Введение к работе
Актуальность проблемы
Цитохромы Р450 (CYP) являются ключевыми ферментами первой фазы метаболизма и относятся к наиболее важными катализаторам окисления лекарственных препаратов. Р450 широко распространены в природе и обнаружены во всех аэробных организмах. В настоящее время известны геномные последовательности более чем 18500 цитохромов Р450, составляющих десятки и сотни семейств и подсемейств, соответственно. Изоферменты цитохрома Р450 - представители разных семейств и подсемейств отличаются субстратной специфичностью и регуляторами их активности (ингибиторами и индукторами). В настоящее время у человека идентифицировано 57 форм цитохрома Р450 и 15 из них участвуют в метаболизме ксенобиотиков, включая 90% реакций I фазы метаболизма лекарств [Nelson et al, 2013].
Активность монооксигеназной системы в отношении того или иного лекарственного препарата определяется, главным образом, концентрацией и активностью специфичных для него изоформ цитохрома Р450. Поэтому, индивидуальные особенности метаболизма лекарственных соединений определяются персональным профилем - концентрацией и активностью цитохромов Р450 [Арчаков и соавт., 2008].
Белки подсемейства CYP2B составляют 0,2-10% от содержания всех цитохромов Р450 в печени, при этом наблюдается высокая межиндивидуальная вариабельность концентрации данных белков [Hesse, 2004]. Согласно современным данным, активность CYP2B6 в микросомах печени человека варьирует в 80 раз [Wang et al, 2008]. Такие межиндивидуальные различия в концентрации CYP2B6 в печени и его ферментативной активности могут приводить к значительной вариабельности терапевтического действия множества лекарств, которые метаболизируются CYP2B6.
Благодаря достижениям молекулярной биологии, механизмы индукции генов, кодирующих CYP2B, изучены достаточно хорошо. Однако, концентрация белка и его активность определяются после синтеза полипептидной цепи на рибосомах. Такие посттрансляционные события, как фолдинг, модификации первичной структуры и, наконец, деградация белка
являются определяющими для реализации монооксигеназной функции Р450 [Aguiar, 2005]. Однако данные механизмы исследованы значительно хуже.
Для определения сложных, многокомпонентных изменений, которые происходят в посттрансляционной судьбе белков, необходимо использовать методические подходы, при которых возможно регистрировать сотни и тысячи белков. Одним из таких подходов является протеомика, которая позволяет идентифицировать и выявлять количественные и качественные изменения в белковом составе клеток и тканей.
В настоящей работе для изучения посттрансляционной регуляции Р450 использовался экспериментальный подход, основанный на комбинации протеомных высокопроизводительных методов и последующей верификации полученных данных с использованием модельных экспериментальных систем.
Цель работы: определение молекулярных механизмов
посттрансляционной регуляции микросомальных цитохромов Р450 и взаимодействий белков монооксигеназной системы печени с клеточными компонентами, отвечающими за фолдинг, окислительную модификацию и деградацию белков на примере ферментов подсемейства CYP2B Основные задачи исследования:
-
Провести экспериментально обоснованный выбор метода протеомного анализа мембранных белков и их количественной оценки.
-
Исследовать влияние индукторов Р450 на изменение в белковом составе клеток печени.
-
Определить роль цитозольных факторов и микросомальных белков клеток печени в встраивании гема в апобелок CYP2B.
-
Исследовать молекулярные механизмы посттрансляционной окислительной модификации CYP2B.
-
Исследовать механизмы протеолитической деградации нативного и модифицированного CYP2B.
Научная новизна.
С использованием разработанного высокопроизводительного протеомного метода установлено, что введение индукторов цитохромов Р450 (фенобарбитала и 3-метилхолантрена) приводит значительному изменению белкового профиля в ходе индукции цитохрома Р450 в печени мыши.
Установлен молекулярный механизм сборки полипептидной цепи и гемовой части CYP2B в структурно- и функционально-активный фермент.
Изучены окислительные посттрансляционные изменения цитохрома Р450 и возможное влияние этих изменений на время жизни белка. Предложен механизм, по которому проходит деградация белков подсемейства цитохромов CYP2B, и показана роль определенных участков аминокислотной последовательности белка в механизме определении пути деградации. Основные положения, выносимые на защиту:
-
Фармакологическая индукция Р450 сопровождается увеличением содержания белковых компонентов монооксигеназной системы; шаперонов, вовлеченных в фолдинг белков монооксигеназной системы; антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД, пероксидазы и др.) и белков, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки.
-
В сборке функционально активного холофермента Р450 участвуют эндогенный восстановленный глутатион и шаперон GRP94.
-
Увеличение содержания антиоксидантных ферментов в ходе индукции является компенсаторным ответом клетки на повышение концентрации активных форм кислорода (АФК), которые генерируются в результате разобщения монооксигеназных реакций, катализируемых CYP2B.
-
В реконструированной монооксигеназной системе взаимодействие цитохрома CYP2B с АФК приводит к химической модификации трех из четырех остатков цистеина цитохрома и образованию белковых агрегатов. Данные модификации являются сигналом для протеаз, ответственных за деградацию белков надсемейства.
-
Катаболизм CYP2B в модельных дрожжевых системах включает протеасомный либо вакуольный (лизосомный) пути протеолитической деградации. В дрожжах, дефицитных по вакуольным (лизосомным) ферментам скорость деградации CYP2B значительно снижается. При внесении мутаций в первичную структуру CYP2B скорость его деградации значительно увеличивалась за счет вовлечения протеасомных ферментов в этот процесс.
Научно-практическая значимость работы. Разработанные методические подходы протеомного анализа могут быть использованы в работах по поиску маркеров заболеваний и анализу белкового состава биологических объектов. Поскольку цитохромы Р450 активно участвуют в окислении ксенобиотиков (в том числе лекарственных соединений), знание посттрансляционных молекулярных механизмов, контролирующих функцию монооксигеназной системы, может быть использовано при разработке лекарственных соединений и для оптимизации и персонализации фармакотерапии. Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: 12-th International symposium on microsomes and drug oxidations (Montpellier, France, 1998); International workshop "From Sequence to function: Experimental and Bioinformatic Studies of Cytochrome P450 Superfamily" (Moscow, 2000); 12-th International Conference on Cytochrome P450. Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology (France, 2001); International Meeting on Proteome Analysis (Munchen, 2001); International Conference Genomics and Bioinformatics for Medicine (St.Peterburg-Moscow, 2002); 13-th International Conference on Cytochromes P450 (Prague, 2003); 2nd International Conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow-Pies-Moscow, 2004); 14th International conference on Cytochromes P450: biophysics and bioinformatics (Dallas, USA, 2005); HUPO 3th Annual World Congress в Пекине (КНР) в 2004 г; 3-й международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Новосибирске (Россия) в 2006 г., HUPO 6th Annual World Congress в Сеуле (Южная Корея) в 2007 г., HUPO 7th Annual World Congress в Амстердам (Нидерланды) в 2008 г., 4-ая международная конференция «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Москве и Нижнем Новгороде (Россия) в 2008 г., HUPO 8th Annual World Congress в Торонто (Канада) в 2009 г.; HUPO 9th Annual World Congress в Сиднее (Австралия) в 2010 г., Taiwan-Russia Research Cooperation Symposium "New mass spectrometry methods in proteomics" в Гаосюне (Тайвань) в 2011 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 69 научных работ в российских и иностранных научных изданиях, в том числе 46 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК, и 23 публикации в докладах
научных конференций. Индекс Хирша составляет 12 по данным систем «Scopus» и «Web Of Science».
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, обсуждения результатов, выводов, заключения, списка списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 293 страницах печатного текста, содержит 8 таблиц и 35 рисунков.
