Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Особенности протекания биохимических процессов при экспериментальном диабете 13
1.1.1. Сахарный диабет - болезнь обмена углеводов 13
1.1.2. Биохимические аспекты патогенеза сахарного диабета 13
1.1.3. Биохимические аспекты аллоксанового диабета 14
1.2. Трансформация основных запасающих веществ в животном организме 15
1.2.1. Катаболизм белков в тканях животных 15
1.2.2. Синтез и расщепление жирных кислот 16
1.2.3. Метаболизм углеводов 17
1.2.4. Трансформация липидов в гликоген в клетках высших животных и человека 19
1.3. Особенности глюконеогенетических процессов у животных... 25
1.3.1. Ультраструктурные изменения клеток животных при диабете и голодании 25
1.3.1.1. Взаимосвязь липидных включений с микротельцами, лизосомами и гликогеновыми отложениями 25
1.3.1.2. Роль аминотрансфераз в глюконеогенезе 27
1.3.2. Трансформация липидов в гликоген в клетках высших животных и человека 30
1.4. Глиоксилатный цикл как промежуточный этап глюконеогенеза 34
1.4.1. Распространение и локализация глиоксилатного цикла 35
1.4.2. Распространение глиоксилатного цикла у высших растений... 40
1.4.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных 42
1.4.4. Микротельца и их метаболическая функция 44
1.4.5. Роль микротелец в трансформации липидов в гликоген 49
1.4.6. Экспрессия и регуляция работы глиоксилатного цикла 55
Глава 2. Экспериментальная часть 60
2.1. Цель и задачи 60
2.2. Объекты и методы исследования 60
2.2.1. Объекты исследования 60
2.2.2. Методы исследования 61
2.2.2.1. Создание условий пищевой депривации и экспериментального диабета 61
2.2.2.2. Получение материалов различных тканей 61
2.2.2.3. Дифференциальное центрифугирование 61
2.2.2.4. Определение активности ферментов 61
2.2.2.5. Выделение и очистка ферментов 64
2.2.2.6. Экстракция 65
2.2.2.7. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 65
2.2.2.8. Гель-фильтрация 65
2.2.2.9. Ионообменная хроматография 66
2.2.2.10. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов 67
2.2.2.11. Аналитический электрофорез 67
2.2.2.12. Выделение РНК и проведение ПЦР 68
2.2.2.13. Контроль за индукцией диабета 69
2.2.2.14. Определение количества белка 70
2.2.2.15. Статистическая обработка данных 70
2.3. Полученные результаты и их обсуждение 71
2.3.1. Влияние индуцированного диабета на глюконеогенетические процессы 71
2.3.2. Динамика активности ферментов углеводного метаболизма... 73
2.3.3. Изменение активности Ал AT и Ac AT у крыс с диабетом 75
2.3.4. Активность ферментов катаболизма 76
2.3.5. Очистка изоцитратлиазы из печени крыс и изучение ее свойств 80
2.3.6. Физико-химические и регуляторные характеристики 86
2.3.7. Очистка и регуляторные свойства малатсинтазы 92
2.3.8. Регуляторные свойства малатсинтазы 101
2.3.9. Влияние метаболитов на активность малатсинтазы 108
2.4. Разработка праймеров и проведение ПЦР для идентификации гена изоцитратлиазы в геноме животных 111
Заключение 118
Выводы 121
Список использованной литературы 123
- Особенности протекания биохимических процессов при экспериментальном диабете
- Ультраструктурные изменения клеток животных при диабете и голодании
- Создание условий пищевой депривации и экспериментального диабета
- Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма является одной из важнейших задач современной биологии. Оно имеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться к пониманию механизмов функционирования организма, как целостной системы и, благодаря этому, создает условия для решения проблем, связанных с повышением устойчивости живых организмов к неблагоприятным факторам. В последние годы в этом направлении проводится немало исследований, но многие аспекты, связанные, например, с регуляцией и сопряжением отдельных процессов, изучены недостаточно. Это относится и к процессам глюконеогенеза, в частности, в период интенсивной мобилизации запасных жиров и функционирования глиоксилатного цикла.
Известно, что для функционирования глюконеогенетического
пути необходимо высокое содержание восстановленных
пиридиннуклеотидов и АТФ в клетке, тормозящее работу
электронтранспортной цепи митохондрий. В этих условиях
происходит индукция альтернативных окислительных процессов, в
частности, глиоксисомального окисления сукцината,
несопряженного транспорта электронов (Епринцев, Попов, 1999). Необходимость быстрой утилизации значительного количества
ацетил-СоА, образующегося при (3-окислении жирных кислот, требует активизации ферментов цикла Кребса и в случае глюконеогенеза глюкозо-1,6-бисфосфатазы.
Вопрос о превращении липидов в углеводы, и в частности в гликоген, в тканях животных и человека до настоящего времени является дискуссионным. Хотя возможность такого процесса и допускается, его механизм детально не исследован. Все еще высказываются сомнения по поводу превращения жиров в углеводы в организме млекопитающих. Правильное решение этого вопроса важно для понимания механизма патогенеза и поиска способов профилактики и лечения многих заболеваний обмена веществ.
В стрессовых ситуациях основным источником энергии и углерода являются нейтральные липиды. Образующиеся при липолизе жирные кислоты могут окисляться с помощью а, Р, со -окисления. Продуктами такого окисления являются ацетил-СоА, сукцинил-СоА и некоторые другие продукты. Ацетил-СоА преимущественно используется для поддержания энергетического гомеостаза за счет окисления в цикле Кребса. Однако, необходимость синтеза углеводов, концентрация которых в стрессовых условиях существенно снижается, приводит к индукции глиоксилатного цикла, трансформирующего ацетил-СоА в сукцинат. Считается, что в нормальных условиях ключевые ферменты
глиоксилатного цикла отсутствуют в тканях высших животных и обнаруживаются только в микроорганизмах и высших растениях. Однако, в недавних исследованиях, проведенных на нашей кафедре, было показано, что при патологических состояниях, к которым можно отнести голодание и диабет, наблюдается индукция изоцитратлиазной и малатсинтазной активностей.
Кроме того, в литературе отмечается важная роль аминотрансфераз в глюконеогенезе. Это относится, прежде всего, к ферментам метаболизма аспартата и аланина, легко мобилизуемых для биосинтетических процессов. Для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке, необходимо изучение всех метаболических путей, сопряженных с тем или иным веществом, исследование физических, химических и физиологических свойств отдельных ферментативных структур. В клетках углеводы образуются и утилизуются при работе ферментов, обеспечивающих функционирование центральных метаболических путей, то есть для решения проблемы поиска источников углерода для дополнительного биосинтеза углеводов в стрессовых воздействиях, приводящих к снижению их концентрации в клетке, необходимо проводить анализ взаимосвязи процессов дыхания, глюконеогенеза и синтеза аминокислот.
Множественность ферментативных реакций, связанных с глюконеогенетическими процессами, по-видимому, может обеспечивать тонкую регуляцию анаболических и катаболических процессов, поддерживающих внутриклеточный гомеостаз в условиях изменения окружающей среды. Изучение этих механизмов представляет большое значение для понимания механизмов адаптации к голоданию и индуцированному диабету.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение организации и ферментативной регуляции глюконеогенетических процессов в животных клетках в условиях голодания и индуцированного диабета.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:
1. Разработка экспериментальной модели диабета с
использованием инъекции индуктора диабета аллоксана
экспериментальным животным.
2. Показать возможность трансформации липидов в гликоген
при помощи глиоксилатного цикла в гепатоцитах голодающих крыс
и крыс, страдающих аллоксановым диабетом.
3. Изучить изменение активности ряда ферментов
глиоксилатного цикла, глюконеоненеза и аминотрансфераз при
голодании, их субклеточную локализацию, содержание в различных
тканях голодающих крыс.
Изучить изменение активности ряда ферментов глиоксилатного цикла, глюконеоненеза и аминотрансфераз при экспериментальном диабете, их субклеточную локализацию, содержание в различных тканях крыс с экспериментальным диабетом.
Разработать способы получения высокоочищенных препаратов ключевых ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы, изучить их кинетические характеристики.
6. Идентифицировать методом полимеразной цепной реакции
в гепатоцитах крыс генов, гомологичных изоцитратлиазе из
растений и микроорганизмов.
Научная новизна работы. В данной работе установлено, что в условиях пищевой депривации и экспериментального диабета в гепатоцитах крыс наблюдается индукция активности ферментов ЦТК, глиоксилатного цикла, глюконеогенеза и увеличение активности аминотрансфераз. Голодание и введение аллоксана вызывало снижение интенсивности гликолиза и окисления глюкозофосфатного пути. Показано, что активация глюконеогенеза в этих условиях происходит как за счет мобилизации запасных жирных кислот, так и за счет глюкогенных аминокислот.
Получение высокоочищенных препаратов изоцитратлиазы, малатсинтазы, индуцируемых голоданием или введением аллоксана, из животной ткани, позволило изучить их физико-химические свойства и показать участие сахарофосфатов, ионов металлов, рН-среды и некоторых интермедиаторов метаболизма на активность этих ферментов. Получена библиотека комплементарных ДНК из печени голодающих крыс и впервые с помощью полимеразной цепной реакции идентифицирован фрагмент матричной РНК, гомологичный консервативным участкам изоцитратлиазы из растений и микроорганизмов. Эти данные позволяют сделать вывод об участии широкого спектра метаболических процессов в адаптивной реакции животного организма, обеспечивающих энергетический и углеводный гомеостаз.
Практическая значимость исследования. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах сопряжения анаболических и катаболических процессов животной клетки. Разработанная схема выделения высокоочищенных препаратов изоцитратлиазы и малатсинтазы может быть использована для получения коммерческих препаратов ферментов, которые могут быть использованы в научно-исследовательских работах по изучению ферментативной кинетики и моделированию сопряженных
ферментных систем при стрессе, а также для микрохимических анализов в лабораторной практике. Разработанные методы позволяют обосновать применение в разгрузочно-диетической терапии (пищевой депривации) для профилактики и лечения болезней обмена веществ (ожирение, подагра, диабет). Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций при биохимии, спецкурсов по энзимологии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на региональных и университетских конференциях. Они были представлены на межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А.Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2000,2001,2002), межрегиональной конференции «Физиология и психофизиология мотиваций» (Воронеж, 2001), ежегодной научной сессии отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2000,2001,2002).
Публикации по теме дисертации. 1. Влияние ионов металлов на активность малатдегидрогеназы из бактерий рода Beggiatoa. / Степанова И.Ю., Парфенова Н.В.,
Зузу М., Епринцев А.Т. // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов.- Воронеж, 2001. Вып.З.- С. 109-112.
Проведение ПЦР для идентификации гена изоцитратлиазы в геноме животных / Зузу М., Москалев Е.А., Епринцев А.Т. // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. -Воронеж, 2002. Вып.4.- С.54-59.
Влияние кислородного стресса на углеводный метаболизм Beggiatoa / Степанова И.Ю., Зузу М., Фалалеева М.И., Епринцев А.Т. // Вестник ВГУ, серия химия, биология.-Воронеж: ВГУ, 2001.N2.-C.157-159.
Разработка праймеров и проведение ПЦР для идентификации гена изоцитратлиазы в геноме животных / Попов В.Н., Москалев Е.А., Зузу М., Шевченко М.Ю., Епринцев А.Т. // Вестник ВГУ. Серия биология, химия, фармация. -Воронеж: ВГУ, 2003.- С.74-80.
Выделение и очистка и свойства малатдегидрогеназы из Beggiatoa leptomitiformis I Епринцев А.Т., Фалалеева М.И., Степанова И.Ю., Парфенова Н.В., Зузу М. // Известия РАН. Серия биологическая. 2003. N3.- С.301-305.
Структура диссертации. Диссертационная работа включает 145 страниц, 15 рисунков, 14 таблиц. В работе использовано 187 литературных источников.
Особенности протекания биохимических процессов при экспериментальном диабете
В настоящее время следует признать, что сахарный диабет является полиэтиологическим, полипатогенетическим заболеванием, в основе которого лежит абсолютная (панкреатический диабет) или относительная (внепанкреатический диабет) инсулиновая недостаточность (Воробьева, 1982).
Повреждения глюкорецепторной системы При них невозможно "опознание" глюкозы и, следовательно, прекращается выброс инсулина в ответ на раздражение глюкозой мембраны бета-клеток островков Лангерганса (Балаболкин и др., 2001; Хромилин и др., 2001). - Повреждение механизма проницаемости мембран Повреждение механизма проницаемости кальция и сдвиг в отношении его к антагонисту магнию, затрудняет передачу информации от рецептора в клетку. Уровень кальция в клетке может снижаться под влиянием глюкагона, тиреокальциотонина и др. - Повреждение аденилатциклазной системы
Дефицит аденилатциклазы (либо АТФ, избыток фосфодиэстеразы, обусловливающий быстрый переход циклической 3,5-АМФ в 5-АМФ и ингибируемый теофелином), а также дефицит или избыток веществ, в том числе гормональных, изменяют активность этой системы. Наиболее характерен в этом отношении диабет, возникающий при введении аллоксана, угнетающего циклическую 3,5-АМФ (Хромилин и др., 2001; Rubin and Trealese, 1976; Дразнин, 1973). - Повреждения в системе гликолиза
Данные повреждения возникают из-за дефицита или избытка гормонов, патологии ферментных систем и их связей, нарушений электролитного обмена, главным образом калия, натрия и их антагониста лития.
Биохимические аспекты аллоксанового диабета
В 1943 г. Дипп с сотрудниками обнаружили, что введение аллоксана крысам и кроликам сопровождается развитием у них диабета, который можно назвать островковым. Он является следствием некроза бета-клеток островков Лангерганса и вызываемой таким путем первичной инсулиновои недостаточности. Большим преимуществом такого "химического" диабета является сохранение внешней секреции поджелудочной железы и нормальная продукция ее активных начал.
Следует иметь в виду, что диабетогенная доза аллоксана близка к токсической (для крыс 400-500 мг/кг при подкожном введении). Его токсичность возрастает при недостаточно полном освобождении препарата от аллоксантина и других продуктов превращения. Одним из проявлений токсического действия аллоксана служит недостаточность почек и гиперазотемия до 174 мг %, а также гипохромная анемия.
Механизм его действия еще недостаточно установлен. Одной из наиболее интересных является концепция Назарова, который считает, что аллоксан вызывает избирательное повреждение проницаемости бета-клеток вследствие его реакции с дитиоловыми группировками и с ионами металлов. Структура клеточной мембраны изменяется; в ней образуются пространства, через которые клетки теряют калий, коферменты и ферменты, а во внутрь их поступает экстрацеллюлярный натрий. Нарушается обмен в бета-клетках, и они погибают.
В настоящее время аллоксан является одним их наиболее широко используемых диабетогенных соединений.
Ультраструктурные изменения клеток животных при диабете и голодании
Н.П.Лебкова с соавторами (1984) отмечают, что у всех исследованных животных с аллоксановым диабетом обращало на себя внимание высокое содержание в кардиомиоцитах микротелец и особенно лизосом. Судя по тому, что скопления лизосом выявлялись в клетках с сохранной структурой остальных органелл, они не выполняли в данном случае протеолитической, деструктивной роли.
Авторы отмечают, что при диабете и голодании в кардиомиоцитах параллельно с накоплением гликогена увеличивается количество микротелец и лизосом. Гликогеновые гранулы скапливаются в различных участках саркоплазмы или аккумулируются внутри лизосомоподобных структур. Наряду с этим внутри лизосом и в контакте с ними встречаются резорбирующиеся липидные включения неправильной формы. Аналогичные комплексы из микротелец, лизосом, резорбирующихся липидных структур и гликогеновых скоплений с присутствием всех перечисленных компонентов или части из них наблюдались в гепатоцитах человека при холецистите и сочетании диабета с гепатитом, клетках коры надпочечников крыс при голодании, фибробластах регенерирующей кожи крыс после воздействия магнитного поля (Cambell et al., 1953).
Таким образом, наличие в клетках сердечной мышцы собак с диабетом большого количества гликогена и лизосом при единичных липидных включениях представляется не случайным, а обусловленным метаболическими процессами, связанными с трансформацией в гликоген поступающих из крови липидных метаболитов. Накопленный гликоген, вероятно, утилизируется гидролитическим путем. Об этом может свидетельствовать наличие очагов рассасывания гликогеновых скоплений около лизосом.
Превращение в миокарде избытка липидов в гликоген при диабете имеет определенное адаптивное значение. Таким способом создается резерв внутриклеточных углеводов при недостатке инсулина, необходимых для сжигания жиров, а также уменьшается возможность развития кетоза. Авторами был изучен только ранний срок диабета и неизвестна дальнейшая динамика описанных явлений у собак. Исследования на крысах со сроком диабета от шести месяцев до года показали отсутствие отложений гликогена в кардиомиоцитах. Отсюда можно предположить, что глюконеогенез из липидов имеет компенсаторное значение в начальный период развития диабета.
Одним из важных компонентов ответной реакции организма на стрессорные воздействия являются нарушения белкового метаболизма. Как известно, при действии на организм чрезвычайных факторов развивается комплекс биохимических изменений, проявляющихся, в частности, генерализованным катаболизмом белков органов и тканей, что рассматривается как адаптивная неспецифическая реакция, выработанная в процессе эволюции.
Изучение аминокислотного состава печени при тяжелой термической травме, острой кровопотере и гипокинезии выявило наличие определенных закономерностей. По данным авторов, после нанесения термической травмы, при клинических проявлениях шока в ткани печени существенно увеличивалось содержание всех аминокислот (Довганский и др., 1989). Представляет интерес оценка количественных изменений содержания свободных аминокислот, участвующих в глюконеогенезе (глицин, аланин, аспартат и глутамат). При гипокинезии их уровень, как правило, был понижен, при ожоговом поражении его изменения носили волнообразный характер. Кровопотеря характеризовалась прогрессирующим накоплением указанных аминокислот в ткани печени.
Можно полагать, что наблюдаемые в ранние сроки после острой кровопотери изменения пула глюкогенных аминокислот печени являются реакцией, отражающей активацию глюкогенеза как важного фактора поддержания энергообеспечения органа, да и организма в целом. В последующем она переходит в патологическую реакцию, и ресинтез глюкозы из аминокислот существенно нарушается.
Создание условий пищевой депривации и экспериментального диабета
Опытные животные выращивались на обычном рационе вивария, а затем помещались в условия пищевой депривации при свободном доступе к воде на срок до семи суток. Для индукции экспериментального диабета использовалось введение 200 мг аллоксана на 1 кг веса животного. Развитие диабета отслеживалось по содержанию глюкозы в плазме крови. Определения концентрации глюкозы в крови проводили стандартным методом с использованием глюкозооксидазы и пероксидазы (La Chema, Чехия).
Получение материалов различных тканей Для получения материалов различных тканей опытных животных предварительно усыпляли хлороформом и приводили декапитацию. По одному грамму печени, почки, сердца, мышцы, поджелудочной железы гомогенизировали в пяти мл среды выделения следующего состава: 50 ммоль/л Tris НС1 буфер с рН 7,5; 4 ммоль/л MgCb; 3 ммоль/л ДТТ и 2 ммоль/л ЭДТА.
Для осаждения клеточных стенок гомогенаты тканей подвергали дифференциальному центрифугированию при 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Для получения фракции цитозоля и митохондрий использовали центрифугирование при 10000 оборотов в минуту в течение 45 минут.
Активность ферментов определяли спектрофотометрически на СФ-46. Изоцитратлиазу (КФ 4.1.3.1) определяли при длине волны, равной 324 нм. Среда спектрофотометрирования: 50 ммоль/л Tris-HCl буфер с рН 7,5, 5 ммоль/л MgCl2, 4 ммоль/л ДТТ, 2 ммоль/л изоцитрат натрия, 4ммоль/л фенилгидразин солянокислый. Этот метод основан на образовании комплекса фенилгидразина с глиоксилатом, поглощающего при 324 нм. Активность фермента рассчитывают по формуле:
ФЕ = 0,18.D.V)/V2.T.M, где 0,18 - пересчетный коэффициент; D -прирост оптической плотности при 324 нм; Vi - полный объем вытяжки, мл; V2-объем внесения, мл; Т -время, мин; М -белокв мг.
Малатсинтазу (КФ 4.1.3.2) определяли спектрофотометрически при 412 нм по формированию комплекса Со А и дитионитробензойной кислоты. Среда спектрофотометрирования: 50 ммоль/л Tris-HCl буфер с рН 7,5, 150 мкмоль/л ацетил-СоА, 1 ммоль/л ДТНБ, 2 ммоль/л глиоксилат.
Сукцинатдегидрогеназу (КФ 1.3.99.1) определяли феназин-метасульфатным методом. При этом использовали среду состава: 50 ммоль/л Tris-HCl буфер с рН 7,5, 1 ммоль/л сукцината; 0,002% ДХФИФ, 0,03% ФМС, 2 ммоль/л азид Na. Для определения активности фермента использовали искусственные акцепторы электронов с подходящим RED/ОХ потенциалом и удобными спектральными свойствами (ДХФИФ и ФМС). Об активности фермента судили по падению оптической плотности при 600 нм (максимум поглощения для ДХФИФ), обусловленному обесцвечиванием акцептора в ходе его восстановления. За единицу активности фермента принимали количество фермента, превращающего один микромоль сукцината в минуту при 25 градусах Цельсия.
Фумаратгидратазу (КФ 4.2.1.2) определяли при 240 нм в среде инкубации следующего состава: 50 ммоль/л Tris-HCl буфер с рН 7,5, 0,12 ммоль/л фумарат или малат. Метод основан на разности поглощения лучей при 240 нм фумаратом по сравнению с малатом.
Каталазу (КФ 1.11.1.6) определяли при длине волны, равной 230нм в среде инкубирования состава: 50 ммоль/л Tris-HCl буфер с рН 7,5, Н2О2-3%. Лактатдегидрогеназу (КФ 1.1.1.27) определяли при длине волны 340нм.
Аспартатаминотрансферазу (КФ 2.6.1.1) определяли при 520 нм спектрофотометрически. Среда спектрофотометрирования содержала: субстрат АсАТ (0,1 ммоль/л фосфатный буфер, 0,2 ммоль/л L-аспартат, 2 ммоль/л 2-оксоглутарат), 2,4-динитрофенилгидразин (1 ммоль/л раствор в 1 моль/л НС1), раствор NaOH /45/. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислот в щелочной среде. Гидразон ПВК, возникающий при самопроизвольном декарбоксилировании оксалоацетата, обладает более высокой оптической плотностью.
Аланинаминотрансферазу (КФ 2.6.1.2) определяли при длине волны 520 нм. Состав среды спектрофотометрирования: субстрат АлАТ (0,1 ммоль/л фосфатный буфер, 0,2 моль/л DL-oc-аланин, 2 ммоль/л 2-оксоглутарат), 2,4-динитрофенилгидразин (1 ммоль/л раствор в 1 моль/л НС1), раствор NaOH. Определение основано на измерении оптической концентрации гидразонов 2-оксоглутаровой и ПВК в щелочной среде. Гидразон ПВК обладает более высокой оптической плотностью.
Активность фруктозо-1,6-бисфосфатазы определяли с помощью дополнительных ферментов фосфоглюкоизомеразы и глюкозо-6 фосфатдегидрогеназы по восстановлению NADP+ при 340 нм в среде, содержащей 50 мМ трис-HCl буфер (рН 7.5), 200 мкМ фруктозо-1,6 бисфосфат, 1 мМ MgCl2, 150 MKMNADP+, З ФЕ фосфоглюкоизомеразы и З ФЕ глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Романова, 1985). Активность ФЕП карбоксикиназы определяли в среде содержащей 3 мМ фосфоенолпируват, 1 мМ GDP, 10 мМ НС03" , 150 мкМ NADH и З ФЕ малатдегидрогеназы.
Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов
Электрофоретическое исследование проводили по методу Девиса и Орнстейна (Davis, Ornsttin, 1959) на приборе фирмы "Reanal". Разделение белкового раствора осуществляли на разделяющем (мелкопористом) геле, который содержал 7,5% полиакриламида. Применение концентрирующего (крупнопористого) геля, содержащего 2% акриламида, обеспечивало концентрацию белка. Растворы мелко-и крупнопористого гелей готовили, как описано у Мауэра (1971). Разделение исследуемых белков проводили в основной буферной системе, рН 8,9. Для контроля за движением фронта вносили в верхний резервуар прибора 1 мл 0,1% раствора бромфенол синего. Исследуемый образец, объемом не более 0,1 мл, наносили на гель вместе с 40% раствором сахарозы (объем 0,1 мл). Раствор сахарозы является антиконвекционной средой. Электрофоретическое разделение белков проводили на холоду (0 +2). Для этого подавали постоянный электрический ток в первые 30 минут - 1 мА, а впоследствие 2-2,5 мА на трубочку. Электрофорез продолжался, как правило, 2-2,5 часа.
Для определения гомогенности очищенной ИЦЛ наносили на одну трубочку исследуемый раствор, содержащий 15-30 мкг белка. После электрофореза вынутые из трубочек гели окрашивали универсальным красителем на белки - кумасси голубым, для чего гели выдерживали в 0,1% растворе этого красителя, приготовленном на 7% уксусной кислоте, в течение 1,5-2 часов. Впоследствии краситель отмывался в 7% -ном растворе уксусной кислоты многократной сменой ее в течение 2-3 суток.
Эксперимент осуществляли в несколько этапов: экстракция суммарной РНК из животных тканей, обратная транскрипция мРНК и ПЦР-амплификация участка гена ИЦЛ.
Для выделения тотальной РНК использовали метод фенол-хлороформной экстракции РНК (REF). Для гомогенизации 1 г ткани использовали 10 мл среды, содержащей 42,6% гуанидин тиоцианат, 0,75 М цитрат натрия (рН 7), 10% саркозил, 2 мМ 2-меркаптоэтанол. К полученному гомогенату добавляли 1 мл 2 М ацетата натрия (рН 4), 10 мл водонасыщенного фенола, 2 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (49:1). Отделение РНК от ДНК и белка проводили центрифугированием смеси при 10000 g в течение 20 минут. Водную фазу переносили в чистую пробирку и добавляли 10 мл изопропанола. Смесь инкубировали при -20С в течение 1 часа. Осадок РНК собирали центрифугированием при 10000 g (20 мин, 4 С). Препарат РНК ресуспендировали в 3 мл среды для гомогенизации. Для повышения степени чистоты РНК добавляли один объём изопропанола и повторяли последний этап. Полученный осадок ресуспендировали в 75% этаноле, осаждали центрифугированием. РНК высушивали при комнатной температуре и растворяли в 30 мкл деионизованной воды.
Визуализацию результатов экстракции РНК проводили с помощью формальдегидного электрофореза в 1 %-агарозном геле.
К суммарной РНК (1-0,2 мкг) добавляли 4 мкл 5-кратного буфера, содержащего 250 мМ Tris-HCl (рН 8,3), 375 мМ КС1, 15 мМ MgCl2, 50 мМ DTT, и 1 мкл 2 мМ раствора dNTP. Смесь доводили деионизованной водой до суммарного объёма 15 мкл и инкубировали 3 мин при 60 С. Затем прибавляли 2 мкл раствора олиго-dT праймера, 1 мкл раствора РНазина, 2 мкл раствора MuLV-RT обратной транскриптазы. Проводили инкубацию смеси при 37 С 1ч и при 42 С последующие 30 мин в амплификаторе ДНК фирмы Biometra.
Результат обратной транскрипции визуализировали с помощью агарозного гель-элекрофореза ДНК в 1%-агарозном геле. Для идентификации гена изоцитратлиазы использовали метод полимеразнои цепной реакции (Mullis) со специально синтезированными дегенерированными праймерами.
Состав реакционной смеси: 1 мкл ДНК-пробы, 5 мкл ПНР буфера (100 мМ Tris-HCl, рН 8,3, 500 мМ КС1), по 1 мкл раствора праймера 1 и праймера 2, 1 мкл 2мМ раствора dNTP, 1 мкл 50 мМ раствора MgS04, 0,5 мкл Thermostar Taq-полимеразы (20 ед/мкл), 39,5 мкл деионизованной воды. Температура отжига праймеров для кДНК махаона и T.tubifex 49 С, для кДНК крыс - 47-53 С.
