Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Цитохром Р450 - ключевой фермент микросомальной монооксигеназной системы ... 12
1.1.1 Способность цитохромов Р450 к индукции 15
1.2 Цитохромы Р450 подсемейства 2В 18
1.3 Индукция генов CYP2B под действием фенобарбитала 20
1.3.1 Механизм активации генов CYP2B под действием фенобарбитала 21
1.3.2 Характеристика дистального промотора генов CYP2B 22
1.3.3 CAR и другие белки, взаимодействующие с элементами дистального промотора генов СУР2В 24
1.3.4 CAR рецептор-опосредованная сигнальная трансдукция и индукция генов CYP2B 28
1.3.5 Участие коактиваторов в CAR-опосредованной активации экспрессии генов CYP2B 30
1.3.6 Характеристика проксимального промотора генов CYP2B 30
1.3.7 Белок, взаимодействующий с проксимальным промотором генов CYP102 и CYP106 Bacillus megaterium 31
1.3.8 Белки, взаимодействующие с проксимальным промотором генов CYP2B млекопитающих 32
1.3.9 Вклад проксимального и дистального промоторов в общий механизм индукции генов CYP2B 34
1.3.10 Другие регуляторные элементы генов CYP2B 35
1.4 Индукция активности CYP2B под действием индукторов ФБ-типа 38
Заключение 40
ГЛАВА 2. Материал и методы 41
2.1 Материалы 41
2.2 Методы 42
2.2.1 Животные 42
2.2.2 Выделение микросом печени животных 43
2.2.3 Определение концентрации белка в микросомах 44
2.2.4 Определение общего содержания цитохрома Р450 в микросомах печени 44
2.2.5 Определение каталитической активности CYP2B 45
2.2.6 Определение каталитической активности CYP3А 45
2.2.7 Метаболизм тестостерона 46
2.2.8 Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях 46
2.2.9 Полусухой электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану 47
2.2.10 Иммунохимический анализ белков микросом 47
2.2.11 Выделение суммарной клеточнойРНК 48
2.2.12 Электрофорез РНК в частично денатурирующих условиях 48
2.2.13 Определение концентрации РНК в образце 48
2.2.14 Реакция обратной транскрипции 49
2.2.15 Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) 49
2.2.16 Анализ продуктов ПЦР 51
2.2.17 Выделение ядер из печени крыс 51
2.2.18 Выделение белковых экстрактов ядер 51
2.2.19 Определение количества белка в белковых экстрактах ядер 52
2.2.20 Включение метки в 5-концы ДНК с помощью полинуклеотидкиназы бактериофага Т4 52
2.2.21 Метод задержки ДНК-белковых комплексов в геле 53
2.2.22 Статистическая обработка данных 53
ГЛАВА 3. Результаты 54
3.1 Межвидовые особенности индукции активности CYP2B 54
3.1.1 Межвидовые различия в индукции микросомальной монооксигеназной системы в печени крыс и кроликов под действием 2,4,6- трифенилдиоксана-1,3 54
3.1.2 Экспрессия генов CYP2B в печени крыс и мышей под действием индукторов фенобарбиталового типа 57
3.1.3 Исследование влияния индукторов на образование комплексов ядерных белков с регуляторным элементом NR1 PBREM 59
3.2 Исследование роли последовательности Барби-бокс в индукции экспрессии генов CYP2B 61
3.2.1 Динамика образования ДНК-белковых комплексов с последовательностью Барби- бокс в печени крыс при индукции 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом 61
3.2.2 Экспрессия генов CYP2B в печени крыс в зависимости от времени действия 2,4,6-
трифенилдиоксана-1,3 и фенобарбитала 64
3.3 Влияние ингибиторов Ser/Thr протеинкиназ и протеинфосфатаз на индукцию активности CYP2B 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом в печени крыс 66
3.3.1 Ферментативная активность CYP2B в печени крыс 66
3.3.2 Иммуноблот-анализ микросомальных белков CYP2B 68
3.3.3 Анализ экспрессии генов CYP2B в печени крыс при совместном введении ингибиторов и индукторов 70
3.3.4 Анализ экспрессии гена рецептора CAR в печени крыс при совместном введении ингибиторов и индукторов 73
3.3.5 Исследование образования комплексов ядерных белков с регуляторным элементом NR1 генов CYP2B 74
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 76
Заключение 89
Выводы 90
Список цитируемой литературы 91
- Цитохром Р450 - ключевой фермент микросомальной монооксигеназной системы
- Другие регуляторные элементы генов CYP2B
- Межвидовые различия в индукции микросомальной монооксигеназной системы в печени крыс и кроликов под действием 2,4,6- трифенилдиоксана-1,3
- Анализ экспрессии генов CYP2B в печени крыс при совместном введении ингибиторов и индукторов
Введение к работе
Цитохром Р450 (CYP), представленный мультигенным суперсемейством, является одним из ключевых ферментов микросомальной монооксигеназной системы, ответственной за метаболизм ксенобиотиков и эндогенных соединений в живых организмах (Ляхович, Цырлов, 1978). Важнейшим свойством множественных форм цитохрома Р450 является их способность к индукции, то есть к усилению ферментативной активности фермента при воздействии соответствующего ксенобиотика. В целом, индукция активности цитохрома Р450 представляет собой механизм защиты клетки от чужеродных соединений, обычно приводящий к детоксификации ксенобиотиков (Poster, Coon, 1991). Однако существует и другой результат такого процесса. Так, метаболизм лекарств, а также многих эндогенных соединений, включая простагландины, жирные кислоты и гормоны, может драматично меняться из-за индукции активности различных форм цитохрома Р450.
В настоящее время изучение механизмов индукции активности молекулярных форм CYP является одним из активно развивающихся направлений в современной молекулярной биологии, биохимии, токсикологии и фармакологии. Однако знания, касающиеся механизмов индукции, ограничены несколькими членами суперсемейства цитохрома Р450, хотя транскрипционный механизм активации показан для большинства подсемейств (Whitlock, 1990). Известно, что гены этих ферментов активируются с участием различных ядерных рецепторов, которые под действием ксенобиотика-лиганда, как правило, либо транслоцируются из цитоплазмы в ядро, либо активируются в ядре, где они, образуя гетеродимеры со своими ядерными партнерами, взаимодействуют с генами-мишенями (Handschin, Meyer, 2003).
Среди множества форм этого фермента выделяют подсемейство CYP2B, которое участвует в биотрансформации лекарств, таких как циклофосфамиды (Chang et al., 1997), а также в метаболизме пестицида метоксихлора (Dehal, Kupfer, 1994) и некоторых промутагенов, в том числе афлатоксина В1 и специфичных для табака нитрозоаминов (Code et al., 1997). Большинство проведенных исследований свидетельствует о том, что индукция CYP2B преимущественно регулируется на транскрипционном уровне (Waxman, 1999; Honkakoski, Negishi, 2000), хотя показана возможность посттрансляционной модификации белковой молекулы, вызванной воздействием индуктора (Bartlomowicz et al., 1989; Oesch-Bartlomowicz et al., 2001). Известно, что регуляция транскрипции осуществляется за счет взаимодействия специфичных ядерных белков с различными регуляторными зонами генов CYP2B. В составе регуляторных последовательностей генов CYP2B были идентифицированы так называемые проксимальный и дистапьный промоторы, участвующие в индукции экспрессии этих генов под действием фенобарбитала (ФБ), классического индуктора этого подсемейства (Czekaj, 2000).
Значительный прогресс в понимании механизмов активации генов CYP2B был достигнут с идентификацией конститутивного андростанового рецептора (CAR). Так, при исследовании механизма индукции активности CYP2B фенобарбиталом было показано, что в цитоплазме гепатоцитов происходит активация рецептора CAR, после чего он транслоцируется в ядро, где связывается с ядерным белком RXR (ретиноидный X рецептор). Сформировавшийся гетеродимерный комплекс взаимодействует с элементом PBREM дистального промотора, что является необходимым для инициации транскрипции (Pascussi et al., 2004). Такой механизм индукции экспрессии генов CYP2B фенобарбиталом является на сегодняшний день общепринятым. Однако, несмотря на интенсивные исследования, детально механизм, по которому индукторы инициируют транслокацию CAR в ядро, на сегодняшний день до конца не ясен, хотя показано, что прямое связывание рецептора с лигандом не является необходимым для транслокации рецептора в ядро (Moore et al., 2000). Было выдвинуто предположение, что транслокация рецептора в ядро контролируется запуском процессов фосфорилирования/ дефосфорилирования белков, но единой картины о роли этих процессов пока не сложилось (Corcos, Lagadic-Gossman, 2001). Наряду с этим, в литературе есть данные о вовлечении в механизм индукции проксимального промотора через активацию не идентифицированных пока ядерных белков (Honkakoski, Negishi, 1998).
В лаборатории молекулярных механизмов канцерогенеза ИМББ СО РАМН (г. Новосибирск) ведутся исследования индуцирующего действия 2,4,6- трифенилдиоксана-1,3 (ТФД). Преимущество этого соединения состоит в том, что его эффективная доза на порядок меньше, чем у фенобарбитала. В экспериментах in vitro было показано, что 2,4,6-трифенилдиоксан-1,3 и фенобарбитал активируют разные ядерные белки, способные взаимодействовать с последовательностью Барби-бокс проксимального промотора (Grigorieva et al., 2002). Однако значение и взаимное влияние различных ядерных белков, активирующихся под действием индукторов ФБ-типа in vivo, на данный момент не известны. Кроме того, эффект ТФД видоспецифичен: он активирует CYP2B у крыс, но не у мышей (Мишин и др., 1990). Причина видоспецифичных различий в индукции активности этого цитохрома Р450 остается неизвестной.
Изложенное выше определило цель работы: исследовать молекулярные механизмы индукции CYP2B в печени экспериментальных животных, обработанных индукторами фенобарбиталового типа.
Для достижения цели решались следующие задачи:
Изучить индуцирующее действие ТФД на монооксигеназную систему печени крыс и кроликов.
Определить относительное содержание мРНК CYP2B и сур2Ь в печени крыс и мышей, обработанных индукторами ФБ-типа: ФБ, ТФД и ТСРОВОР
Исследовать образование комплексов ядерных белков с элементом NR1 регуляторной последовательности PBREM гена CYP2B в печени крыс и мышей при индукции ФБ, ТФД и ТСРОВОР.
Исследовать динамику образования комплексов ядерных белков с последовательностью Барби-бокс проксимального промотора и относительное содержание мРНК CYP2B в печени крыс при индукции 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом in vivo (40 мин, Зч, 6ч, 18ч).
Исследовать влияние ингибиторов Ser/Thr протеинкиназ и протеинфосфатаз на ферментативную активность и содержание белков CYP2B в печени крыс при индукции 2,4,6-трифенилдиоксаном-1,3 и фенобарбиталом.
Определить относительное содержание мРНК CYP2B, CAR и исследовать образование комплексов ядерных белков с элементом NR1 регуляторной последовательности PBREM в печени крыс при совместном и раздельном введении ингибиторов и индукторов.
Научная новизна работы
Показаны видоспецифичные различия в индукции ТФД CYP2B у крыс и кроликов. ТФД является высокоспецифичным индуктором CYP2B изоформы у крыс и CYP2C изоформы у кроликов.
Показано, что основой межвидовых особенностей в индукции CYP2B являются различия в механизмах активации транскрипции у крыс и мышей.
Показано, что на ранних этапах индукции происходит активация ядерных белков, способных связываться с элементом Барби-бокс проксимального промотора генов CYP2B в печени крыс. В течение первых 6-ти часов индукции наблюдаются различия в динамике образования ДНК-белковых комплексов для каждого соединения. К 18-ти часам картина интенсивности комплексов становится одинаковой как при индукции ФБ, так и ТФД. Несмотря на то, что индукторы различной химической структуры по-разному активируют такое связывание, этот процесс сопровождается включением транскрипции генов.
В результате данного исследования показано существование зависимых от индуктора путей активации генов CYP2B в печени экспериментальных животных. Впервые показано, что ингибирование Са /кальмодулин-зависимого сигнального пути существенно усиливает ферментативную активность и содержание белков CYP2B при индукции ТФД, но не ФБ в печени крыс, причем этот эффект реализуется на уровне транскрипции генов.
Научно-практическая значимость
По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование молекулярных механизмов индукции CYP2B в печени экспериментальных животных под действием индукторов ФБ-типа. Полученные результаты показали, что при исследовании механизмов активации генов важно рассматривать не только рецепторный механизм, но и участие специфических сигнальных путей. Этот вывод имеет фундаментальное значение для понимания механизмов активации экспрессии генов у эукариот.
Основные положения, выносимые на защиту
ТФД является высокоспецифичным индуктором CYP2B изоформы в печени крыс и CYP2C изоформы в печени кроликов.
В основе межвидовых особенностей индукции CYP2B лежат различия в механизмах активации транскрипции генов у крыс и мышей.
На ранних этапах индукции ТФД и ФБ наблюдаются различия в активации ядерных белков, способных связываться с элементом Барби-бокс проксимального промотора генов CYP2B в печени крыс.
Активность CYP2B в печени крыс, обработанных ТФД и ФБ, меняется под воздействием ингибиторов путей сигнальной трансдукции.
Ингибирование Са /кальмодулин-зависимого сигнального пути усиливает экспрессию генов CYP2B и приводит к усилению интенсивности комплекса ядерных белков с элементом NR1 при индукции ТФД. Этот эффект не наблюдается при индукции ФБ.
Апробация работы
Результаты работы были представленны и обсуждены на VIII Европейской конференции общества изучения чужеродных соединений (ISSX), Dijon, France, 2003; на VII Международной конференции общества изучения чужеродных соединений (ISSX), Vancouver, Canada, 2004; на VIII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, Россия, 2004); на XIII Североамериканской конференции общества изучения чужеродных соединений (ISSX), Maui, Hawaii, 2005.
Цитохром Р450 - ключевой фермент микросомальной монооксигеназной системы
Цитохромы Р450 (CYP) представлены суперсемейством белков, изоформы которых найдены как в прокариотах, так и в эукариотах. Свое название эти ферменты получили за свойство проявлять максимум поглощения света при 450 нм в восстановленном состоянии в комплексе с СО (Omura, Sato, 1964). Этот феномен объясняется существованием тиолатной связи, разрушение которой приводит к образованию каталитически неактивной формы с максимумом поглощения при 420 нм.
Цитохромы Р450 действуют как монооксигеназы и их функции заключаются в деградации эндогенных стероидных гормонов, витаминов, производных жирных кислот, а так же в метаболизме чужеродных соединений (ксенобиотиков), таких как лекарственные препараты, отходы производства, пестициды, пищевые добавки, и множества других химических соединений, которые в норме не принимают участие в биохимических реакциях организма (Nelson et al., 1996). Рассматриваемые ферменты биотрансформации входят в состав микросомальной монооксигеназной системы, которая представляет собой мембраносвязанный ферментный комплекс, состоящий из цепи транспорта электронов, конечным акцептором которых является цитохром Р450. Последний осуществляет связывание субстратов и активацию молекулярного кислорода в реакциях монооксигеназного типа (Nelson, Strobel, 1987). Ферменты монооксигеназной системы катализируют по меньшей мере 15 типов реакций биотрансформации ксенобиотиков. Эти реакции включают ароматическое и алифатическое гидроксилирование, N- и О-деалкилирование, дезаминирование и некоторые другие реакции, в результате которых гидрофобные субстраты превращаются в гидрофильные метаболиты, что облегчает их выведение из организма (Nebert, Nelson, 1989). До сегодняшнего дня механизмы действия CYP в живых организмах детально не исследованы, однако общепринятой является схема, предложенная Эстабруком (Estabrook et al., 1968) (рис. 1). Схема включает 4 этапа.
На первом этапе (1) происходит связывание фермента с субстратом с замещением шестого лиганда молекулой воды. Такая молекулярная перестройка приводит к сдвигу максимума поглощения комплекса фермент-субстрат, изменению спинового состояния железа и окислительно-восстановительного потенциала гемопротеиновой системы. Вторым шагом (2), инициируемым уменьшением окислительно-восстановительного потенциала на первом этапе, является восстановление первым электроном Fe (НІ) до Fe(II). Последующие два этапа (3, 4) заключаются в связывании восстановленного комплекса с молекулярным кислородом с образованием супероксида и восстановлении вторым электроном образованного комплекса. Можно сказать, что продуктом первых четырех стадий является активированный комплекс Fe(II) с (. Природа такого короткоживущего комплекса долгое время оставалась нераскрытой. Однако современные кристаллографические данные (Schlichting et al., 2000) свидетельствуют о том, что этот комплекс представляет собой смесь двух электрофильных железо-пероксо [В]- и железо-оксо [С] оксидантов. Оба комплекса формируются при протонировании атома кислорода, имеющего неподеленную электронную пару, с отщеплением молекулы воды и образованием реактивного гидроксид-катиона ОН . Дальнейшим шагом (5, 6, 7) является окисление субстрата. В результате этого биотрансформация ксенобиотиков ферментами микросомальной монооксигеназной системы может приводить к превращению субстратов в электрофильные метаболиты, которые взаимодействуют с ключевыми внутриклеточными макромолекулами (нуклеиновыми кислотами, белками), что связано с возникновением мутагенных, токсических, тератогенных и канцерогенных эффектов (Denison, Whitlock, 1995). Ферменты микросомальной монооксигеназной системы обладают очень широкой субстратной специфичностью, которая обеспечивается функционированием множества форм цитохрома Р450. К настоящему времени известно более 400 форм этого гемопротеида, описанных для бактерий, растений и животных (Nebert et al., 1991). На основании аминокислотной последовательности белков и нуклеотидной последовательности соответствующих генов выделяют семейства и подсемейства цитохромов Р450. В семейство объединяют белки Р450, гомология по аминокислотной последовательности которых составляет не менее 40%. Семейства обозначаются арабскими цифрами: 1, 2 и т.д. Белки, гомологичные более чем на 50-60%, составляют подсемейство. Подсемейства обозначаются заглавными буквами: А, В, С и т.д. Индивидуальные формы CYP450 внутри подсемейства обозначаются цифрами (например, CYP2B1, CYP2B2), а соответствующие им гены - курсивом (например, CYP2B1, CYP2B2) (Nelson et al., 1993). Суперсемейство цитохромов Р450 состоит, по крайней мере, из 27 отдельных семейств, 18 из которых найдены у млекопитающих (http://drnelson.utmem.edu/ CytochromeP450.html). Семейства 1, 2 и 3, которые осуществляют первую ступень детоксикации, играют важную роль в биотрансформации ксенобиотиков в организме человека и животных (Czekaj, 2000).
Некоторые формы цитохромов Р450 играют первостепенную роль не только в метаболизме ксенобиотиков, но и в биосинтезе разнообразных соединений. Цитохромы Р450 из семейств 11, 17, 19 и 21 необходимы для биосинтеза стероидных гормонов, семейства 7, 8, 24 и 27 катализируют реакции биосинтеза желчных кислот, витамина D3 и холестерола (Nelson et al., 1996).
Одним из важнейших свойств компонентов микросомалыюй монооксигеназной системы, в частности цитохрома Р450, является способность к индукции. В данном случае термин индукция обозначает не только усиление экспрессии гена в ответ на определенное воздействие, но также увеличение монооксигеназной активности, что связано с увеличением CYP-белков. В роли индукторов в первую очередь выступают сами ксенобиотики, способные высокоспецифично индуцировать систему, участвующую в их собственном метаболизме. Феномен индукции цитохромов Р450 является важнейшей составляющей адаптивного ответа на чужеродные соединения, попадающие в клетку. Это приводит к усилению детоксификационной функции организма с последующим выведением ксенобиотика. Хроническое введение крысам барбитуратов постепенно уменьшало время сна от этих препаратов из-за усиления их метаболизма. Отсюда было сделано заключение, что данные метаболические изменения вызваны индукцией определенных форм цитохрома Р450.
Индукторы разделены на две классические группы (Соппеу, 1982). К первой группе относятся полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), представленные 2,3,7,8,-тетрахлородибензо-р-диоксином, 3-метилхолантренон и т.д. Ко второй группе относятся фенобарбитал и другие индукторы фенобарбиталового типа, которые характеризуются структурным разнообразием в отличие от первой группы индукторов, представленной структурно подобными соединениями. Хотя известны ксенобиотики (этанол, диметилнитрозамин, прегненолон-16сс-карбонитрил), индуцирующие синтез форм монооксигеназы, отличных от форм, индуцируемых ФБ и ПАУ, последние справедливо считаются представителями альтернативных типов индукторов цитохромов.
Другие регуляторные элементы генов CYP2B
В последние несколько лет была показана значительная роль коактиваторов и корепрессоров в регуляции различных генов ядерными рецепторами (Rosenfeld, Glass, 2001). Были идентифицированы коактиваторы, которые взаимодействуют с CAR. По некоторым данным, для ксенобиотик-индуцированной CAR-опосредованной активации генов CYP2B необходимо присутствие таких коактиваторов как стероидного коактиватора 1 (SRC-1), который повышает уровень и конститутивной, и ксенобиотик-индуцированной экспрессии генов CYP2B, взаимодействуя с CAR через дополнительные белки, связывающиеся с сайтами элемента PBREM дистального промотора (Muangmoonchai et al., 2001); GRIP1 (Glucocorticoid receptor - interacting protein 1), который усиливает транслокацию CAR из цитоплазмы в ядро (Min et al., 2002); PGC-la (peroxisomal proliferators - activated receptor-y coactivator ,1 a), который повышает локализацию CAR в ядре (Shiraki et al., 2003). В экспериментах in virto было показано, что фактор транскрипции Spl также может действовать как коактиватор в ФБ-индуцированной экспрессии генов CYP2B (Muangmoonchai et al., 2001). Кроме этого было показано, что репрессор SHP (Short Heterodimer Partner, NR0B2), способен взаимодействовать с CAR (Вае et al., 2004). Однако роль этих взаимодействий in vivo до конца не ясна.
Проксимальный промотор генов CYP2B представляет собой последовательность длиной около 100 п.н., расположенную на расстоянии -150 /-50 п.н. от точки начала транскрипции. В состав проксимального промотора входят последовательности, гомологичные для различных генов цитохромов подсемейства 2В: позитивный элемент, негативный элемент и входящие в их состав Барби-бокс, С/ЕВР-связывающий сайт, ССААТ бокс (рисунок 3). Данные о расположении основных элементов проксимального промотора не совпадают в исследованиях различных групп, однако наблюдаются значительные аналогии. Так, негативному (-160/-127 п.н.) и позитивному (-96/-69 п.н.) элементам проксимального промотора генов CYP2B, описанным в лаборатории Пабманабана (Upadhya et al., 1992; Ram et al., 1995), соответствуют районы -142/-117 п.н. и -66/-48 п.н., описанные в лаборатории Филлипса (Shephard et al., 1994), районы FP2 (-138/-119 п.н.) и FP1 (-64/-45 п.н.), полученные в лаборатории Кемпера (Park, Kemper, 1996), районы FT3 (-129/-115 п.н.) и FT2 (-66/-42 п.н.), описанные в лаборатории Адезника (Luc et al., 1996), районы 180/-154 п.н. и -64/-34 п.н., зарегистрированные лабораторией Негиши (Honkakoski et al., 1996), и, наконец, элементы II (-143/-116 п.н.) и III (-61/-47 п.н.), полученные в лаборатории Омиечинского (Sommer et al., 1996).
Элементы проксимального промотора исторически были описаны первыми, и велось активное изучение их роли в ФБ - зависимой индукции экспрессии генов CYP2B. Белок, взаимодействующий с проксимальным промотором, и механизм индукции генов цитохромов с вовлечением элементов проксимального промотора детально изучены для бактерий Bacillus megaterium.
Наиболее достоверно установлен механизм участия Барби-бокс последовательности проксимального промотора в индукции генов CYP102 и CYP106 Bacillus megaterium (Liang et al., 1995). Исследователями группы Фулко было показано, что гены этих цитохромов активируются за счет барбитурат-опосредованного удаления репрессора (Bm3Rl) с регуляторной последовательности промотора, состоящей из 17 п.н. и называемой Барби-боксом. Таким образом, происходит дерепрессия гена цитохрома Р450. Поскольку индукция других генов бактериальных цитохромов под действием барбитуратов выглядит очень похожей (Patel, Omer, 1992; Liang et al., 1995), было сделано предположение, что механизм ФБ-опосредованной индукции у бактерий универсален. Однако несмотря на то, что промоторные последовательности, гомологичные Барби-боксу и содержащие консервативный AAAG-мотив, были найдены во многих ФБ-чувствительных генах цитохромов Р-450 млекопитащих (Таблица 1) (например, у крыс: CYP2B1, CYP2B2, CYP3A2, у кроликов: CYP2CJ), механизм, аналогичный бактериальному, не является доказанным для индукции генов CYP2B у млекопитающих (Honkakoski, Negishi, 1998b).В отношении индукции генов CYP2B млекопитающих исследователями группы Фулко было показано, что при воздействии фенобарбитала in vivo повышалось связывание не идентифицированного пока ядерного белка печени крыс с ДНК - фрагментом CYP2B1 длиной -89/-73 п.н., содержащим Барби-бокс. Аналогичный эффект наблюдался при инкубации контрольных ядерных экстрактов печени крыс с фенобарбиталом и олигонуклеотидом, последовательность которого соответствовала Барби-боксу, in vitro (Не, Fulco, 1991). Наблюдаемое усиление связывания белка с Барби-боксом при воздействии фенобарбитала позволило предположить, что в отличие от ФБ-опосредованного высвобождения репрессора у бактерий, у млекопитающих имеет место активация позитивного ФБ-зависимого фактора.
Роль проксимальных регуляторных элементов в активации генов цитохромов у млекопитающих также активно изучалась группой Падманабана. Было показано, что район -179/+1 п.н. гена CYP2B2 крысы является достаточным для усиления транскрипции CYP2B2 в ответ на воздействие фенобарбитала (Prabhu et al., 1995). Вігутри этого района ДНК находятся негативный элемент (НЭ: -160/-127 п.н.) (Ram et al., 1995) и позитивный элемент (ПЭ: -98/-69 п.н.) (Upadhya et al., 1992), содержащий Барби-бокс. Методом задержки ДНК-белковых комплексов в геле было показано, что с позитивным элементом (ПЭ) связывается три белка, причем один из белков может связываться как с позитивным, так и с негативным элементом (НЭ) проксимального промотора. Молекулярный вес этого белка, определенный с помощью НЭ- и ПЭ-аффинной хроматографии, составил 26-28 кДа.
Было показано, что связывание с позитивным или негативным элементом находится в прямой зависимости от статуса фосфорилирования данного белкового фактора (Prabhu et al., 1995). Дефосфорилированная форма имела большее сродство к негативному элементу, в то время как позитивный элемент связывал обе формы. Исследователи предположили, что дефосфорилированная форма, связываясь с негативным элементом, обеспечивает базальный уровень транскрипции генов CYP2B в отсутствие индукторов, а воздействие фенобарбитала приводит к фосфорилированию белка и связыванию его с позитивным элементом, что ведет к активации транскрипции (рис. 7). Группой Падманабана также было показано, что связывание белков с ПЭ находятся в прямой зависимости от наличия гема (Sultana et al., 1997). Введение in vivo CoCl2, ингибитора биосинтеза гема, приводит к значительному ослаблению комплексообразования и уменьшению транскрипции генов CYP2B1/2B2 при индукции ФБ. Методом аффинной хроматографии с использованием гема в качестве лиганда был очищен белок с молекулярной массой 65 кДа, который проявляет способность связывать гем и взаимодействовать с ПЭ.
Таким образом, приведенные данные говорят в пользу того, что проксимальный промотор принимает участие в индукции, однако белки -регуляторы транскрипции, действующие через элементы проксимального промотора, не идентифицированы, и механизм индукции до конца не понятен.
Межвидовые различия в индукции микросомальной монооксигеназной системы в печени крыс и кроликов под действием 2,4,6- трифенилдиоксана-1,3
Мультигенное суперсемейство цитохрома Р450 (CYP) катализирует метаболизм широкого спектра соединений как экзогенного, так и эндогенного происхождения (Gonzalez, 1988). Многие ксенобиотики, в том числе и лекарства, способны не только окисляться данной ферментной системой, но и вызывать обратимое увеличение их ферментативной активности. В целом, индукция цитохрома Р450 является механизмом защиты клетки от чужеродных соединений, обычно приводящим к детоксификации ксенобиотиков (Poster, Coon, 1991). Однако существует и другой результат такого процесса. Так, метаболизм лекарств, а также многих эндогенных соединений, включая простагландины, жирные кислоты и гормоны, может меняться из-за индукции различных форм цитохрома Р450. В настоящее время изучение механизмов индукции молекулярных форм CYP является одним из активно развивающихся направлений в современной молекулярной биологии, биохимии, токсикологии и фармакологии. Механизмы индукции разнообразны и для многих подсемейств еще до конца не изучены. Однако известно, что увеличение ферментативной активности белка не всегда связано с увеличением транскрипции гена, так как содержание белка и его активность может регулироваться не только на транскрипционном уровне, но и на посттранскрипционном, а также посттрансляционном уровнях (Poster, Coon, 1991). С другой стороны, результаты исследований механизмов индукции позволяют предположить, что экспрессия большинства генов цитохромов Р450 регулируется с участием различных ядерных рецепторов (NR), которые под действием ксенобиотика-лиганда, как правило, либо транслоцируются из цитоплазмы в ядро, либо активируются в ядре, где они, образуя гетеродимеры со своими ядерными партнерами, взаимодействуют с генами-мишенями (Handschin, Meyer, 2003).
Фенобарбитал (ФБ) и другие лекарства могут индуцировать синтез CYP2B в печени человека и животных, что сопровождается значительным увеличением ферментативной активности. ФБ является прототипом большой группы структурно неродственных соединений, так называемых индукторов ФБ-типа (Waxman, Azaroff L, 1992). Было показано, что ФБ в печени активирует ядерный рецептор CAR, который транслоцируется в ядро, где связывается с другим ядерным белком RXR (Wei et al., 2000; Swales, Negishi, 2004). Сформировавшийся гетеродимерный комплекс взаимодействует с регуляторними последовательностями дистального промотора генов-мишеней, что сопровождается значительным усилением их транскрипции. Однако, несмотря на интенсивные исследования, детально механизм, по которому индукторы инициируют транслокацию CAR в ядро, на сегодняшний день не известен. Для одного из индукторов ФБ-типа - 1,4-бис[2-(3,5-дихлорпиридилокси)] бензола (ТСРОВОР) - было показано, что in vitro он способен напрямую связываться с CAR мыши, но не человека (Moore et al., 2000). В этих экспериментах фенобарбитал не проявлял способности связываться с CAR человека или мыши. Несмотря на это, рецептор был способен к транслокации в ядро гепатоцитов печени мышей после обработки фенобарбиталом или ТСРОВОР in vivo. Очевидно, прямое связывание рецептора с лигандом не является необходимым для ядерной транслокации CAR, поэтому исследование роли альтернативных механизмов имеет особую важность. Было выдвинуто предположение, что транслокация рецептора в ядро контролируется запуском процессов фосфорилирования/дефосфорилирования белков. Участие этих процессов в индукции CYP2B было показано еще в 1996 г. Нироди с соавт. показали, что введение 2-аминопурина, неспецифичного ингибитора протеинкиназ, а так же окадаивой кислоты, ингибитора протеинфосфатаз, крысам in vivo приводит к уменьшению индуцирующего эффекта ФБ (Nirodi et al., 1996). Однако, несмотря на обширные исследования роли протеинкиназ и протеинфосфатаз в регулировании механизмов индукции CYP2B, до сих пор нет единого мнения о том, какие конкретные сигнальные пути вовлечены в активацию CAR (Corcos, Lagadic-Gossman, 2001). Наряду с этим, в литературе имеются данные об участии в индукции экспрессии генов CYP2B cis-регуляторных элементов проксимального промотора через активацию пока не идентифицированных ядерных белков, но их роль в этом процессе также до конца не выяснена (Honkakoski, Negishi, 1998b).
Новый перспективный подход к изучению механизмов индукции экспрессии генов CYP2B появился в связи с открытием нового высокоэффективного индуктора цитохрома Р450 2В крыс, 2,4,6-трифенилдиоксана-1,3 (ТФД), (Мишин и др., 1990). Несмотря на разное химическое строение и отличающиеся дозо-зависимые эффекты, ФБ и ТФД вызывают существенное увеличение как общего содержания цитохрома Р450, так и ферментативных активностей CYP2B в печени крыс, которые оценивались по скорости окисления специфичных субстратов - 7-пентоксирезоруфина и андростендиона (в 16р-положении). Более того, было показано, что происходит значительное увеличение CYP2B1/2 белков в миксосомальной фракции печени крыс, индуцированных ФБ и ТФД.
Видоспецифичность индукции активности CYP2B была подтверждена нами в исследованиях, выполненных на кроликах. Эффект ТФД на активность CYP2B в печени кроликов был исследован впервые. Кроме того, было исследовано влияние ТФД на активность других ферментов первой фазы метаболизма ксенобиотиков в печени животных, поскольку известно, что при индукции ФБ, наряду с генами CYP2B, активируются также другие гены цитохрома Р450 (Yamamoto et al., 2003).
Использование реакций, селективно катализируемых определенными формами цитохрома Р450, представляет перспективный подход для определения активности исследуемых ферментов. Специфичные каталитические активности для CYP2B определяются по скорости О-деалкилирования 7-пентоксирезоруфина (ПРОД), для CYP3A - по скорости N-деметилирования эритромицина (ЭМД). К специфичным реакциям можно отнести также гидроксилирование стероидов, в том числе тестостерона в различных положениях молекулы. Этот метод является полезным для одновременного измерения каталитических активностей нескольких изоформ Р450. В экспериментах по изучению каталитических активностей изолированных форм CYP было показано, что CYP2B окисляет тестостерон в 1бр-положении, CYP3A - в 6р-, a CYP2C - в 16а- и 17-положении молекулы стероида (Wood et al., 1983; Waxman, 1988).
Анализ экспрессии генов CYP2B в печени крыс при совместном введении ингибиторов и индукторов
В ответ на введение индукторов ФБ-типа крысам и мышам было выявлено, что изменение ферментативных активностей и количества белка CYP2B в печени происходит за счет усиления транскрипции генов (рис. 11): при индукции ФБ происходит увеличение содержания мРНК как у крыс, так и у мышей. Индукция ТФД сопровождается значительным увеличением экспрессии генов CYP2B в печени крыс, но не мышей. Введение ТСРОВОР мышам приводит к многократному усилению экспрессии гена сур2Ъ, в то время как при введении этого индуктора крысам происходит снижение количества мРНК по сравнению с контролем. Таким образом, эти результаты дают нам основание сделать вывод о том, что основой межвидовых особенностей в индукции активности CYP2B являются различия в механизмах активации транскрипции у крыс и мышей. Для проверки этого предположения были проведены эксперименты по исследованию образования комплексов ядерных белков с регуляторным элементом NR1 генов CYP2B (рис. 12). Известно, что сайт NR1 является наиболее консервативным элементом энхансерной области генов CYP2B у крыс и мышей, с которым взаимодействует гетеродимерный комплекс CAR:RXR (Goodwin, Moore, 2004). Полученные результаты продемонстрировали различия в активации ядерных белков (предполагаемых факторов транскрипции) под действием разных индукторов у крыс и мышей. Так, ФБ активирует формирование ДНК-белковых комплексов в печени, как крыс, так и мышей, ТФД - лишь в печени крыс, а ТСРОВОР - лишь в печени мышей. Такая картина формирования комплексов ядерных белков с элементом NR1 хорошо сочетается с профилем транскрипции генов-мишеней, что подтверждает предположение о транскрипционной природе межвидовых особенностей в индукции CYP2B. Основываясь на литературных данных, можно предположить, что в состав регистрируемых ДНК-белковых комплексов входит ядерный рецептор CAR. Возможно, что в комплексе I (рис. 12А) CAR присутствует в виде гетеродимера с RXR рецептором, а в комплексе II в виде мономерного белка. Гомология аминокислотных последовательностей белков CAR крыс и мышей составляет 92,5%. Этот факт свидетельствует о том, что белковая молекула рецептора CAR у обоих видов грызунов практически одинакова. Различия в активации этого рецептора, по-видимому, заключаются в существовании видоспецифичных сигнальных путей. Другой причиной видоспецифичного действия ТФД в печени крыс, возможно, является обширная инсерция длиной в 42 п.н., нарушающая последовательность Барби-бокс проксимального промотора генов сур2Ь мышей (Honkakoski et al., 1996). Это наблюдение позволяет предположить, что ТФД имеет видоспецифичный высокоэффективный путь индукции экспрессии генов CYP2B с участием проксимального промотора через активацию Барби-бокс.
Для проверки этого предположения было исследовано образование ДНК-белковых комплексов ядерных белков с последовательностью Барби-бокс проксимального промотора генов CYP2B в печени крыс в ранний период индукции ТФД и ФБ (40 мин, Зч, 6ч, 18ч). Эти результаты показали, что как ФБ, так и ТФД эффективно стимулируют образование ДНК-белковых комплексов. В случае индукции фенобарбиталом регистрировалось три ДНК-белковых комплекса, причем картина их формирования была практически одинаковой во все исследуемые промежутки времени. Исключение составляет 40-мин интервал, когда интенсивность связывания белков при формировании комплексов I и II уменьшается (рис. 13). Аналогичные результаты, демонстрирующие образование трех комплексов при 6-ти и 24-х часовой индукции ФБ, были получены в лаборатории Падманабана (Upadhya et al., 1992; Ram et al., 1995; Prabhu et al., 1995). При инкубации ядерных белков печени крыс, обработанных ТФД, с Барби-бокс мы также зарегистрировали динамику изменения интенсивности их связывания с последовательностью ДНК при образовании комплексов (рис. 14). В течение первого часа индукции (40 мин) формировался только комплекс I, который соответствовал одному из двух комплексов, регистрируемых в случае использования контрольных ядерных экстрактов. При инкубации ядерных белков, полученных из печени крыс через 3, 6 и 18 ч после введения индуктора, с элементом Барби-бокс генов CYP2B, также формировалось три комплекса.
Выявленные нами различия в динамике образования ДНК-белковых комплексов могут свидетельствовать о существовании специфических ядерных рецепторов для каждого индуктора. В пользу этого предположения говорят полученные ранее в нашей лаборатории результаты, показывающие, что инкубация ядерных белков печени крыс с последовательностью Барби-бокс с добавлением ФБ in vitro сопровождалась образованием трех комплексов, тогда как ТФД стимулировал формирование пяти комплексов (Grigorieva et al., 2002).
Неравномерная картина формирования комплексов ядерных белков с последовательностью Барби-бокс при индукции ФБ и ТФД может отражать процессы активации ядерных и цитозольных белков с последующей транслокацией последних в ядро. Можно также предположить, что в течение исследуемого интервала времени под действием индукторов меняется конформация специфических ядерных белков - рецепторов. Усиление интенсивности ДНК-белковых комплексов к 18 часам индукции может быть связано либо с увеличением синтеза белков, либо с их активацией через процессы фосфорилирования/ дефосфорилирования.
Образование новых ДНК-белковых комплексов сопровождалось усилением транскрипции генов CYP2B. Действительно, в контроле, когда регистрируется два таких комплекса, или в случае 40-минутной индукции ТФД, когда регистрируется один комплекс, содержание мРНК крайне низко. В ситуации, когда появляются новые комплексы, а особенно при 18-ти часах индукции ФБ и ТФД, когда они полностью сформировались, регистрировалось максимальное содержание мРНК .
Таким образом, мы впервые показали, что на ранних этапах индукции (через 40 мин после введения крысам ФБ и 3 ч после введения ТФД) происходит активация ядерных белков, способных связываться с элементом Барби-бокс генов CYP2B. Несмотря на то, что индукторы различной химической структуры по-разному активируют такое связывание, проведенные эксперименты наглядно свидетельствуют о том, что этот процесс сопровождается включением транскрипции гена.
