Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время важнейшим направлением современной биохимии является исследование функционирования отдельных звеньев клеточного метаболизма при патологических состояниях, что способствует выяснению молекулярных основ патогенеза многих заболеваний. Согласно современным представлениям, интенсификация свободнорадикальных процессов является одним из ведущих механизмов клеточной патологии, включая сердечно -сосудистые заболевания, аутоиммунные болезни, хронические воспаления, нейродегенеративные заболевания и другие (Бурлакова Е.Б., 1980; Владимиров Ю.А., 1972). В основе развития ряда заболеваний печени также лежит нарушение баланса между интенсивностью процессов свободнорадикального окисления (СРО) и активностью антиоксидантной системы организма (АОС) (Ланкин В.З., 1984; Stadtman E.R., 2000). Активные формы кислорода (АФК) выполняют важную роль в жизнедеятельности, однако при интенсификации их образования происходит усиление процессов СРО, что сопровождается нарушениями в свойствах биомембран, функционирования клеточного метаболизма и приводит к гибели клеток (Федорова Н.Ю., 1999; Владимиров Ю.А., 1991).
Защита от разрушающего действия свободных радикалов осуществляется неферментативным и ферментативным звеньями АОС, важное место в которой отводится глутатионредуктазной/глутатионпероксидазной (ГР/ГП) системе. Глутатионпероксидаза (ГП; К.Ф. 1:11.1.9.) катализирует реакцию детоксикации органических и неорганических пероксидов без образования свободных радикалов, используя в качестве донора водорода восстановленный глутатион (rSH) (Кулинский В.И., 1990). Активность ГП существенно зависит от концентрации данного субстрата, а следовательно от активности глутатионредуктазы (ГР) и уровня НАДФН в клетке (Pangili Е., 1991). ГП находит широкое применение в научно-исследовательской практике, являясь удобным объектом изучения механизмов компенсации дезадаптационных сдвигов на уровне отдельных антиоксидантных ферментов, что представляет как самостоятельный научный интерес, так и служит ключом к пониманию роли происходящих метаболических изменений при интенсификации СРО (Каминный А.П., 2000; Пашков А.Н., 2005). К настоящему времени изучены физико-химические свойства ГП, выделенной из ряда организмов, в норме (Esnjrthy R.S., 1991; Hill T.D., 1989). Однако, такой аспект, как особенности функционирования фермента при патологии, в частности, при заболеваниях печени и действии веществ - протекторов остается не изученным. Вместе с тем, существенный интерес представляет поиск средств, способных воздействовать на компоненты АОС и повышать резистентность организма к повреждающему действию свободных радикалов в патологическом состоянии. Перспективными в этом отношении являются тиоктовая кислота (ТК) и восстановленный глутатион (rSH), но их влияние на регуляцию активности ферментов АОС, и в частности ГП, остаются не исследованными. Антиоксидантный эффект ТК обусловлен наличием двух тиоловых групп в молекуле, а также способностью связывать радикалы и ионы металлов, предотвращая их участие в СРО. Антиоксидантный эффект TSH заключается в обезвреживании перекисей и гидроксильных радикалов. Являясь одним из важнейших компонентов системы антиоксидантной защиты клетки, TSH не только напрямую реагирует с радикалами в неэнзиматических реакциях, но и служит донором электронов при восстановлении клеточных пероксидов.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование каталитических свойств и регуляции активности ГП из печени крыс в норме, при токсическом гепатите и введении веществ - протекторов: ТК и TSH, при патологии. В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Определение активности и субклеточной локализации ГП из печени крыс в норме,
при развитии токсического гепатита и действии веществ - протекторов: ТК и TSH.
2. Получение гомогенных ферментных препаратов ГП из печени контрольных
животных, крыс, подвергнутых токсическому гепатиту, и животных, которым при
патологии вводили вещества - протекторы.
Сравнительная характеристика кинетических параметров каталитического действия ГП из печени крыс в норме, в условиях развития оксидативного стресса, вызванного введением ССІ4, и действия веществ - протекторов при патологии.
Изучение участия ионов металлов и нуклеотидфосфатов в регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК hTSH.
Исследование регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении веществ - протекторов под действием метаболитов цикла Кребса.
Изучение участия интермедиатов пентозофосфатного пути (ПФП) в регуляции активности ГП из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК и TSH при патологии.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование особенностей регуляции активности ГП в условиях развития токсического гепатита у экспериментальных животных, а также при действии веществ - протекторов в патологическом состоянии. Разработаны способы очистки и получены гомогенные препараты ГП из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым при развитии патологии вводили вещества - протекторы. Впервые дана сравнительная характеристика каталитических и регуляторных свойств ГП в норме, при токсическом поражении печени и действии ТК и TSH. Полученные данные свидетельствуют, что контроль образования АФК может осуществляться за счет изменения активности ГП, взаимосвязанного с модификацией кинетических
9-І-
свойств и регуляции активности фермента под действием ионов металлов (Fe , Fe +, Са+, Си ), интермедиатов цикла Кребса, пентозофосфатного пути, нуклеотидфосфатов. Полученные данные способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений о регуляции генерирования АФК с помощью ключевого фермента антиоксидантной системы в условиях развития токсического гепатита и действия веществ - протекторов.
Практическая значимость. Изучение метаболитной регуляции ГП в условиях экспериментального токсического гепатита и действия веществ - протекторов может играть существенную роль в понимании развития патологического процесса и поиске путей его коррекции в медицинской практике. Разработанные способы получения гомогенной ГП могут применяться для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Гомогенная ГП может быть использована для решения актуальных проблем молекулярной биологии в области разработки методов многопараметрического анализа (биочипов), направленных, кроме диагностики различных заболеваний человека, на выявление токсических компонентов в окружающей среде, а также для прерывания процессов самоокисления и стабилизации мембран липосом (Cheng W.H., 2003; Варфоломеев С.Д., 1997).
Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», «Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами В ГУ.
Результаты работы использованы при выполнении исследований по ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы» (РНП. 2.1.1.4429).
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении
диссертационной работы, представлены на I Всероссийской молодежной
медицинской конференции студентов и молодых ученых «Экстремальные и
терминальные состояния» (Омск, 2006), на научно-практической конференции
«Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология,
здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2006), на 20-м съезде
физиологического общества им. И.П. Павлова РАН (Москва, 2007), на 3-ей Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ (Воронеж, 2007), на международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Н.П. Огарёва, (Саранск, 2008), на научно-практической конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболевай человека» Российской академии естествознания, 2008.
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 8 публикациях - в 3 статьях и 5 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
Активность ГП в печени крыс, возрастающая при ЭТГ, изменяется в сторону нормы при введении животным веществ - протекторов (ТК и TSH), что не сопряжено с модификацией таких характеристик фермента как молекулярная масса, субъединичная структура, электрофоретическая подвижность, субклеточная локализация.
С использованием гомогенных ферментных препаратов ГП показано, что в условиях патологии и действия веществ - протекторов изменяются кинетические параметры каталитического действия фермента (Км, температурный и рН-оптимумы, энергия активации). Введение ТК и TSH животным приводит к приближению данных показателей к контрольным значениям.
При интоксикации крыс ССІ4 и введении животным веществ - протекторов имеет место ряд особенностей регуляции активности ГП под действием ионов
о і "3-1- 9-І- 9 I
металлов (Fe , Fe , Са ,Cu ), интермедиатов цикла Кребса и пентозофосфатного пути, нуклеотидфосфатов. Ряд модификаций регуляторных свойств ГП, характерных для фермента из пораженной гепатотоксином печени, такие как стимуляция активности 6 - фосфоглюконатом, 2 - оксоглутаратом, уменьшение чувствительности
9-І-
к ингибирующему действию ионов Си , АМФ могут способствовать увеличению активности фермента при патологии.
4. С учётом полученных данных о функционировании ГП в печени крысы в
условиях токсического поражения и действия веществ - протекторов предложена
гипотетическая схема, отражающая регуляцию активности данного фермента,
обеспечивающего контроль интенсивности СРО.
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 173 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы (253 источника) и приложения. Иллюстративный материал включает 39 рисунков и 7 таблиц. В приложении содержатся 18 рисунков и 1 таблица.
