,87. Для дифосфатидилглицерина это соотношение составляет 1,28 для внешней мембраны и 0,36 для внутренней /107/.
Литературные данные о содержании в митохондриях нейтральных липидов также противоречивы. По данным Робинсона /42/ в митохондриях отсутствует холестерин, и обнаружены только эфиры холестерина, в то же время другие авторы /67,74,89,153/ установили наличие в митохондриях холестерина и показали, что во внешней мембране содержание холестерина в 6 раз больше, чем во внутренней. Расходятся мнения авторов и о содержании в митохондриях неэтерифицированных жирных кислот (три-, ди - и моногли-церидов). По данным одних авторов /67,78,89,153/ НЭЖ в мембранах митохондрий составляют 9% от общего количества липидов, другие авторы не сообщают о наличии НЭЖ в митохондриальных мембранах.
Присутствие в митохондриях три-, ди- и моноглицеридов является спорным; они появляются по данным Белоус и соавт. /18/ при медленном "отогреве" митохондрий после быстрого замораживания. Белковый состав мембран еще более разнообразен, чем липид-ный.
Для мембран митохондрий характерно весовое соотношение фосфолипидов и белков во внутренней мембране равное 0,27; а во внешней - 0,82 /34/. Высокое содержание белка во внутренней мембране связано с тем, что последняя участвует во множестве самых разных ферментативных реакциях. Внешняя мембрана митохондрий содержит весьма разнообразный набор ферментов, принадлежащих к разным звеньям метаболизма клетки /75/. Так для внешней мембраны характерно наличие ферментов метаболизма жирных кислот, фосфолипидов и других липидов.Аминооксидаза служит маркером при выделении внешней мембраны митохондрий.
Во внутренней мембране митохондрий 25$ всех белков приходится на долю ферментов дыхательной цепш и окислительного фос-форилирования. Не перечисляя многочисленные ферменты, локализованные во внутренней мембране митохондрий, приведем здесь только те, которые были исследованы в нашей работе. Это ферментные системы НДЦ.Н-, сукцинат- и цитохром-оксидаз, а также ферментный комплекс олигомицинчувствительной АТФ-азы митохондрий.
Влияние на митохондрии стрессовых факторов и моделей патологических состояний
Мембраны митохондрий являются весьма лабильными структурами, чутко реагирующими на стрессовые воздействия изменением состава липидных компонентов и активности мембраносвязанных ферментов.
Так в работе Козельцева и соавт. /25/ показано, что выдерживание митохондрий печени крыс в течение двух суток при температуре 20С вызывает значительные изменения в содержании отдельных фракций фосфолипидов, при этом на фоне относительного снижения сфингомиелина, фосфатидилхолина и фосфатидилэтанола-мина, наблюдалось резкое увеличение фракций лизофосфатидилхо-лина и дифосфатидилглицерина. В серии работ, посвященных влиянию на митохондрии замораживания и оттаивания,было обнаружено, что только быстрое замораживание не вызывает изменений в липидном составе мембран, во всех других случаях, в частности, при медленном или быстром оттаивании после замораживания до -25С, наблюдаются существенные изменения в содержании общих и отдельных фракций фосфолипидов /8,9/.
В исследованиях, посвященных влиянию низкой температуры на митохондрии, было установлено увеличение проницаемости для ионов калия и малатдегидрогеназы. Авторы объясняют эти явления изменениями в фазовом состоянии липидов внутренней мембраны /13/.
В другой работе /37/ было обнаружено, что проницаемость мембран митохондрий для ионов калия, натрия и водорода, а также активность АТФ-азы и скорость окисления экзогенного НАД.Н+ по антимициннечувствительному пути в присутствии экзогенного цитохрома С зависит от скорости замораживания и оттаивания,что в свою очередь, вероятно, связано с изменениями в липидном компоненте мембран митохондрий.
Интересные данные получены в опытах по искусственной гипотермии животных. При этом установлено, что понижение температуры окружающей среды вызывает снижение концентрации коньюгиро ванных диенов, а также, увеличение активности малатдегидрогеназы, каталазы и цитохромоксидазы /49,57/. В работах, посвященных исследованию влияния высоких температур на функциональные параметры митохондрий, было установлено, что выдерживание митохондрий при повышенной температуре вызывает активацию окисления субстратов, повышение проницаемости митохондриалышх мембран для НДЦ.Н? ДЦФ и других субстратов окислительного фосфорилирования и снижение стабильности оксидаз /26,33/.
Б серии работ по исследованию активности полиферментных систем и функционального состояния митохондрий при различных стрессовых воздействиях, в частности, голодании, гепатите и аллоксановом диабете, было установлено, что высокотемпературная инкубация митохондрий приводит к более быстрой деградации ферментных систем, чем в контроле /1,3/. Авторы объясняют это явление нарушением поступления субстратов и ко. факторов переноса электронов в результате нарушения сопряжения между белками и липидами.
Существенное влияние на структурные компоненты и функциональные параметры митохондрий оказывают и модели патологического состояния, в частности, модель аллоксанового диабета.
В ряде исследований установлено, что при аллоксановом диабете происходит торможение переноса адениннуклеотидов через митохондриальные мембраны /106/. Это торможение обусловлено, по мнению авторов, обратным переносом электронов при переходе из состояния Щ в состояние lL . Кроме того, аллоксано-вый диабет вызывает ингибирование поглощения и торможение выхода неорганического фосфата из митохондрий печени мышей, а добавление ДЦФ к митохондриям печени животных с аллоксановым диабетом стимулирует потребление кислорода в меньшей степени,чем в митохондриях контрольных животных.
В работе Агзамова и соавт. /I/, посвященной исследованию активности ферментов дыхательной цепи митохондрий печени при аллоксановом диабете, показано, что данное патологическое состояние приводит к снижению активности НАД.Н-, сукцинат- и цито-хром-оксидаз митохондрий и уменьшению термостабильности ферментных систем. Авторы объясняют это нарушением поступления субстратов и кофакторов переноса электронов, которое происходит в результате изменений в структуре мембран.
Богвист и соавт. /58/ в своей работе, посвященной влиянию аллоксана на митохондрии J -клеток поджелудочной железы,отмечают, что структурные изменения в митохондриях / -клеток обусловлены прямым или опосредованным действием аллоксана на связанные с неорганическим. фосфатом механизмы транспорта ионов в митохондриях.
Аллоксановый диабет оказывает существенное влияние и на липидные компоненты различных мембран;в том численна мембраны митохондрий.
Так в работе /94/ показано, что при аллоксановом диабете в митохондриях печени и почек наблюдается снижение содержания общих фосфолипидов и отдельных фракций, за исключением фосфа-тидилинозита. Установлено также нарушение синтеза ФЭА и превращение фосфатидилхолина в лизофосфатидилхолин в сердце крыс /64/.
При исследовании некоторых показателей липидного обмена в условиях спонтанного диабета /117/ было обнаружено значительное повышение скорости окисления пальмитата и активности ji -оксибутиратдегидрогеназы в митохондриях печени морских свинок.
Авторы считают, что увеличение скорости окисления жирных кислот происходит в процессе развития или исчезновения диабета, а изменение активности ,6 -оксибутиратдегидрогеназы наблюдается на более поздних стадиях.
Интересные результаты были получены при исследовании фос-фолипидного состава внешней и внутренней мембраны митохондрий печени при аллоксановом диабете /23/. При этом обнаружено,что во внешней мембране содержание общих и отдельных фракций фос-фолипидов снижается, за исключением лизоформ фосфолипидов,содержание которых увеличивается. Во внутренней мембране наблюдается обратная картина. Авторы объясняют это тем, что в результате нарушения работы цикла Кребса при данной патологии, в связи с резким ограничением потребления основного субстрата окисления глюкозы, накопление фосфолипидов сопровождается одновременным и интенсивным вовлечением их в тканевые окислительные реакции в качестве потенциальных источников энергии.
Липидный состав мембран митохондрий печени при аллоксановом диабете
Для этого митохондрии и фракции внешней и внутренней мембраны после отбора аликвот на белок и общий фосфор заливали смесью хлороформ-метанол из расчета 20 мл смеси на Г мл суспензии митохондрий. Экстракцию проводили в течение часа,постоянно перемешивая смесь на магнитной мешалке. После этого пропускали через фильтр (14) и осадок на фильтре промывали небольшим объемом смеси хлороформ-метанол. Затем к экстракту для удаления нелипиднык примесей добавляли I -ный раствор KCI в соотношении (5:1). После тщательного перемешивания, для разделения водной и органической фазы, экстракт центрифугировали 20 минут при 600 ft , , После расслоения водно-метаноловый слой отсасывали, а с нижним слоем повторяли указанную обработку два раза (для более тщательного удаления нелипидных примесей). Полученный экстракт липидов упаривали в токе азота на роторном испарителе, затем к экстракту липидов добавляли 0,4 мл хлороформ-метаноловой смеси, продували азотом и хранили его при 0-4С.
Разделение фракций фоофолипидов методом тонкослойной хроматографии. В настоящем исследовании была использована одномерная восходящая хроматография на слое силикагеля. Силика-гель КСК, предварительно измельченный, просеянный через сито (100-150 меш.) и промытый по рекомендации Бергельсон Л.Д. /II/ наносили на пластинки методом осаждения и сушили на воздухе. Перед использованием пластинку с сорбентом, предварительно разделенную на отдельные полосы по 15 ым, активировали при ПО С в течение 20 минут.
Образцы липидов наносили на пластинки в растворе хлороформ-метанола в виде полосы (7 мм) с помощью стеклянного капиляра. Наиболее хорошее разделение фосфолипидов было получено при использовании системы, содержащей хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода (65:43:Г: 4).
Іфїентификацию фракций фосфолипидов проводили нанесением свидетелей и сравнением значений Kf . При определении количественного содержания фосфолипидов по фосфору пластинки проявляли в парах йода. Для денситометрического анализа фракций фосфолипидов, пластинки сжигали в парах серной кислоты /24/.
Определение фосфолипидов, свободных жирных кислот, холестерина и триглицеридов. Количественное содержание общих фосфолипидов определяли после минерализации образцов с последующим колориметрическим измерением количества образовавшегося неорганического фосфора по реакции с молибдатом аммония в присутствии восстановителей. В нашей работе мы использовали описанный выше метод, модифицированный Васьковским /145/. Отдельные фракции фосфолипидов определяли после сжигания в парах серной кислоты денситометрированием окрашенных пятен с последующим измерением площади соответстврощих пиков. Результаты денситометрирования сопоставляли с данными колориметрического определения неорганического фосфора по Вась-ковскому. Перед колориметрированием липиды экстрагировали из пятен, силикагель осаждали центрифугированием при 600 о в течение 10 минут, контролем служили реактивы и зоны, не содержащие фосфолипидов. Количество фосфора вычисляли по стандартной кривой, построенной с использованием раствора КЩРО . Содержание триглицеридов и холестерина определяли по методу /62.,53/, свободные жирные кислоты по Ланкину /28/. При работе с меткой образцы фракций фосфолипидов, мечен 14 ных по С , переносили вместе с силикагелем в флаконы, содержащие по 5 мл сцинтилляционной жидкости марки ЖС-5, и через 16. часов производили подсчет радиоактивности на жидкостно-сцинтилляпионном счетчике Mark-Ш, фирмы Huclear_ Chicago (США). Для документации хроматограмм пластинки опрыскивали 10$ раствором серной кислоты в этаноле и нагревали до появления темных пятен, фотографировали репродукционным способом. 7. Определение жирнокислотного состава фракций фосфоли пидов митохондрий печени. Для определения жирнокислотного сос тава суммы фосфолипидов и отдельных фракций, выделенных по вы шеописанному методу, подвергали кислотному метанолизу (кипяче ние с 5$-ным раствором соляной кислоты в метаноле), полученные метиловые эфиры жирных кислот очищали препаративной тонкослой ной хроматографией в системе гексан-эфир-уксусная кислота (85:15:1). Анализ метиловых эфиров проводили методом ТШ. на хроматографе ЛХМ-8 Щ, модель - 3 (колонка - 15$ Реоплекс - 400, на хроматоне NAW - DMCS 0,16 - 0,20) температура термостата 197С, температура испарителя 250С, детектор пламенно-ионизационный, газоноситель - азот, скорость - 30 мл/мин. Расчет ненасыщенности индивидуальных фосфолипидов проводили как описано в работе /92/. 8. Приготовление фосфолипидных липосом и выделение сум марной фракции липид-переносящих белков (ДПБ). Фосфолипиды для приготовления липосом были выделены из пенени крыс препаративной ТСХ на силикагеле /II/, за исключением фосфатидилсери-на, который был выделен из мозга крыс, кроме того, использовались чистые коммерческие препараты ФС, ФИ, ФХ, ДФГ, ФЭ, СФ и ЛФХ. Для приготовления липосом взвесь фосфолипидов или их рас творы помещали в колбочки и упаривали растворители под вакуу мом. Липидную пленку механически диспергировали в малом объеме рабочего буферного раствора. Липосомы получали озвучиванием фосфолипидов (0,5 мг липидного Р в мл) в течение 15 минут при 0С с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-Г (частота 22 кГц, сила тока 0,4 А). Образовавшуюся эмульсию затем центри фугировали при 20000 о в течение 20 минут, осадок отбра сывали, а образовавшуюся эмульсию использовали для инкубации с митохондриями. Супернатантную фракцию 105000 о липид переносящих белков выделяли из печени крыс по методу /18/. Для этого постмикросомальную надсадочную жидкость (105000о} подкисляли ЗМ НС1 до рН - 5,1; после двухчасовой выдержки при 4С смесь центрифугировали в течение 15 минут при 15000 a t к полученной надосадочной жидкости добавляли сухой трис-буфер до рН - 7,4 и раствор хранили при 15С.
Встраивание экзогенных фосфолипидов в мембрану митохондрий печени нормальных и аллоксан-диабетических крыс в присутствии ЛПБ
Учитывая изложенное выше, мы решили исследовать способность ЛПБ к переносу экзогенных и выведению эндогенных фосфолшш-дов из митохондрий печени аллоксан-диабетических крыс. На рис. 3,4,5, представлены результаты исследования включения меченных по І4С фосфолипидов в митохондриях печени крыс в присутствии и при отсутствии ЖШ. Из рис. 3 видно, что спонтанный перенос С из ФХ липосом в митохондрии печени нормальных и аллоксан-диабетических крыс при 0С составляет около 10% от общей активности липосом. Присутствие в среде инкубации ЖШ увеличивает более, чем в 3 раза 14« перенос метки С в митохондрии печени нормальных крыс, а в митохондрии печени аллоксан-диабетических крыс почти в два с половиной раза и достигает, соответственно, 35,2% и 26,4% от общей активности липосом. Инкубация митохондрий печени при 37С с ФХ липосомами, меченными по 14С,и ЖШ увеличивает включение метки до 51% как в норме, так и при аллоксановом диабете, в отсутствии ЖШ в тех же условиях - до 22%. Аналогичная картина наблюдалась при инкубации митохондрий с ФЭ липосомами, меченными по С, при 0С и 37С, за исключением несколько большего переноса метки в митохондрии аллоксан-диабетических крыс при 37С и несколько меньшей разницей в переносе метки в присутствии ЖШ между контролем и опытом при 0С. На рис, 4 представлены результаты исследования включения СФ и ЛФХ, меченных по І4С, в митохондрии печени нормальных и аллоксан-диабетических крыс при 0 и 37С. Из рисунка видно,что и в данном случае наблюдается сходная картина. Спонтанный перенос метки 14С из фосфолипидных липосом при 0С в митохондрии нормальных и аллоксан-диабетических крыс составляет около 10$ и 12$, соответственно. Присутствие ЖБ повышает включение метки в митохондрии, при этом наблюдается большой процент включения метки в митохондрии печени нормальных крыс 30$ и 25$, соответственно, чем в митохондрии печени аллоксан-диабетических крыс 22 и 20$, соответственно. При повышении температуры инкубации разница в переносе метки в митохондрии печени нормальных и аллоксан-диабетических крыс сглаживается на фоне увеличения включения метки С СФ и ЛФХ - липосом как в отсутствии, так и в присутствии ЛПБ. При инкубации митохондрий с ДФГ и ФС липосомами (рис.5) наблюдается аналогичная картина, однако, процент переноса метки был значительно ниже, чем предыдущих фосфолипидов в случае с ДФГ липосомами и несколько меньше в случае с ФС липосомами в присутствии ЛПБ при 0С. Подводя итог данной серии экспериментов, можно отметить, что в ряде случаев перенос катализируемый ЛПБ от липосом к митохондриям при аллоксановом диабете ниже, чем в норме, в особенности, при низкой температуре. Для того, чтобы выяснить причину этого различия мы провели серию экспериментов по выявлению способности ЛПБ к выведению фосфолипидов из митохондриальных мембран меченных по 4С in vivo На рис. 6 представлены результаты исследования преинкубации при 0 и 37Яс меченных по I4C in viv0 митохондрий печени нормальных и аллоксан-диабетических крыс с ЛПБ в присутствии ФХ липосом. Контролем служили" I) митохондрии + ФХ-ЛИПОСОМЫ + среда выделения; 2) митохондрии + супернатант 8000 Q + ФХ-липосомы. Из рисунка видно, что инкубация меченых in vivo митохондрий с ЛПБ и ФХ липосомами, а также с супернатантной Фракцией 8000 о и ФХ липосомами вызывает больший выход метки из митохондрии печени нормальных крыс, чем из митохондрий печени аллоксан-диабетических крыс при 0С. Повышение температуры инкубации вызывает увеличение выхода метки из митохондрий печени крыс, и разница между нормой и диабетом исчезает. Причины, лежащие в основе указанных различий неясны. Возможно, что меньший выход метки из митохондрий диабетических крыс, чем нормальных, вероятно, обусловлен более высоким уровнем насыщенных жирных кислот в фосфолипидах и холестерина в мембранах. По-видимому, способность ЛПБ переносить фосфолипидные липосомы в митохондрии печени зависит от многих факторов, в том числе, от качественного состава липидов самих митохондрий, который как уже было отмечено выше изменяется при данной модели патологического состояния. Влияние жирнокислотного состава липидов на способность ЛПБ переносить фосфолипиды исследовалось в работе Шульца и соавт. /131/, которые отмечают, что свойство ЛПБ во многом зависит от типа жирной кислоты, находящейся в положении 2 в молекуле фосфолипида. Присутствие в этом положении ненасыщенных жирных кислот стимулировало перенос ФХ из ли-посом в митохондрии.
Как показали наши эксперименты,при аллоксановом диабете увеличивается количество насыщенных жирных кислот во всех фракциях фосфолипидов митохондрий и, в частности, в фосфолипидах внешней мембраны. Следует отметить, что работе Камп и соавт. /98/ показано, что ЛПБ более чувствительны к полярной головке переносимых фос-фолипидов, чем к аполярной части последних.
Результаты наших исследований подтверждают, в некоторой степени, выводы этих авторов. Это видно из данных, посвященных исследованию способности ЛПБ к переносу различных фосфолипи-дов в мембрану митохондрий печени нормальных крыс. При этом установлено, что перенос экзогенных фосфолипидов уменьшается в ряду ФХ ФЭ : СМ ЛФХ г ФС ДФГ.
Влияние изменений содержания фосфолипидов на свойство ЛПБ в наших исследованиях подтверждается результатами определения соотношения фосфолипид/белок (табл.12).
Так,при инкубации митохондрий печени нормальных крыс, меченных по 14С, с ЛПБ и ФХ липосомами при 37С соотношение фосфолипид/белок во внешней мембране мало изменяется и составляет 0,88. При инкубации меченных по С in vivo митохондрий печени аллоксан-диабетических крыс с ЛПБ и ФХ липосомами соотношение фосфолипид/белок увеличивается по сравнению с исходным значением 0,76 и 0,81 при 0С и почти не изменяется при 37С. Это указывает на то, что ЛПБ в митохондриях нормальных крыс, вероятно, захватывает и отдает эквивалентное количество фосфолипидов, в то время как в митохондриях аллоксан-диабетических крыс, ЛПБ больше переносит фосфолипиды в митохондрии, чем выводит их из внешней мембраны.
