Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем биохимии в настоящее время является исследование функционирования ферментов центрального метаболизма при патологиях, сопряженных с окислительным стрессом, в частности, поражениях печени различной этиологии (Федорова Н.Ю., 1999; Пашков А.Н. [и др.], 2005; Андреещева Е.М., 2002). К ксенобиотикам с высокой степенью избирательной гепатотоксичности относят хлорированные углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан. Отравление экспериментальных животных этим ксенобиотиком по морфологической характеристике и биохимическим изменениям близко к острым поражениям печени у человека. Имеются данные, что в результате введения четыреххлористо-го углерода наблюдается усиление свободнорадикальных процессов в печени (Zhu W., Fung Р.С., 2000; Андреещева Е.М.; 2002, Попова Т.Н. [и др.], 2008).
Предполагается, что одним из механизмов подавления процессов свобод-норадикального окисления (СРО) в митохондриях может служить ингибирова-ние ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) (Skulachev V.P., 1997). Установлено, что при экспериментальной ишемии миокарда (ЭИМ) крыс снижается активность НАД-малатдегидрогеназы (Сафонова О.А., 2004) и ако-нитатгидратазы (Медведева Л.В., 2002).
В этой связи вызывает интерес функционирование НАД-зависимой ма-латдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37; НАД-МДГ) в условиях экспериментального токсического гепатита (ЭТГ). Митохондриальная форма фермента (мНАД-МДГ) катализирует в ЦТК обратимое превращение малата в оксалоацетат (ОА). Цитоплазматическая форма НАД-МДГ (цНАД-МДГ) участвует в обеспечении транспорта метаболитов между клеточными компартментами (Ленинджер А., 1985). Имеются данные о значительной роли субстрата МДГ - малата, в биохимической адаптации организма к гипоксии (Глотов Н.А., 1973), а также его участии в транспорте низкомолекулярного антиоксиданта - цитрата, через биологические мембраны (Robinson В.Н., Olei J., 1975). Кроме того, нельзя исключить, что НАДФН, образующийся в реакции, катализируемой НАДФ-зависимой МДГ (КФ 1.1.1.82; НАДФ-МДГ), может быть дополнительным источником восстановительных эквивалентов для глутатионредуктаз-ной/глутатионпероксидазной (ГР/ГП) антиоксидантной системы (АОС). Ранее было показано, что в качестве дополнительного поставщика НАДФН в клетке, помимо ключевого фермента пентозофосфатного пути - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, могут выступать другие ферменты, например, НАДФ-специфичная изоцитратдегидрогеназа (НАДФ-ИДГ) (Медведева Л.В., 2002) и НАДФ-МДГ (Сафонова О.А., 2004).
Таким образом, исследование особенностей каталитического действия НАД- и НАДФ-зависимых малатдегидрогеназ из гепатоцитов крыс при ЭТГ может иметь значение для понимания процессов, происходящих в клетках печени, в условиях интенсификации СРО, вызванного введением гепатотоксина, а также способствовать поиску возможных путей коррекции данного патологического состояния.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось исследование каталитических свойств и регуляции активности НАД- и НАДФ-МДГ из печени крыс при ЭТГ. В связи с целью работы были поставлены следующие за-
4 дачи: 1) определение активностей и субклеточной локализации НАД- и НАДФ-МДГ в клетках печени в норме и при токсическом гепатите; 2) получение высо-коочищенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-зависимых МДГ из печени крыс в норме и при патологии; 3) исследование кинетических параметров каталитического действия НАД- и НАДФ-МДГ из печени контрольных животных и крыс, подвергшихся воздействию CCU; 4) сравнительная характеристика регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ из гепатоцитов крыс в норме и при патологии; 5) создание схемы, отражающей особенности функционирования НАД- и НАДФ-МДГ в условиях токсического гепатита.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование функционирования НАД- и НАДФ-МДГ в печени крыс в условиях увеличения интенсивности процессов СРО при ЭТГ. Разработаны процедуры выделения и получены гомогенные препараты различно локализованных форм НАД-МДГ и НАДФ-МДГ из печени крыс в норме и при патологии. Впервые дана сравнительная характеристика каталитических свойств и регуляции активности данных ферментов в печени в норме и при токсическом гепатите. Выявлено изменение активности, а также кинетических и регуляторных свойств мНАД-МДГ. Установлено, что активности цитоплазматической НАД-МДГ и НАДФ-МДГ при патологии не имеют достоверных отличий от контрольных значений. Но, несмотря на стабильность активности данных ферментов, в условиях развития токсического гепатита для них характерны особенности каталитического действия.
Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о функционировании НАД- и НАДФ-МДГ в условиях нормы и патологии. Особенности функционирования данных ферментов в условиях токсического гепатита способствуют пониманию развития патологического процесса и поиску путей его коррекции в медицинской практике.
Разработанные способы получения высокоочищенных препаратов НАД-и НАДФ-МДГ из гепатоцитов крыс могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами.
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 12ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2008), международной научной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2008), международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины» (Москва, 2008), VIII съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, 2008), II съезде Российского общества медицинской элементологии (РОСМЭМ) (Тверь, 2008), международной студенче-
5 ской биологической конференции при Ереванском государственном университете (Ереван, 2009), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2009» (Пермь, 2009), 13-м международном симпозиуме студентов-биологов «Симбиоз-Россия 2009» (Казань, 2009), ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 15 публикациях - 7 статьях и 8 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
1. При токсическом гепатите происходит снижение активности митохон-
дриальной НАД-МДГ в печени крыс на 13%, что может быть сопряжено с тор
можением ЦТК, способствующем подавлению свободнорадикальных процес
сов. Цитоплазматическая форма НАД-МДГ не изменяет своей активности и, по-
видимому, не участвует в лимитировании СРО биосубстратов. При этом как
для мНАД-МДГ, так и для цНАД-МДГ характерны значительные изменения
кинетических и регуляторных свойств: сродства к субстрату, степени субстрат
ного ингибирования, чувствительности к воздействию ионов Fe , Си , ряда
интермедиатов цикла Кребса, глутатиона, АТФ, АДФ. Ингибирующие эффекты
АТФ, АДФ и фумарата на мНАД-МДГ, возникающие при патологии, очевидно,
могут способствовать снижению активности фермента.
2. Активность НАДФ-МДГ при токсическом поражении печени крыс
остается стабильной, что, по-видимому, связано с высокой активностью в гепа-
тоцитах ферментов пентозофосфатного пути, обеспечивающего генерирование
НАДФН для глутатионовой АОС. Однако при патологии имеют место измене
ния сродства к субстрату и коферменту, а также ряд особенностей регуляции
активности под действием некоторых метаболитов ЦТК, аденозинфосфатов,
ионов Fe , Си , Са .
Субклеточная локализация, молекулярная масса, субъединичная структура, электрофоретическая подвижность НАД- и НАДФ-МДГ из печени крыс не изменяются в условиях развития ССІ4-индуцированного гепатита.
Предложена схема, отражающая особенности функционирования ми-тохондриальной и цитоплазматической НАД-МДГ и цитоплазматической НАДФ-МДГ под влиянием различных факторов при токсическом поражении печени крыс.
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 182 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы (270 источников) и приложения. Иллюстративный материал включает 53 рисунка и 13 таблиц. В приложении содержатся 19 рисунков.
