Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. Молекулярные механизмы токсического поражения печени и методы его медикаментозной коррекции 16
1.1. Общие представления о механизмах гепатотоксического действия химических веществ 16
1.2. Характеристика физико-химических свойств четыреххлористого углерода. Механизм его гепатотоксичности. Влияние CCU на протекание обменных процессов в организме 26
1.3. Фармакотерапия заболеваний гепатобилиарной системы 28
2. Материалы и методы, используемые в собственных исследованиях 40
2.1. Характеристика экспериментальных животных 40
2.2. Методика создания модели токсического поражения печени 41
2.3. Патогистологическое исследование печени крыс 41
2.4. Биохимические методы исследования 41
2.4.1. Определение концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови методом Ендрассика-Грофа 41
2.4.2. Определение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови унифицированным методом Райтмана-Френкеля 42
2.4.3. Определение активности аспартатаминотрансферазы (ACT) в сыворотке крови унифицированным методом Райтмана-Френкеля 42
2.4.4. Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-ГТП) в сыворотке крови унифицированным колориметрическим методом 43
2.4.5. Определение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови унифицированным методом 43
2.4.6. Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом 44
2.4.7. Определение концентрации пировиноградной кислоты (ПВК) в сыворотке крови модифицированным колориметрическим методом Умбрайта 44
2.4.8. Определение концентрации молочной кислоты в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом 44
2.4.9. Определение содержания общего белка в сыворотке
крови 45
2.4.10. Определение содержания альбумина в сыворотке крови...45
2.4.11. Определение белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом Олла и Маккорда в модификации С.А. Карпюка 45
2.4.12. Определение содержания общего холестерина (ОХС) в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом 46
2.4.13. Определение содержания холестерина липротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП) в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом 46
2.4.14. Определение содержания триацилглицеринов в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом 47
2.4.15. Определение концентрации ХС ЛПОНП и ХС ЛПНП в сыворотке крови расчетным методом 47
2.4.16. Определение содержания эфиров холестерина (ЭХС) и неэтерифицированного холестерина (НЭХС) в сывороткекрови 47
2.4.17. Использование коэффициентов атерогенности для оценки патологии липидного обмена в условиях токсического поражения печени 48
2.4.18. Определение содержания ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП) в сыворотке крови 48
2.4.19. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) в гемолизате эритроцитов 49
2.4.20. Определение активности каталазы в гемолизате эритроцитов 49
2.4.21. Определение содержания гемоглобина (НЬ) в гемолизате эритроцитов гемиглобинцианидным методом 49
2.5. Методика исследования липидов эритроцитов методом высокоэффективной тонкослойной хроматогафии (ВЭТСХ) 50
2.5.1. Экстракция липидов из эритроцитов 52
2.5.2. Фракционирование общих липидов эритроцитов 52
2.5.3. Фракционирование фосфолипидов эритроцитов 53
2.6. Методы извлечения и изучения химических свойств липидов из продуктов растительного происхождения с предполагаемыми гепатопротективными свойствами 54
2.6.1. Определение йодного числа в липидных экстрактах 55
2.6.2. Определение массовой доли неомыляемых липидов в экстрактах 56
2.6.3. Определение жирнокислотного состава липидных экстрактов методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) 56
2.7. Модельные системы перекисного окисления липидов, применяемые для оценки антиоксидантной активности исследуемых продуктов растительного происхождения в опытах in vitro 57
2.7.1. Приготовление липосом 57
2.7.2. Определение содержания ТБК-РП в суспензии липосом 57
2.7.3. Оценка эффективности антиоксидантного действия исследуемых продуктов растительного происхождения 58
2.7.4. Исследованные в модельных системах in vitro продукты растительного происхождения 59
2.8. Статистические методы исследования 59
3. Биохимические показатели крови лабораторных животных при формировании модели токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода 62
3.1. Маркеры нарушений функции печени и активности патологического процесса 62
3.2. Морфологические изменения паренхимы печени, возникающие при введении лабораторным животным тетрахлорметана 65
3.3. Интенсивность протекания процессов свободнорадикального окисления и состояние ферментов антирадикальной защиты крови при моделировании острого токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода : 69 '
3.4. Особенности изменения параметров липидного обмена у лабораторных животных при моделировании острого токсического поражения печени, вызванного четыреххлористым углеродом 72
3.5. Особенности изменения параметров углеводного и белкового обменов у лабораторных животных при моделировании острого токсического поражения печени, вызванного четыреххлористым углеродом 80
4. Анализ химического состава продуктов растительного происхождения с предполагаемыми гепатопротективными свойствами 86
5. Изучение антиоксидантных свойств исследуемых продуктов растительного происхождения в опытах in vitro 94
6. Коррекция метаболических процессов, возникающих при экспериментальном токсическом поражении печени, с помощью растительных масел и препарата фосфоглив 99
6.1. Выраженность гепатопротекгивных свойств растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив в условиях острого токсического поражения печени 99
6.2. Влияние некоторых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на интенсивность протекания процессов свободнорадикального окисления и состояние ферментов антирадикальной защиты крови при моделировании острого токсического поражения печени 102
6.3. Влияние некоторых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на липидный обмен крыс в условиях острого токсического поражения печени 104
6.4. Влияние некоторых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на параметры углеводного и белкового обменов крыс с моделью токсического поражения печени 112
Заключение 118
Выводы 126
Список использованной литературы 128
Приложения 167
- Общие представления о механизмах гепатотоксического действия химических веществ
- Маркеры нарушений функции печени и активности патологического процесса
- Изучение антиоксидантных свойств исследуемых продуктов растительного происхождения в опытах in vitro
- Влияние некоторых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на липидный обмен крыс в условиях острого токсического поражения печени
Введение к работе
Актуальность исследования. Печень является барьером на пути всех чужеродных веществ, попадающих в организм человека [А.Е.Вермель, 2005; С.А.Белякин и соавт., 2011]. Изменение активности печеночных ферментов ведет к снижению детоксикационной функции печени. На фоне этого чужеродные вещества могут оказывать значительное воздействие на печень, приводящее к формированию ее токсического поражения [A.M.Di Bisceglie et al., 2007; Н.И.Калетина, 2008; В.С.Камышников, 2009; С.А.Белякин, А.Н.Бобров, С.В.Плюснин, 20116]. В связи с этим проблема изучения молекулярных механизмов регуляции функциональной активности печени и ее метаболической адаптации к воздействию токсических агентов остается важным направлением современной экспериментальной и клинической гепатологии [С.А.Белякин, А.Н.Бобров, С.В.Плюснин, 2011а].
Лечение поражений печени средствами, обладающими антиоксидантными и гиполипидемическими свойствами, широко исследуется в настоящее время [В.И.Пилипенко и соавт., 2008; В.М.Покровский, О.Г.Компаниец, 2008; Л.В.Кравченко и соавт., 2008]. Особое место в профилактике и лечении гепатитов занимает использование фосфолипидных концентратов и растительных масел, обогащенных полиненасыщенными жирными кислотами и жирорастворимыми витаминами [Л.Б.Стрелкова и соавт., 2008; Е.А.Сухосырова, З.К.Никитина, М.Б.Яковлева, 2008; И.В.Шилова и соавт., 2008; В.В.Амосов и соавт., 2009].
В современной литературе обсуждаются эффекты как широко известных препаратов природного происхождения на основе фосфолипидов (ФЛ) и триацилглицеринов (ТАГ) (эссенциале, фосфоглив, эссливер, омакор), так и менее известных (льняное масло, пальмовое масло), содержащих в своем составе полиненасыщенные жирные кислоты, жирорастворимые витамины и другие соединения, нормализующие метаболические процессы в печени и восстанавливающие целостность мембран гепатоциатов [Н.Б.Демина и соавт., 2007; Ж.Б.Дашинамжилов и соавт., 2008; С.Н.Жаров, Б.И.Санин, 2009].
Однако как известные соединения, широко применяющиеся в настоящее время в медицине, так и менее распространенные на российском рынке препараты изучены не в полной мере. В этой связи представляется актуальным исследование по уточнению биохимических механизмов гепатопротективного действия известных лекарственных средств, а также по обнаружению и исследованию механизма действия новых гепатопротекторов.
Цель исследования: подобрать наиболее эффективные гепатопротекторы растительного происхождения и дать сравнительную биохимическую характеристику выраженности их метаболических эффектов в эксперименте, используя модель токсического поражения печени.
В связи с поставленной целью необходимо решить следующие задачи:
-
Дать сравнительную биохимическую характеристику выраженности метаболических нарушений, возникающих у экспериментальных животных (крыс) при создании токсического поражения печени, вызванного воздействием четыреххлористого углерода.
-
Провести сравнительное изучение химического состава и физико-химических свойств различных липофильных продуктов растительного происхождения с известными и предполагаемыми гепатопротективными свойствами, используя современные методы количественного анализа.
-
Оценить в искусственно созданных модельных тест-системах in vitro антиоксидантную и антирадикальную активность изучаемых продуктов.
-
Изучить выраженность гепатопротективных свойств исследуемых растительных продуктов у экспериментальных животных, подвергнутых интоксикации четыреххлористым углеродом.
-
Оценить состояние ферментов антирадикальной защиты, активность процессов перекисного окисления липидов, направленность изменений липидного, углеводного и белкового спектров сыворотки крови при экспериментальном токсическом гепатите на фоне приема тестируемых растительных продуктов.
-
С учетом полученных данных дать рекомендации по эффективному
использованию различных продуктов растительного происхождения, обладающих гепатопротективными свойствами, для лечения заболеваний печени.
Научная новизна. Проведен комплексный анализ выраженности нарушений в обмене липидов, углеводов, белков и в системе про-/антиоксиданты, возникающих у экспериментальных животных при моделировании токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода.
В рамках представленного исследования впервые проведено сравнительное изучение липидного состава и физико-химических свойств новых растительных масел (черного и грецкого орехов).
Впервые на большом экспериментальном материале проведено сравнительное изучение антиоксидантной активности различных продуктов растительного происхождения с известными и предполагаемыми гепатопротективными свойствами на доклиническом этапе с применением липосомальной модельной тест-системы.
Впервые доказано наличие гепатопротективных свойств у некоторых растительных масел (черного и грецкого орехов, льняного), исследована выраженность их гепатопротективного эффекта.
Научно-практическая значимость работы. В ходе проведенного исследования изучены растительные масла, обладающие выраженными гепатопротективными свойствами, описан их химический состав и основные метаболические эффекты, что позволяет рекомендовать их для лечения токсического поражения печени у человека.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Введение в организм лабораторных животных (крыс) четыреххлористого углерода способствует выраженному повреждению мембран гепатоцитов, активации процессов липопероксидации, дисбалансу в работе ферментантивного звена антиоксидантной системы организма, нарушению метаболизма липидов, белков, углеводов.
-
Первичный скрининг липофильных продуктов растительного
происхождения, основанный на анализе их химического состава и антирадикальной активности в опытах in vitro, является эффективным инструментом для поиска новых гепатопротекторов.
-
Использование льняного масла, масел черного и грецкого орехов, а также препарата фосфоглив для лечения токсического поражения печени способствует снижению интенсивности процессов липопероксидации, нормализации работы ферментов антирадикальной защиты, восстанавливает нарушения липидного, белкового и углеводного обменов, что позволяет рекомендовать исследуемые продукты для лечения токсического гепатита.
-
Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на II съезде физиологов СНГ (Кишенев, Молдова, 2008); 15 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Краснодар, 2008); Научно-практической конференции стоматологических кафедр КГМУ «Вопросы организации и образования в стоматологии» (Краснодар, 2009); на III съезде физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 2 статьи в центральной медицинской печати, рекомендованной Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 166 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 18 рисунками, содержит 21 таблицу. Список литературы включает 309 источников, из них 260 отечественных и 49 иностранных авторов.
Общие представления о механизмах гепатотоксического действия химических веществ
Оценить состояние ферментов антирадикальной защиты, активность процессов перекисного окисления липидов, направленность изменений липидного, углеводного и белкового спектров сыворотки крови при экспериментальном токсическом гепатите на фоне приема тестируемых растительных продуктов.
С учетом полученных данных дать рекомендации по эффективному использованию различных продуктов растительного происхождения, обладающих гепатопротективными свойствами, для лечения заболеваний печени.
Научная новизна. Проведен комплексный анализ выраженности нарушений в обмене липидов, углеводов, белков и в системе про-/антиоксиданты, возникающих у экспериментальных животных при моделировании токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода.
В рамках представленного исследования впервые проведено сравнительное изучение липидного состава и физико-химических свойств новых растительных масел (черного и грецкого орехов).
Впервые на большом экспериментальном материале проведено сравнительное изучение антиоксидантной активности различных продуктов растительного происхождения с известными и предполагаемыми гепатопротективными свойствами на доклиническом этапе с применением липосомальной модельной тест-системы. Впервые доказано наличие гепатопротективных свойств у некоторых растительных масел (черного и грецкого орехов, льняного), исследована выраженность их гепатопротективного эффекта. Научно-практическая значимость работы. В ходе проведенного исследования изучены растительные масла, обладающие выраженными гепатопротективными свойствами, описан их химический состав и основные метаболические эффекты, что позволяет рекомендовать их для лечения токсического поражения печени у человека. Основные положения, выносимые на защиту 1. Введение в организм лабораторных животных (крыс) четыреххлористого углерода способствует выраженному повреждению мембран гепатоцитов, активации процессов липопероксидации, дисбалансу в работе ферментативного звена антиоксидантной системы организма, нарушению метаболизма липидов, белков, углеводов. 2. Первичный скрининг липофильных продуктов растительного происхождения, основанный на анализе их химического состава и антирадикальной активности в опытах in vitro, является эффективным инструментом для поиска новых гепатопротекторов. 3. Использование льняного масла, масел черного и грецкого орехов, а также препарата фосфоглив для лечения токсического поражения печени способствует снижению интенсивности процессов липопероксидации, нормализации работы ферментов антирадикальной защиты, восстанавливает нарушения липидного, белкового и углеводного обменов, что позволяет рекомендавать исследуемые продукты для лечения токсического гепатита. Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на П съезде физиологов СНГ (Кишенев, Молдова, 2008); 15 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Краснодар, 2008); Научно-практической конференции стоматологических кафедр КГМУ «Вопросы организации и образования в стоматологии» (Краснодар, 2009); на Ш съезде физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011). Сведения о практическом использовании результатов исследования На основании полученных данных предложены практические рекомендации по использованию результатов исследования в качестве ранних, достоверных диагностических и прогностических тестов для оценки тяжести метаболических нарушений и контроля лечения при остром токсическом поражении печени, а также использованию масел льна, черного и грецкого орехов для комплексного патогенетического лечения больных токсическим поражением печени на кафедре клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России (350063, г.Краснодар, ул.Седина, 4); на кафедре фармации ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России (350063, г.Краснодар, ул.Седина, 4); в ГУЗ «Клинический госпиталь для ветеранов войн» (350063, г.Краснодар, ул. Кирова, 9). Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций, на теоретических и практических занятиях при обучении студентов, клинических интернов, ординаторов и аспирантов на кафедрах ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России: фундаментальной и клинической биохимии, общей и клинической патофизиологии, клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС, фармации. По результатам исследования опубликовано 13 печатных работ, из них 2 в научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Маркеры нарушений функции печени и активности патологического процесса
В настоящее время известны два механизма гибели клеток: некроз и апоптоз [A.Canbay, S.Friedman, GJ.Gores, 2004; Г.К.Мироджов и соавт., 2005; Д.М.Фалер, Д.С.Шилдс, 2006; В.Бойчук и соавт., 2007]. Основными этапами некроза являются повреждение плазматической мембраны, набухание митохондрий, потеря внутриклеточных компонентов, дезинтеграция ядра с последующим фагоцитозом погибших гепатоцитов. , Некротическая смерть клетки сопровождается развитием активного ! воспалительного процесса и повреждениями окружающих тканей [A.Cardenas, V.Arroyo, 2005; A.Cardenas, P.Gines, 2005; В.Н.Перфилова и соавт., 2006; СВ.Бойчук и соавт., 2007; В.Н.Перфилова и соавт., 2007]. Непосредственной причиной некроза являются: активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), формирование окислительного стресса, образование соединений ксенобиотиков с биологически важными макромолекулами, повреждение митохондрий, разрушение цитоскелета, массивный выход кальция и другие факторы. Благодаря уникальной способности печени к регенерации, некротические клетки через несколько дней уничтожаются и заменяются новыми, восстанавливается архитектоника и функции печени. Если количество поврежденных гепатоцитов слишком велико, способность печени к самовосстановлению подавляется, что ведет к разрушению органа [С.К.Курбанов, 2003; В.А.Мышкин и соавт., 2004; С.С.Перцов, Г.В.Пирогова, 2004; О.П.Молодых и соавт., 2007; Г.Д.Миронова и соавт., 2008; Е.В.Копляк и соавт., 2008].
Механизмы возникновения некроза гепатоцитов различаются в зависимости от типа токсина. Так, при отравлении четыреххлористым углеродом возникает нарушение функционирования ферментных систем эндоплазматического ретикулума. В других случаях дистрофические изменения гепатоцитов при воздействии аллилового спирта, четыреххлористого углерода связаны с усилением перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов. При воздействии тяжелых металлов патогенез повреждения связан с блокадой функционально активных сульфгидрильных (SH) групп ферментов [Н.И.Калетина, 2008; П.В.Корой, 2008].
Апоптоз — генетически запрограммированный процесс самоуничтожения клетки. Апоптоз запускается через специальные рецепторы на поверхности клетки или нерецепторным путем, что ведет к активации регуляторных белков, которые останавливают митотическую активность клетки, вызывают фрагментацию дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (эндонуклеазы), деградацию жизненно важных белков (каскад протеолитических ферментов, каспаз), нарушают связь клетки с внеклеточным матриксом. Ранним проявлением апоптоза являются падение электрохимического потенциала митохондриальной мембраны и повышение продукции активных форм кислорода (АФК) [J.Kountouras, D.Chatzopoulos, C.Zavos, 2003; C.J.Chen, H.I.Yang, J.Su, 2006; Т.Г.Сазонтова, Ю.В.Архипенко, 2007]. Морфологически апоптоз характеризуется образованием мембранных пузырей, агрегацией хроматина вблизи ядерной мембраны, конденсацией и фрагментацией клетки с образованием апоптотических телец с последующим их фагоцитозом. В отличие от некроза, при апоптозе не возникает выраженной воспалительной реакции. Различия между некрозом и апоптозом на стадии их инициирования не столь очевидны, и одни и те же факторы (например, АФК, оксид азота (П)) могут стимулировать оба процесса. Гепатотоксиканты вызывают гибель клеток по механизму как некроза, так и апоптоза [M.Valentovic et al., 2004; М.Н.Ходосовский, 2006; А.А.Обухов, Е.С.Зыкова, Д.А.Косенков, 2007; Д.А.Мискевич и соавт., 2007; М.Г.Авдеева, И.Н.Бондаренко, И.Р.Передирий, 2008; Н.Ф.Кушнерова, Ю.А.Рахманин, 2008; В.И.Петухов и соавт., 2008].
Существенное значение для реализации токсического действия ксенобиотиков имеет состояние ферментных систем, участвующих в их метаболической активации и детоксикации. Генетически детерминированный или измененный вследствие индукции или ингибирования набор изоферментов цитохрома Р450, ферментов конъюгации может объяснить различную индивидуальную чувствительность к действию гепатотоксикантов. Показано, что гепатоциты крыс с высокой активностью цитохрома Р45о2Е1 более чувствительны к четыреххлористому углероду и парацетамолу, чем клетки ; с низкой активностью. Индукторы этого фермента (этанол, ацетон, голодание) усиливают, а ингибиторы (диэтилдитиокарбамат и диметилсульфоксид) ослабляют токсичность этих веществ [I.Colle, F.Durand, 2002; M.Christensen, R.N.Andersson, Per M.D.Dalen, 2003; T.Rylander-Rudqvist, S.Wedren, F.Granath, 2003; J.Yilleneuve, V.Pichette, 2004; С.ДЛодымова, 2005; R.J.Colonno, R.E.Rose, C.Baldick, 2006; В.Т.Ивашкин, М.В.Маевская, 2007; Е.Б.Меныцикова и соавт., 2008; В.А.Миханов, 2008; В.Ю.Серебров и соавт., 2008,2009].
По мнению ряда авторов, предшествующее повреждение печени алкоголем, вирусной инфекцией повышает чувствительность к гепатотропным ядам. Токсический эффект усиливается при бактериальной инфекции, дефиците белков в пище [E.Akriviadis, R.Botla, W.Briggs, 2000; T.Zhang, Y.Li, J.Lai, 2003; О.Л.Арямкина, 2005; АБ.Ведерникова и соавт., 2007; С.Н.Мехтиев и соавт., 2008].
Гистологические изменения зависят от дозы, химической структуры и путей поступления гепатотоксичного веществ. Выявляют широкий спектр дистрофических изменений гепатоцитов: баллонную или жировую дистрофию, центролобулярный некроз гепатоцитов, заканчивающиеся при исключении гепатотропных факторов восстановлением нормальной структуры печени. Массивные и субмассивные некрозы паренхимы, наблюдающиеся при острых отравлениях, могут вести к формированию мультилобулярного цирроза печени [Ю.А.Кравчук и соавт., 2004; В.Е.Жерновков, Н.П.Пальмина, 2007; М.Ю.Хотимченко, Е.А.Коленченко, 2007; Д.В.Гарбузенко, 2008].
Изучение антиоксидантных свойств исследуемых продуктов растительного происхождения в опытах in vitro
В процессе метаболизма в клетках постоянно образуются токсичные активные формы кислорода. АФК способны инициировать в организме реакции свободнорадикального окисления, вызывающие повреждение различных белков и пептидов, азотистых оснований и нуклеиновых кислот, липидов и других биомолекул.
При различных патологических изменениях в организме в силу тех или иных причин развивается дисбаланс между интенсивностью свободнорадикальных процессов и функциональной активностью АОС. Указанный дисбаланс играет ключевую роль в развитии таких широко распространенных заболеваний как гепатит, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, нейродегенеративные заболевания, диабетические ангиопатии, катаракта, некоторые формы рака, болезнь Дауна, аутоиммунные заболевания. В то же время, у некоторых лекарственных препаратов, используемых для терапии указанных заболеваний, были обнаружены прооксидантные свойства. Тот факт, что нарушения, баланса интенсивности СРО и функционального статуса АОС широко встречаются при патологии, а также возможность значительного отягощения течения любого заболевания усилением интенсивности СРО диктуют необходимость поиска путей диетологической и фармакологической коррекции нарушений указанного баланса.
Указанные предпосылки определяют актуальность целенаправленного поиска антиоксидантов с конкретными мишенями действия и определенными особенностями проявления антиоксидантных свойств. Важным этапом такого поиска является скрининг химических соединений, позволяющий отобрать антиоксиданты с определенным набором свойств, заданных целями работы.
Изучение особенностей влияния на интенсивность ПОЛ отобранных для исследования растительных масел и лекарственных препаратов показало наличие у них антиоксидантных свойств (табл. 5.1; 5.2). Исследуемые продукты достоверно снижали содержание ТБК-РП в липосомах в течение первых 12 часов окисления, но при большей длительности процесса ПОЛ выраженность антиоксидантного действия заметно снижалась, а у ретинола проявлялись прооксидантные свойства.
Высокая антиоксидантная активность исследуемых продуктов на начальном этапе ПОЛ согласуется с известными данными о механизме антиоксидантного действия химических соединений, содержащих в своем составе ненасыщенные связи (фосфолипиды, триглицериды, жирорастворимые витамины и др.). Имея в своем составе реакционноспособные двойные связи, они перехватывают свободные радикалы - инициаторы ПОЛ, конкурируя за них с молекулами липидов и тем самым защищая последние от интенсивного окисления. Однако такая ситуация сохраняется лишь до тех пор, пока содержание антиоксиданта. описанного типа достаточно для перехвата основного количества образующихся в ходе СРО радикалов. После истощения пула антиоксидантов с ненасыщенными связями скорость СРО существенно возрастает. Кроме того, при определенных условиях продукты окисления самих антиоксидантов этой группы могут вовлекаться в дальнейшее развитие реакций СРО, что определяет наличие у антиоксидантов с ненасыщенными связями прооксидантных свойств. По-видимому, отсутствие у растительных масел и фосфолипидных концентратов прооксидантных свойств было обусловлено наличием в их составе различных конпонентов, обладающих антиоксидантными свойствами.
В целом, по величине антиоксидантного эффекта исследуемые продукты можно расположить следующим образом: ретинола ацетат оливковое масло кукурузное масло подсолнечное масло эссливер форте эссенциале форте масло грецкого ореха фосфоглив масло черного ореха льняное масло. В связи с этим для дальнейших исследований были отобраны четыре наиболее перспективных продукта (льняное масло, масло черного и грецкого орехов, фосфоглив), обладающие наиболее выраженными антиоксидантными свойствами.
Согласно проведенному нами исследованию (табл. 6.1), на фоне лечебного введения экспериментальным животным изучаемых растительных продуктов, наблюдалась общая тенденция к уменьшению активности индикаторных ферментов печени в сыворотке крови.
Так, под действием масел черного и грецкого ореха наблюдалось снижение активности ACT на 32,0% (р 0,001) и 27,6% (р 0,001), а АЛТ на 20,5% (р 0,001) и 13,7% (р 0,001) соответственно по сравнению с данными, полученными в группе крыс не подвергнутых лечению. Активность у-ГТП у животных IVА группы снизилась на 41,3% (р 0,001), а у крыс IVЕ группы - на 39,8% (р 0,001) по сравнению с данными, полученными в III опытной группе. В сыворотке крови животных, получавших в качестве лечебного средсвтва масло черного ореха также было зарегистрировано незначительное снижение активности ЩФ (на 1,7%, р 0,02) по сравнению с данными, полученными в группе животных с токсическим поражением печени не подвергнутых лечению.
При использовании в качестве лечебного средства препарата фосфоглив активность ACT в сыворотке крови снижалась на 46,5% (р 0,001), АЛТ - на 30,9% (р 0,001), у-ГТП - на 49,5% (р 0,001), ЩФ - на 1,6% (р 0,02) по сравнению с данными, полученными в ІП опытной группе.
Влияние некоторых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на липидный обмен крыс в условиях острого токсического поражения печени
Особый интерес представлял анализ жирнокислотного состава ранее практически не изученных масел черного и грецкого орехов. К особенностям их жирнокислотного состава следует отнести высокое содержание линолевой кислоты (более 60%) как у подсолнечного масла. Масло черного ореха, по сравнению с маслом грецкого ореха, содержало больше олеиновой жирной кислоты. В отличие от оливкового масла орехи содержали в значительно большем количестве полиненасыщенные линолевую и линоленовую кислоты, и значительно уступали в доле мононенасыщенной олеиновой кислоты. По содержанию линолевой жирной кислоты масла черного и грецкого орехов также превосходили масла подсолнечника и кукурузы.
Используемые в данном исследовании фосфолипидные концентраты широко распространены на российском рынке. Основу их составляют фосфолипиды (преимущественно фосфатидилхолин), получаемые из сои. Их жирнокислотный состав представлен полиненасыщенными жирными кислотами, в основном линолевой (около 70%) кислотой Согласно приведенным данным, препараты Эссенциале форте Н и Эссливер форте имели одинаковый химический состав и кроме фосфолипидов содержали комплекс водо- и жирорастворимых витаминов. Содержание фосфолипидов в составе препарата Фосфоглив было значительно ниже, чем в других фосфолипидных концентратах, однако в данное лекарственное средство входила глицирризиновая кислота, обладающая противовоспалительными свойствами, а также за счет детергентного действия обеспечивала эмульгирование фасфатидилхолина в кишечнике, что усиливало его переваривание и всасывание.
Изучение особенностей влияния на интенсивность ПОЛ отобранных для исследования растительных масел и лекарственных препаратов показало наличие у них антиоксидантных свойств. Исследуемые продукты достоверно снижали содержание ТБК-РП в липосомах в течение первых 12 часов окисления, но при большей длительности процесса ПОЛ выраженность антиоксидантного действия заметно снижалась, а у ретинола проявлялись прооксидантные свойства.
Высокая антиоксидантная активность исследуемых продуктов на начальном этапе ПОЛ согласуется с известными данными о механизме антиоксидантного действия химических соединений, содержащих в своем составе ненасыщенные связи (фосфолипиды, триглицериды, жирорастворимые витамины и др.). Имея в своем составе реакционноспособные двойные связи, они перехватывают свободные радикалы - инициаторы ПОЛ, конкурируя за них с молекулами липидов и тем самым защищая последние от интенсивного окисления. Однако такая ситуация сохраняется лишь до тех пор, пока содержание антиоксиданта описанного типа достаточно для перехвата основного количества образующихся в ходе СРО радикалов. После истощения пула антиоксидантов с ненасыщенными связями скорость СРО существенно возрастает. Кроме того, при определенных условиях продукты окисления самих антиоксидантов этой группы могут вовлекаться в дальнейшее развитие реакций СРО, что определяет наличие у антиоксидантов с ненасыщенными связями прооксидантных свойств. По-видимому, отсутствие у растительных масел и фосфолипидньгх концентратов прооксидантных свойств было обусловлено наличием в их составе различных компонентов, обладающих антиоксидантными свойствами.
В целом, по величине антиоксидантного эффекта исследуемые продукты можно расположить следующим образом: ретинола ацетат оливковое масло кукурузное масло подсолнечное масло эссливер форте эссенциале форте масло грецкого ореха фосфоглив масло черного ореха льняное масло. В связи с этим для дальнейших исследований были отобраны четыре наиболее перспективных продукта (льняное масло, масло черного и грецкого орехов, фосфоглив), обладающие наиболее выраженными антиоксидантными свойствами.
Согласно проведенному нами исследованию, на фоне лечебного введения экспериментальным животным изучаемых растительных продуктов, наблюдалась общая тенденция к уменьшению активности патологического процесса в печени. Все исследуемые масла (черного и грецкого орехов, льна), а также препарат фосфоглив проявили выраженные гепатопротективные свойства, регистрируемые на основании снижения активности ряда индикаторных (АЛТ, ACT) и экскреторных (у-ГТП, ЩФ) ферментов печени, а также снижения концентрации билирубина в \ сыворотке крови крыс. Использование указанных растительных продуктов,; способствовало уменьшению выраженности цитолитического, холестатического и токсического синдромов у лабораторных животных. По степени выраженности гепатопротективных свойств растительные продукты можно расположить в следующем порядке: фосфоглив льняное масло масло черного ореха = масло грецкого ореха.
При введении изучаемых продуктов растительного происхождения в организм животных с моделью острого токсического поражения печени, было обнаружено снижение содержания ТБК-РП в плазме крови, а также выраженная тенденция к нормализации работы ферментов первой и второй линий антирадикальной защиты, что отражало процесс инактивации процессов ПОЛ в периферических тканях и органах. Наиболее выражен этот эффект был в группе IVr.
Липидный спектр крови крыс с моделью токсического поражения печени под воздействием растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив также имел тенденцию к восстановлению. Уровень ТАГ повышался, а содержание ОХС снижалось в сыворотке крови крыс всех опытных группах по сравнению с группой сравнения. При анализе распределения ХС между ЛП частицами отмечалось снижение его содержания в проатерогенной фракции ЛПНП. В эритроцитах крыс IVА, IVЕ, IVB, IVr групп под действием растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив происходило насыщение эритроцитов ФЛ, замещение СМ на ФХ, и ФС на ФЭА, уменьшение доли ЛФХ и ЛФЭА. Что характеризует процессы улучшения их реологических свойств, увеличение текучести мембраны, нормализации ее проницаемости. Наиболее выражены описанные изменения были в группе крыс получавших льняное масло (IVr группа).
