Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Виды гепатитов 13
1.2. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантные системы защиты 15
1.2.1. Свободные радикалы и пути их образования 15
1.2.2. Пероксидное окисление липидов и его роль 16
1.2.3. Участие свободнорадикальных процессов в жизнедеятельности 19
1.2.4. Активные формы кислорода, механизм их образования и роль 20
1.2.5. Роль свободнорадикального окисления в развитии патологии печени 25
1.2.6. Понятие об антиоксидантной. системе защиты 25
1.2.6.1. Ферментативные антиоксиданты 26
1.2.6.2. Неферментативная антиоксидантная система 29
1.2.6.3. Белки теплового шока 31
1.3. Механизм токсического действия четыреххлористого углерода 32
1.4. Характеристика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из различных организмов 35
1.4.1. Реакция, катализируемая ферментом 35
1.4.2.Физиологическая роль глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 35
1.4.3. Изоформы и внутриклеточная локализация глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы 37
1.4.4. Очистка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из различных источников 39
1.4.5. Молекулярная масса и субъединичная структура 41
1.4.6. Идентификация функциональных групп активного центра глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 42
1.4.7. Влияние рН среды и температуры на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 45
1.4.8. Кинетическое поведение и регуляция активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 47
1.4.8.1. Сродство к субстрату и кофакторам 47
1.4.8.2. Регуляция активности фермента 50
1.4.8.2.1. Активаторы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 50
1.4.8.2.2. Ингибиторы активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 52
1.4.8.2.3. Особенности функционирования глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при различных патологических состояниях 58
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объект исследования 60
2.2. Создание модели экспериментального токсического гепатита 60
2.3. Получение субклеточных фракций гепатоцитов 60
2.4. Определение интенсивности процессов СРО методом биохемилюминесценции 61
2.5. Определение содержания малонового диальдегида 63
2.6. Определение содержания диеновых конъюгатов 64
2.7. Определение активности ферментов 65
2.8. Определение количества белка 66
2.9. Выделение и очистка фермента 66
2.9.1. Экстракция 67
2.9.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 67
2.9.3. Гель-фильтрация 68
2.9.4. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 69
2.10. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента 69
2.11. Аналитический электрофорез 70
2.12. Определение молекулярной массы 71
2.13. Статистическая обработка экспериментальных данных 71
ГЛАВА 3. Оценка интенсивности свободнорадикальных процессов и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в динамике развития экспериментального токсического гепатита
3.1. Параметры биохемилюминесценции в печени крыс в динамике развития токсического гепатита 73
3.2. Определение содержания первичных и вторичных продуктов пероксидного окисления липидов 75
3.3. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в динамике развития токсического гепатита 80
ГЛАВА 4. Кинетические и регуляторные свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогсназы из печени крыс в норме и при экспериментальном токсическом гепатите
4.1. Исследование субклеточной локализации глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы 84
4.2. Очистка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс 86
4.3. Исследование кинетических параметров каталитического действия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при экспериментальном токсическом гепатите 91
4.4. Молекулярная масса глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 95
4.5. Влияние концентрации ионов водорода на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при экспериментальном токсическом гепатите 97
4.6. Регуляторные свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при патологии 101
4.6.1. Участие ионов некоторых металлов регуляции активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 101
4.6.1.1. Роль ионов Mg2+ и Мп2+ в регуляции активности глюкозо-6 фосфатдегидрогеназы в норме и при токсическом гепатите 101
4.6.1.2. Влияние ионов Fe2+, Cu2+, Са2+ на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 102
4.6.2. Влияние пероксида водорода на функционирование глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в норме и при патологии 109
4.6.3. Участие глутатиона в регуляции активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в норме и при токсическом гепатите 112
4.6.4. Регуляция активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы адениннуклеотидами и НАДФН 117
4.6.5. Особенности регуляции активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы под действием интермедиатов цикла Кребса при экспериментальном токсическом гепатите 124
4.6.6. Участие интермедиатов углеводного обмена в регуляции активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 129
Заключение 133
Выводы 139
Литература 141
Приложение 167
- Активные формы кислорода, механизм их образования и роль
- Влияние рН среды и температуры на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
- Определение содержания первичных и вторичных продуктов пероксидного окисления липидов
- Очистка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс
Введение к работе
Актуальность работы. Исследование биохимических механизмов, лежащих в основе процессов, протекающих в организме в норме и при патологических состояниях, расшифровка молекулярных основ патогенеза заболеваний является основным направлением современной медицинской биохимии. По современным представлениям свободнорадикальные (СР) процессы играют чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности клеток, являясь необходимым этапом различных метаболических процессов [91]. Свободнорадикальное окисление (СРО) способствует уничтожению отживших клеток, элиминации ксенобиотиков, предупреждает злокачественную трансформацию клеток, моделирует энергетические процессы за счет воздействия на активность дыхательной цепи в митохондриях, пролиферацию и дифференциацию клеток, транспорт ионов, участвует в регуляции проницаемости клеточных мембран, в разрушении поврежденных хромосом [71]. В то же время интенсификация СР процессов ' является одним из ведущих механизмов клеточной патологии, включая сердечно-сосудистые заболевания, различные злокачественные процессы, аутоиммунные болезни, хронические воспаления, нейродегенеративные заболевания, и другие [15, 16, 20,46, 70, 94, 95, 214].
Процессы СРО находятся под контролем антиоксидантной системы (АОС) организма. Однако при избыточной генерации активных форм кислорода (АФК), вследствие действия ионизирующей радиации, инфекционных агентов, токсинов, ишемии и других патологических факторов, процесс СРО принимает каскадный характер, что приводит к липид-липидным и белок-липидным нарушениям, разобщению процессов окислительного фосфорилирования и сопряженного с ним тканевого дыхания и, как результат, к тяжелому дисбалансу клеточного метаболизма. При болезнях печени несмотря на многообразие этиологических факторов на субклеточном уровне выявляются однотипные механизмы деструкции, среди
которых особую роль играют процессы СРО с участием АФК [12, 82]. Утилизация АФК осуществляется ферментативной и неферментативной АОС, важное место в которой отводится глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной (ГР/ГП) АОС. Эффективность функционирования данной системы, обеспечивающей детоксикацию органических пероксидов и пероксида водорода, являющегося основным источником гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона в присутствии ионов Fe2+, зависит от уровня в клетке НАДФН. Предполагается, что одним из основных поставщиков НАДФН, необходимого для работы данной системы являются дегидрогеназы пентозофосфатного пути (ПФП). Исследование функционирования ключевого фермента данного пути - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - Г6ФДГ (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49), в печени крысы в условиях окислительного стресса, развивающегося при экспериментальном токсическом гепатите (ЭТГ), представляет интерес в связи с возможным участием данного фермента в регуляции уровня АФК путем поставки НАДФН для ГР/ГП АОС. К настоящему времени изучены физико-химические свойства Г6ФДГ, выделенной из ряда растений, животных и микроорганизмов [99, 198, 152]. Однако, такой аспект, как регуляция активности фермента при реорганизации метаболизма в условиях активации процессов СРО, вызванных действием гепатотоксинов, остается не исследованным. Исследования в этом плане могли бы способствовать выяснению роли Г6ФДГ в лимитировании СР процессов, значительно усиливающихся при патологии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование кинетических свойств и регуляции активности Г6ФДГ из печени крысы при оксидативном стрессе, вызванном токсическим гепатитом. В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 1) оценка интенсивности протекания СР процессов в печени крыс в норме и в динамике развития экспериментального токсического гепатита; 2) определение
активности и субклеточной локализации Г6ФДГ в гепатоцитах крыс в норме и при токсическом гепатите; 3) получение высокоочищенных ферментных препаратов Г6ФДГ из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс; 4) исследование кинетических параметров каталитического действия Г6ФДГ в норме и в условиях окислительного стресса, развивающегося при патологии; 5) изучение регуляции активности исследуемого фермента в норме и при токсическом гепатите; 6) создание гипотетической модели участия Г6ФДГ в регуляции уровня протекания процессов СРО в пораженной гепатотоксином печени крыс.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование особенностей регуляции активности ключевого фермента пентозофосфатного пути - Г6ФДГ в условиях активации СР процессов, инициированных четыреххлористым углеродом. Впервые продемонстрировано возрастание активности Г6ФДГ и параметров, отражающих уровень протекания СР процессов, в динамике развития токсического гепатита. Разработаны способы выделения и получены гомогенные препараты Г6ФДГ из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс. Впервые дана сравнительная характеристика каталитических и регуляторных свойств Г6ФДГ в норме и при токсическом гепатите. Выявлено, что в условиях оксидативного стресса при токсическом гепатите происходит модификация механизмов метаболитной регуляции активности и ряда кинетических параметров каталитического действия исследуемого фермента. На основе полученных результатов предложена гипотетическая схема, отражающая участие Г6ФДГ в опосредованном лимитировании СР процессов путем поставки НАДФН для функционирования ГР/ГП АОС, являющейся одной из основных защитных систем от повреждающего действия АФК. Определение роли Г6ФДГ в регуляции функционирования ГР/ГП системы имеет важное значение для выявления новых элементов взаимосвязи между отдельными
звеньями ферментативной и неферментативной АОС и различными метаболическими путями при токсическом гепатите.
Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о функционировании Г6ФДГ при патологии. Исследование особенностей метаболитной регуляции Г6ФДГ в условиях оксидативного стресса, развивающегося при токсическом гепатите, может способствовать выяснению причин патогенеза на клеточном уровне и поиску путей коррекции патологического состояния в медицинской практике. Разработанные способы получения гомогенных ферментных препаратов Г6ФДГ из печени крыс в условиях нормы и при ЭТГ могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также могут применяться в научно-исследовательской практике при выделении других ферментов из различных тканей млекопитающих, при моделировании биохимических процессов in vitro для изучения кинетики сопряженных реакций в полиферментных системах. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», «Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ. Результаты работы использованы при выполнении гранта по научной программе «Фундаментальные исследования высшей школы в области естественных и гуманитарных наук «Университеты России» УР.07.01.004», а также проекта по программе «Развитие научного потенциала высшей школы РНП. 2.1.1.4429».
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 7ой, 8ой и 9 ой Пущинской школе-
конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2003, 2004), III Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2003), конференции молодых ученых ВГМА «Перспективы развития теоретической и практической медицины» (Воронеж, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), X Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов» (Воронеж, 2004), VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), IV Международной научно-практической конференции «Студенческая медицинская наука XXI века» (Витебск, 2004), ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2005, 2006).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 13 публикациях - в 6 статьях и 7 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
В динамике развития токсического гепатита в печени крыс1-наблюдается интенсификация процессов СРО, сопровождаемая повышением активности ключевого фермента пентозофосфатного пути - Г6ФДГ, что, очевидно, может отражаться на активности ГР/ГП АОС через изменение содержания НАДФН в клетке.
С использованием гомогенных ферментных препаратов Г6ФДГ показано, что при поражении печени гепатотоксином происходят изменения кинетических параметров каталитического действия и регуляции активности под действием компонентов реакции Фентона, ГР/ГП системы, ионов некоторых металлов, интермедиатов цикла Кребса, некоторых метаболитов углеводного обмена и нуклеотидфосфатов.
При токсическом гепатите у крыс наблюдается повышение активности фермента под действием восстановленного глутатиона, уменьшение чувствительности Г6ФДГ к ингибирующему действию Н2О2, окисленного глутатиона и ионам Си . По-видимому, данные изменения регуляции активности фермента, наблюдаемые в условиях интенсификации СР процессов, могут способствовать сопряжению функционирования Г6ФДГ с ГР/ГП АОС и интенсификации ее работы за счет возрастания уровня НАДФН, генерируемого в ГбФДГ-реакции.
На основе полученных результатов по исследованию функционирования Г6ФДГ в печени крыс при токсическом гепатите, предложена гипотетическая схема, отражающая возможное участие исследуемого фермента в регуляции интенсивности протекания свободнорадикальных процессов в клетке.
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 180 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (4 главы), заключения, выводов, списка литературы и приложения. Иллюстративный материал включает 25 рисунков и 7 таблиц. В приложении содержатся 13 рисунков и 1 таблица.
Активные формы кислорода, механизм их образования и роль
По современным представлениям СР процессы играют чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности клеток, являясь необходимым этапом различных метаболических процессов. СРО способствует уничтожению отживших клеток, элиминации ксенобиотиков, предупреждает злокачественную трансформацию клеток, моделирует энергетические процессы за счет воздействия на активность дыхательной цепи в митохондриях, пролиферацию и дифференциацию клеток, транспорт ионов, участвует в регуляции проницаемости клеточных мембран, в разрушении поврежденных хромосом, в обеспечении действия инсулина [67, 71]. В то же время интенсификация СР процессов является одним из ведущих механизмов клеточной патологии, лежащей в основе многих болезней, включая сердечнососудистые заболевания, различные злокачественные процессы, аутоиммунные болезни, хронические воспаления, нейродегенеративные заболевания, и другие [15, 16, 19, 20, 46, 56, 62, 70, 72, 185, 214]. Механизмы повреждающего действия СР процессов на уровне клетки включают в себя нарушения структурных и барьерных свойств липидного слоя биомембран. Один из наиболее ранних эффектов СРО мембранных липидов -электрический пробой липидного слоя собственным мембранным потенциалом. Он приводит к потере мембраной ее барьерных свойств и, возможно, к дальнейшей активации процессов СРО [18].
В настоящее время накоплены экспериментальные и клинические данные, указывающие на существенную роль активации процессов перекисного окисления липидов при атеротромбозе и мозговой ишемии [10, 191]. Установлено, что в результате церебральной ишемии возникают нарушения пуринового обмена в нейронах с усилением продукции гипоксантина в постишемическом периоде. При ишемии происходит генерация супероксидных радикалов и пероксида водорода, вызывающих избыточную липопероксидацию мембранных структур клеток. Уровень СР реакций играет важную роль в процессах старения, аутоиммунных заболеваниях, а также при развитии рака и атеросклероза [192].
Одна из теорий старения базируется на представлении о старении митохондрий [158]. Возрастные изменения в митохондриях связаны с нарушением их внутренней мембраны и митохондриальной ДНК. Старение митохондрий приводит к увеличению «утечки» электронов в митохондриальной ЭТЦ и повышению образования АФК. Кроме того, важным симптомом старения организма являются аутоиммунные заболевания, появление которых связано с понижением Т-супрессорной активности лимфоцитов [191].
СР реакции тесно связаны с развитием целого ряда дегенеративных заболеваний, среди которых на первом месте стоят рак и атеросклероз . По-видимому, индукция и развитие раковых заболеваний связано с хромосомными нарушениями и активацией онкогенов под действием АФК [235, 239].
Избыточная продукция радикалов фагоцитами характерна для аутоиммунных заболеваний. Так, радикалы кислорода могут модифицировать антигены собственного организма таким образом, что они становятся чужеродными и к ним начинают вырабатываться антитела [181].
Гипоксия мозга, сопровождаемая реперфузией, приводит к значительному усилению ПОЛ, вероятно, в результате увеличения концентрации каталитически активного железа при поражении клеток [231].
Кислород является неотъемлемой частью жизнедеятельности подавляющего большинства живых организмов [60]. По мнению Скулачева В.П., кислород выполняет несколько функций: он является конечным акцептором электронов в дыхательной цепи; кислород необходим для образования АТФ в процессе окислительного фосфорилирования; служит субстратом ферментов - оксигеназ и оксидаз [107].
Повышение концентрации кислорода в среде выше уровня, характерного для атмосферного воздуха, является для аэробных организмов токсическим. Токсические эффекты кислорода определяются не им самим, а разнообразными кислородными радикалами, которые образуются в тканях [105, 106].
В живых организмах в процессе биологического окисления постоянно образуются АФК [33, 80, 83]. К АФК относят синглетный молекулярный кислород ]02, супероксидный анионрадикал 022, пергидроксильный радикал Н02 , пероксидный радикал RXV, гидроксил - радикал ОН", а также пероксид водорода - Н2О2 и гипохлорную кислоту НОСІ [89, 80, 8]. Несмотря на то, что Н2О2 и НОСІ не являются СР, в присутствии ионов Fe и Ог молекулы этих веществ способны быстро разлагаться с образованием ОН и НОг : 02г - малоактивный радикал и не влияет на функционирование большинства ферментов, хотя и может инактивировать некоторые из них: Са т - АТФ -азу, каталазу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, папаин и другие [185, 216, 217]. Будучи нуклеофильным соединением 02 окисляет липопротеины сыворотки и фосфолипиды мембран [117, 143], что приводит к разрушению эритроцитов [233], выходу лизосомальных ферментов и образованию цитотоксинов [73].
Супероксидный радикал может как окислять, так и восстанавливать ионы железа и других металлов переменной валентности: Fe3+ + 02 - Fe2+ + 02 В физиологических условиях Q-f индуцирует выход железа из ферритина [203] и восстанавливает Fe3+ до Fe2+, участвуя тем самым в реакциях разложения гидроперекисей, катализируемых металлами переменной валентности [220].
Влияние рН среды и температуры на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
Для характеристики любого фермента важное значение имеет константа Михаэлиса (Км). Эта кинетическая константа дает возможность оценить действие определенного фермента по отношению к данному субстрату [52]. К настоящему времени изучены каталитические свойства фермента из тканей животных, растений и микроорганизмов. В большинстве работ отмечается, что кинетика ферментативной реакции, катализируемой Г6ФДГ подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен.
Исследование кинетических свойств Г6ФДГ, очищенной из печени мышей, показало, что значения Км по НАДФ+ и Г6Ф равны 4 и 20 мкМ соответственно [198]. Ozer Nazmi et.al. изучили кинетический механизм действия и субстратную специфичность Г6ФДГ из плаценты человека. Установлено, что значения Км для глюкозо-6-фосфата и НАДФ равны 40 и 20 мкМ соответственно. НАДФ частично может быть заменен дезамино-НАДФ, но не НАД [189]. В исследованиях, проведенных Levy Н. R., показано, что Г6ФДГ из жировой ткани крысы подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Км для НАДФ составляет 1,7мМ [180]. Определено, что Г6ФДГ из хрусталика глаза быка имеет значения Км для НАДФ+ и Г6Ф равные 0,008 и 0,035 мМ, соответственно. Энергия активации катализируемой ферментом реакции равна 5,88 ккал/моль [223]. В работе Malathi S. et. al установлено, что для фермента из Aspergillus nidulans величины Км по Г6Ф и НАДФ+ равнялись соответственно 20 мкМ и 77 мкМ. Отмечено, что НАД не мог заменить НАДФ в качестве кофермента [183]. Величины Км для глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из разных объектов представлены в табл. 2.
Показано, что сродство фермента к субстрату и коферменту может изменяться в зависимости от концентраций ионов водорода. Так, при рН 8,0 и низкой ионной силе Г6ФДГ из цианобактерии АпаЬаепа sp. проявляет низкую активность и сигмоидную кинетику связывания субстрата и кофермента. При рН 7,0 ее активность увеличивается и приобретает классический гиперболический характер [152]. Для фермента из клеток бактерии A. vinelandii характерна сигмоидная форма кривой зависимости первоначальной скорости от концентрации Г6Ф при использовании в качестве кофактора как НАДФ+, так и НАД1". Коэффициент Хилла составляет 2,0 и 1,7 соответственно [123].
Изучена кинетика ферментативного окисления Г6Ф, катализируемого Г6ФДГ из зерен пшеницы, в области значений рН от 6.0 до 11.0 и в широком интервале концентраций Г6Ф и НАДФ. Доказано, что субстрат в высоких концентрациях (выше 4-6 мМ) активирует фермент при всех изученных значениях рН, тогда как избыток НАДФ приводит к ингибированию фермента в интервале рН 6.0-9.5. В связывании НАДФ и Г6Ф в фермент-субстратных комплексах участвуют группы активного центра с рК 7.2, 8.0 и 9.0. Показано, что ионизация в активном центре фермента двух групп с рК 8.0 и 9.5 может влиять на его каталитическую активность. Так, депротонирование группы с рК 9.5 приводит к возрастанию скорости ферментативной реакции, а протонирование этой группы способствует ингибированию фермента НАДФ в больших концентрациях. Установлено, что в зависимости от концентрации в растворе и величины рН фермент существовал в различных состояниях агрегации или конформации. При рН 8.0 и низкой ионной силе фермент проявлял низкую активность и сигмоидную кинетику связывания субстрата и кофактора (НАДФ+). При рН 7.0 его активность увеличивалась и кинетика приобретала классический гиперболический вид [181].
Наличие кооперативных эффектов при связывании субстрата и кофермента (НАДФ), проявляющихся в виде сигмоидной зависимости, отражающей кинетику связывания субстрата и кофермента показано также для Г6ФДГ из дрожжей [125], сладкого картофеля [188] и мышиного горошка [129]. Для фермента из клеток бактерии Azotobacter vinelandii характерна сигмоидная форма кривой зависимости начальной скорости от концентрации субстрата (глюкозо-6-фосфата) при использовании в качестве кофактора как НАДФ, так и НАД. Коэффициент Хилла составляет 2,0 и 1,7 соответственно [123].
Показано, что ионы двухвалентных металлов участвуют в регуляции активности Г6ФДГ из различных источников, но они не являются необходимыми кофакторами для проявления ферментативной активности. Принято считать, что катионы могут быть вовлечены в активацию за счет поддержания конформации молекулы фермента.
В работе Chattopadhyay Dipannita et. al. было установлено, что пероральное введение крысам СеСІг в дозе 15 мг на кг веса в течении 30 дней приводит к значительному увеличению активности Г6ФДГ в клетках эпителия кишечника крыс. Отмечено, что кадмий накапливается в растворимой фракции и фракции мембран тонкого кишечника крыс [145]. Ионы Mg2+ в концентрациях от 10 до 50 мМ стимулируют реакцию, катализируемую Г6ФДГ из Bacillus stearothermophyllus [165], Streptomyces aureofaciens [190], Aspergillus nidulans [183]. Следует отметить, что помимо Mg активаторами Г6ФДГ из Aspergillus nidulans являются также ионы Са и Мп2+ [183]. Показано, что ионы Mg2+, Мп2+ и Са2+ повышают активность Г6ФДГ из Chlamydomonas reinhardtii [147]. В концентрациях выше 1 мМ ионы Mg2+, Мп2+ и Са2+ оказывают активирующий эффект на фермент из листьев гороха (Pisum sativum L) [100]. Ashihara H., и Komamine А. показали, что Мп оказывает больший активирующий эффект, чем Mg (в концентрациях 1-4мМ), на Г6ФДГ из мышиного горошка (Phaseolus mungo) [129].
Различный активирующий эффект разных ионов, вероятно, обусловлен тем, что одни из них лучше подходят в специфический сайт фермента, чем другие. В связи с этим следует отметить, что радиус ионов Mn2+, Mg2+ и Са2+ составляет 0,46А, 0,65А и 0,99А соответственно. В некоторых работах было отмечено, что ионы некоторых металлов не изменяют ферментативную активность Г6ФДГ. Так, Grave К. показано, что ионы Mg и К не оказывают влияние на активность ферментного препарата Г6ФДГ, очищенного из клубней картофеля [155]. В присутствии двухвалентных катионов Mn2+, Mg2+, Са2+ активность частично очищенного препарата Г6ФДГ из плодов яблони также не изменялась [23].
Было установлено, что в регуляции активности Г6ФДГ могут принимать участие ацетальдегид и инсулин. Так, после введения 10 мкМ ацетальдегида в первичную культуру гепатоцитов взрослых крыс активность Г6ФДГ повышалась на 40% через 24 часа. Отмечено, что инсулин в дозе 30 мг/мл повышал активность фермента. Показан стимулирующий эффект инсулина на общую активность Г6ФДГ из печени крыс, усиливаемый дексаметазоном и проявляющийся через 12-48 часов после введения гормонов в культурную среду. Следует отметить, что влияние инсулина на активность Г6ФДГ в печени крыс зависит от возраста. У молодых животных повышение активности отмечается уже через 2-4 ч после введения инсулина и связано как с механизмами срочной регуляции активности, так и с индукцией фермента. Показано, что физиологические дозы адреналина повышают гемолитическую резистентность и стимулируют активность Г6ФДГ. Высказано предположение о регуляторной роли адреналина в переключении метаболизма глюкозы с гликолитического на пентозофосфатный путь [169].
Определение содержания первичных и вторичных продуктов пероксидного окисления липидов
Известно, что пероксидное окисление липидов - постоянно протекающий в организме процесс. Установлено, что при определенной интенсивности ПОЛ является частью нормальных метаболических процессов и способствует самообновлению мембранных структур. Процессам ПОЛ принадлежит существенная роль в регуляции метаболизма мембранных липидов, изменении физико-химических свойств и проницаемости мембран в физиологических условиях [9, 15]. Однако, при действии ряда факторов ПОЛ приобретает патогенетический характер, а образующиеся в процессе развития ПОЛ ненасыщенные альдегиды и МДА являются мутагенами и обладают выраженной цитотоксичностью [209].
Как известно, печень является органом, где происходит детоксикация практически всех ксенобиотиков, попадающих в организм, что делает ее основной мишенью при токсическом повреждении различной этиологии. Четыреххлористый углерод является органоспецифичным токсином, обладающим ярко выраженным гепатотропным действием. В основе механизма токсического действия четыреххлористого углерода лежит существование в печени гомолитического пути распада тетрахлорметана ССІ4- СС1з +С1" [ИЗ]. Радикалы-метаболиты повреждающего агента инициируют процессы пероксидного окисления ненасыщенных жирных кислот в мембранах клеток печени. Кроме того, трихлорметильный радикал СС1з связывается с липидами микросомальных мембран, активирует кислород, который в свою очередь взаимодействует с макромолекулами (белками, нуклеиновыми кислотами). Восстановление четыреххлористого углерода до трихлорметилового радикала катализируется комплексом оксидаз смешанной функции, состоящим из флавопротеинов, НАДФН-зависимой Р-450 редуктазы, НАДН-цитохром Ь5 редуктазы и оксидазы цитохрома Р-450 [55]. Очень часто центральную роль во многих патофизиологических процессах, связанных со СРО, играют продукты пероксидации липидов, приводящие к модификации белков и других биомолекул [216].
В связи с тем, что четыреххлористый углерод играет немаловажную роль в инициации СР процессов, сопровождающихся накоплением продуктов ПОЛ нами было проведено исследование содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в гомогенате печени крыс в динамике развития токсического гепатита. Показано, что в условиях нормы содержание ДК и МДА составило 0,843 ± 0,042 Моль/г сырой массы 10 5 И 0,200 ±0,010 Моль/г сырой массы 10"5 соответственно, что свидетельствует о протекании процессов ПОЛ в печени крыс контрольной группы на низком стационарном уровне. Полученные данные позволяют предположить отсутствие выраженного окислительного стресса у крыс контрольной группы. Следует отметить, что в ходе развития токсического гепатита происходит постепенное накопление продуктов ПОЛ. После однократного введения гепатотоксина содержание ДК и МДА в пораженном органе возрастает в 1,2 и в 1,4 раза соответственно уже на первые сутки развития ЭТГ. В ходе развития токсического гепатита уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ продолжает расти. Так, на четвертые сутки в пораженной печени количество ДК и МДА увеличивается в 2,9 и в 3,0 раза соответственно по сравнению со значениями в норме (таблица 4).
По мнению ряда авторов [61, 94] по величине соотношения ДК/МДА либо МДА/ДК в определенной степени можно судить об общей направленности и интенсивности процессов СРО и характеризовать функциональное состояние АОС. Необходимо отметить, что отношения содержания МДА и ДК, отражающее глубину развития ПОЛ, повышается на первые сутки после введения гепатотоксина, однако на вторые и третьи сутки соотношение МДА/ДК снижается по сравнению со значениями в норме. Определено, что на четвертые сутки ЭТГ отношение содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ увеличивается и незначительно отличается со значениями в норме (таблица 4). Снижение величины МДА/ДК, наблюдаемое после введения ССЦ, по сравнению со средними показателями данного соотношения у контрольных животных, по всей вероятности, свидетельствует об адаптивном повышении функциональной мощности АОС, обусловливающей меньшую интенсивность превращения первичных в более токсичные промежуточные и конечные продукты пероксидации липидов. Изменение удельного вклада промежуточных продуктов ПОЛ в общую интенсивность процессов пероксидации, в определенной степени характеризует функциональное состояние системы АОЗ организма и протекание дальнейших стадий ПОЛ.
Таким образом, в условиях оксидативного стресса, наблюдаемого при токсическом гепатите происходит значительная интенсификация процессов СРО, сопровождаемая накоплением первичных и вторичных продуктов ПОЛ.
Как известно, продукты ПОЛ, и в частности МДА являются более стабильными, чем АФК и могут более быстро диффундировать внутрь клетки, где они могут реагировать с разнообразными биомолекулами [217]. В настоящее время вклад продуктов ПОЛ в развитии различных патологических состояниях широко исследуется. В этой связи необходимо отметить, что в литературе имеются данные о взаимосвязи между СР процессами, сопровождающимися накопление продуктов ПОЛ и течением ряда заболеваний. Существенная патогенетическая роль ПОЛ была установлена при непрерывно-прогредиентной шизофрении, остром и хроническом алкогольном гепатитах, при менингитах и менингоэнцефалитах, что проявлялось повышением уровня МДА и ДК [86, 93, 104]. Рачкаускас Г.С. с соавт. установлено также, что при приступообразно-прогредиентной шизофрении имеет место достоверное повышение активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы [92, ПО].
Повышение уровня продуктов липопероксидации в органах и тканях, наблюдаемое при вирусных гепатитах, оказывает неблагоприятное влияние на структурно-функциональное состояние клеток, в том числе гепатоцитов, вызывая в них процессы автолиза и самоокисления [29].
Очистка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс
АТФ, АДФ и АМФ являются энергетически важными соединениями, необходимыми для жизнедеятельности. АТФ - связующее звено между экзергоническими и эндергоническими реакциями, выполняет роль универсального донора химической энергии, создает общий клеточный фонд энергии. Кроме того АТФ играет важную роль в синтезе б -трифосфатов рибонуклеозидов и 2-дезоксирибонуклеозидов, которые не только служат предшественниками в синтезе РНК и ДНК, но и играют важную роль в синтезе белков и полисахаридов [31].
Установлено, что при многих патологических состояниях в клетках происходят метаболические нарушения, приводящие к изменению содержания адениннуклеотидов, являющихся индикаторами энергетического состояния клетки [22]. Показано, что в присутствии АТФ, АДФ, а также орто- и пирофосфатов ускоряется окисление Fe кислородом [16]. Возможно, все эти соединения могут таким образом регулировать ПОЛ на стадии инициирования цепей.
Нами проведено исследование влияния АТФ, АДФ и АМФ в концентрациях от 0,01 мМ до 2,0 мМ на активность Г6ФДГ в норме и при патологии печени, инициированной воздействием четыреххлористого углерода.
Обнаружено, что данные метаболиты оказывают разнонаправленное воздействие на исследуемый фермент в норме и при патологии.
Результаты исследования влияния АТФ показали, что данное соединение ингибирует по неконкурентному типу Г6ФДГ из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс (рис. 18а, таблица 7; рис.11 приложения). В условиях нормы наблюдался более сильный ингибирующий эффект, чем при ЭТГ. Следует отметить, что наиболее выраженное торможение ферментативной активности в норме и при ЭТГ наблюдается при концентрациях метаболита до 0,4 мМ. При более высоких концентрациях ингибитора - 0,6-2,0 мМ кривые выходят на плато.
Действие АДФ на Г6ФДГ носит сложный характер. При низких концентрациях АДФ (до 0,02 мМ) наблюдается незначительное повышение активности фермента из печени крыс как в норме, так и при токсическом гепатите. При дальнейшем повышении концентрации АДФ наблюдается угнетение активности Г6ФДГ, более выраженное для фермента из патологичесчески измененной печени (рис. 186). К;, определенные в диапазоне концентраций от 0,08 мМ до 0,40 мМ, составили 0,42 и 0,30 мМ соответственно (таблица 7; рис.12 приложения). При более высоких концентрациях АДФ - 0,4-2,0 мМ, степень ингибирования Г6ФДГ при ЭТГ снижается, однако активность фермента остается значительно ниже исходного уровня. Так, при 2,0 мМ концентрации АДФ активность фермента составляет 72,1% от исходного уровня. Что касается фермента, выделенного из печени крыс контрольной группы, то в данном случае АДФ не оказывает статистически достоверного воздействия на Г6ФДГ в концентрациях от 0,8 мМ до 2,0 мМ.
В условиях нормы наблюдается активирующий эффект АМФ на Г6ФДГ при концентрациях метаболита до 1,0 мМ. При дальнейшем повышении концентрации АМФ до 2,0 мМ имеет место незначительное ингибирование активности Г6ФДГ. При ЭТГ данный нуклеотид активирует Г6ФДГ во всем диапазоне исследуемых концентраций (рис.18в). Отмечено, что наиболее заметное повышение активности Г6ФДГ в норме и при патологии наблюдается в присутствии АМФ в концентрациях до 0,2 мМ.
Полученные результаты согласуются с данными из литературных источников. Так, имеется информация о том, что АТФ оказывает ингибирующее действие на фермент, выделенный из клубней картофеля {Solanum tuberosum L.) [155], из Zymomonas mobilis [122], из Pseudomonas W6 [203]. Кроме того, для Г6ФДГ из мозга крысы установлено, что АТР является неконкурентным ингибитором по отношению к НАДФ+, но действует по смешанному механизму по отношению к субстрату [130]. Г6ФДГ из зародышей пшеницы ингибируется АТФ (ингибирование составляет 34% от контроля при 2,0 мМ концентрации АТФ). Что касается АДФ и АМФ, то данные метаболиты в концентрациях до 5,0 мМ не оказывают существенного влияния на активность Г6ФДГ, выделенной из клубней картофеля [155].
Таким образом, нами показано, что адениннуклеотиды могут принимать участие в регуляции активности фермента. Выявлено, что фермент из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс характеризуется различной чувствительностью к данным соединениям. Ингибирующее действие АТФ и АДФ, возможно, связано со способностью данных соединений выступать в качестве хелаторов ионов Mg2+, являющихся кофактором Г6ФДГ. Активирующий эффект АМФ можно объяснить отсутствием в его структуре двух фосфатных групп, по-видимому, играющих существенную роль во взаимодействии с молекулой фермента.
Выявленные изменения регуляции активности Г6ФДГ под действием адениннуклеотидов при токсическом поражении печени могут иметь значение для регуляции клеточного метаболизма в условиях патологии.
