Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время известен целый ряд митохондриальных белков-разобщителей (Uncoupling proteins, UCPs), которые обнаруживаются у представителей различных систематических групп эукариот, от простейших до млекопитающих, и являются молекулярными гомологами разобщающего белка - термогенина из бурой жировой ткани млекопитающих (UCP1). В частности, экспрессия UCP2 выявлена во многих тканях человека и животных, в то время как UCP3 обнаруживается в скелетных мышцах [для обзора см. Bouillaud et al., 2001; Nedergaard, Cannon, 2003; Rousset et al., 2004]. Большинство авторов связывают функции тканеспецифических гомологов UCP1 с их разобщающим действием и, как следствие, - с регуляцией общего уровня обмена веществ, несократительным термогенезом, снижением уровня продукции активных форм кислорода (АФК) в дыхательной цепи митохондрий и т.д. Имеющиеся на этот счет экспериментальные данные весьма противоречивы. Функциональное значение этих белков в клетке и организме в целом широко дискутируется и во многом остается неясным до настоящего времени.
Многие факты указывают на участие белков семейства UCP в клеточных механизмах защиты от воздействия АФК. Последнее время в литературе появились данные о том, что UCPs не только могут влиять на уровень продукции АФК посредством снижения мембранного потенциала в митохондриях и/или снижения концентрации кислорода в клетке, но и об активирующем действии супероксид-радикала непосредственно на протонофорную активность UCP2 и UCP3. По данным М. Бранда с соавторами [Echtay et al., 2002; Murphy et al., 2003], рост величины протонной утечки в энергизованных препаратах митохондрий вызывался присутствием в среде инкубации супероксид-радикала и предотвращался добавкой GDP или других пуриновых нуклеотидов. В частности, этот эффект наблюдался на митохондриях почек и отсутствовал в митохондриях печени, где по литературным данным [Larrouy et al., 1997; Zackova et al., 2003; Bouillaud et al., 2001; Nedergaard, Cannon, 2003], отсутствует или незначительна экспрессия UCP2. Было обнаружено, что супероксид-радикал действует со стороны митохондриального матрикса [Echtay et al., 2002]. Предполагается, что активация UCP опосредована перекисным окислением липидов и образованием гидроперекисей жирных кислот, которые возможно уже сами непосредственно воздействуют на UCP [Goglia, Skulachev, 2003]. Способность активироваться под действием АФК соответствует более рациональному расходованию энергии в клетке. Такая точка зрения выглядит весьма привлекательной и во многом объясняет широкое распространение белков семейства UCP в клетках растений и животных.
Однако в 1989 г., задолго до обнаружения UCPs, в лаборатории В.П. Скулачева было показано, что в разобщающем действии свободных жирных кислот на митохондрии могут участвовать ADP/ATP-антипортер (ANT) [Andreyev et al., 1989] и аспартат/глутаматный переносчик [Samartsev et al.,
1997], которые, по всей видимости, обеспечивают возврат анионов жирных кислот с внутренней на внешнюю сторону митохондриальной мембраны. UCPs, ANT и аспартат/глутаматный переносчик являются эволюционно родственными белками, входят в суперсемейство белков - анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий, и предполагается, что циклический механизм переноса протонов жирными кислотами для всех этих белков является одинаковым. В известных нам работах, в которых выявлялась функциональная активность UCPs и изучалось влияние на нее АФК, не исключалось участие и других указанных белков.
В настоящее время накопилось много сведений, противоречащих данным об активирующем действии АФК через продукты перекисного окисления на UCPs [для обзора см. Nedergaard, Cannon, 2003]. Выяснилось, что гидроперекиси жирных кислот являются менее эффективными разобщителями, чем соответствующие жирные кислоты, а ресопрягающий эффект GDP в их присутствии, обычно используемый для выявления активности UCP2, может объясняться его действием на ANT [Khailova L.S. et al., 2006]. Ранее на митохондриях скелетных мышц гибернирующих животных, где по литературным данным, значительно усиливается экспрессия UCP3, не удалось показать заметного ресопрягающего действия GDP в присутствии специфического ингибитора ANT - карбоксиатрактилата (cAtr) [Амерханов и др., 2004]. Было показано, что ресопрягающее действие GDP, наблюдаемое в отсутствие cAtr, может объясняться его способностью связываться с ANT вместо ADP по конкурентному механизму.
Цель и задачи исследования. Целью представленной работы было выявление физиологической роли разобщающих белков в митохондриях и, в частности, изучение функциональной активности UCP2 в условиях его активации супероксид-радикалом. В связи с этим были поставлены следующие задачи.
Изучить влияние супероксид-радикала на скорость дыхания, величину мембранного потенциала и основные биоэнергетические характеристики митохондрий печени и почек крыс.
Обнаружить функциональные проявления UCP2, используя в качестве тестовой системы ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов.
Дифференцировать активность разобщающих белков и ADP/ATP-антипортера с помощью высокоспецифичного ингибитора ANT карбоксиатрактилата (cAtr).
Для выявления защитного влияния UCP2 в митохондриях почек оценить ингибирующее действие пероксида водорода и супероксид-радикала на активность аконитазы (высокочувствительного к их действию фермента матрикса митохондрий) в препаратах митохондрий из печени и почек крыс.
5) Получить электрофоретически гомогенный препарат
сукцинатдегидрогеназы из различных источников и оценить возможность ее
ингибирования активными формами кислорода.
6) Сравнить уровень экспрессии мРНК для UCP2 в почках и печени, как в абсолютных значениях, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков (ADP/ATP-антипортера и цитохромоксидазы).
Научная новизна. Впервые показано, что в присутствии системы генерации супероксид-радикала (ксантина и ксантиноксидазы) действительно наблюдается разобщение дыхания, оцениваемое по увеличению начальной скорости дыхания, при одновременном небольшом подавлении максимальной скорости дыхания, а также падение мембранного потенциала внутренней митохондриальной мембраны. Установлено, что указанные изменения носят одинаковый качественный и количественный характер, как в митохондриях почек, так и в митохондриях печени крыс. Для оценки активации UCP2 использовали ингибирующее действие пуриновых нуклеотидов (ADP) на разобщающие белки. Чтобы дифференцировать вклад в разобщение UCP2 и ANT, был использован cAtr -высокоспецифичный ингибитор ANT. Снижение максимальной скорости дыхания препаратов митохондрий печени и почек указывает на повреждение супероксид-радикалом дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий. Нами показано, что, в условиях использования в качестве субстрата дыхания янтарной кислоты, это может объясняться ингибированием сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Данные о дифференциальной активности генов, кодирующих UCP2, ANT и цитохромоксидазу (СОХ), указывают на более низкую экспрессию мРНК для UCP2 в почках по сравнению с печенью, как в абсолютном значении, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков (ANT и СОХ). Изучение ингибирующего действия пероксида водорода и супероксид-радикала на активность аконитазы (АН) не выявило преимущественной устойчивости митохондрий почек по сравнению с митохондриями печени, которое могло бы быть обусловлено присутствием в митохондриях почек UCP2.
Полученные результаты позволяют предположить, что активирующее действие супероксид-радикала на UCPs зависит от физиологических условий, в которых находится ткань, и требует дополнительных изысканий. Ресопрягающий эффект пуриновых нуклеотидов, как в присутствии, так и в отсутствие супероксид-радикала, в митохондриях печени и почек крыс связан не с функционированием UCP2, а с их действием на ANT. Разобщение, наблюдаемое под действием супероксид-радикала в митохондриях почек крысы, может быть интерпретировано без привлечения модели М. Бранда, базирующейся на усилении под действием супероксид-радикала протонофорной активности UCP2.
Практическая значимость работы. Научно-практическая значимость полученных результатов состоит в первую очередь в диверсификации с нашей стороны существующих представлений о функциях тканеспецифических изоформ UCPs и осознании необходимости дальнейшего их исследования. Древнее происхождение и широкое распространение UCPs в клетках растений и животных говорит об их, безусловно, большом функциональном значении для эукариотических организмов. Соответственно раскрытие этих функций и
использование полученных знаний на практике чрезвычайно полезно для терапии и диагностики многих заболеваний, разработки лекарственных препаратов, ветеринарии и сельского хозяйства.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по "Биохимии", в спецкурсе "Метаболизм органических кислот", а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 9-й и 11-й Международной школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2007), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2004, 2005, 2006), Международной научной конференции "Современные проблемы адаптации и биоразнообразия" (Махачкала, 2008).
Публикации. Основные результаты представленной работы изложены в 10 публикациях - 2 статьях в рецензируемых научных изданиях, 6 статьях в сборниках научных работ, 2 тезисах докладов научных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (256 источников). Иллюстрационный материал включает 21 рисунок и 4 таблицы.
