Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 9
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
1.1. Свободнорадикальное окисление и
антиоксидантные системы организма 15
Свободнорадикальное окисление биомолекул 15
Пероксидное окисление липидов и его роль в
живых организмах 15
Активные формы кислорода 20
Антиоксидантные системы организма 23
Ферментативные антиоксиданты 24
Макромолекулярные неферментативные антиоксиданты 26
Низкомолекулярные неферментативные антиоксиданты 27
1.1.5. Роль ионов некоторых металлов в протекании
свободнорадикальных процессов 29
1.2. Ишемия миокарда 31
Понятие об ишемической болезни сердца 31
Изменение метаболизма кардиомиоцитов
в условиях ишемии 33
Роль пероксидного окисления липидов и активных форм кислорода в патогенезе ишемического повреждения сердца 35
Роль апоптоза в ишемическом повреждении ткани сердца 39
Диагностика инфаркта миокарда 40
1.3. Характеристика НАД- и НАДФ-зависимых
малатдегидрогеназ 41
Ферменты, участвующие в метаболизме маната 41
Характеристика НАДФ-малатдегидрогеназы
из различных организмов 43
1.3.2.1. Реакция, катализируемая ферментом 43
Внутриклеточное распределение НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы и ее участие в физиолого-биохимических процессах 43
Очистка фермента 44
Структурная организация и молекулярная масса НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы. Исследование
активного центра фермента 45
1.3.2.5. Кинетическое поведение и регуляция активности
НАДФ-малатдегидрогеназы 47
1.3.2.5.1. Сродство к субстрату и кофакторам.
Влияние температуры и рН среды на активность фермента 47
1.3.2.5.2. Регуляция активности НАДФ-малатдегидрогеназы 48
1.3.3. НАД-зависимая малатдегидрогеназа:
локализация, очистка, структурная организация, свойства 50
Реакция, катализируемая ферментом 50
Распространение и участие в физиолого-биохимических процессах 51
Изоформы и внутриклеточная локализация НАД-зависимой малатдегидрогеназы 52
Очистка НАД-зависимой МДГ из различных объектов 55
Структурная организация и молекулярная масса НАД-малатдегидрогеназы из различных объектов 58
Исследование активного центра фермента 64
Кинетическое поведение и регуляция активности НАД-малатдегидрогеназы 66
1.3.3.7.1. Сродство к субстратам и кофакторам.
Субстратная специфичность 66
Влияние температуры и рН среды на активность НАД-малатдегидрогеназы 68
Регуляция активности
НАД-зависимой малатдегидрогеназы 71
1.3.3.7.4. Аллостерические свойства НАД-малатдегидрогеназы 75
1.3.3.8. Перспективы практического применения
НАД-зависимой малатдегидрогеназы 76
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 79
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 79
Объект исследования 79
Создание модели экспериментальной ишемии миокарда 79
Получение субклеточных фракций кардиомиоцитов 79
Определение интенсивности процессов СРО
методом биохемилюминесценции 80
Определение содержания малонового диальдегида 82
Определение содержания диеновых конъюгатов 83
Определение активности ферментов 84
Определение количества белка 85
Выделение и очистка ферментов 85
Экстракция 86
Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 86
Гель-фильтрация 87
Ионообменная хроматография 88
2.10. Исследование кинетических характеристик
и регуляции активности ферментов 88
Электрофорез в полиакриламидном геле 89
Определение молекулярной массы 89
Статистическая обработка экспериментальных данных 90 ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ОКСИДАТИВНОГО СТАТУСА И АКТИВНОСТЕЙ НАД- И НАДФ-МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗ
В МИОКАРДЕ КРЫС В НОРМЕ И
ПРИ ЭКСПРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ 91
3.1. Измерение параметров биохемилюминесценции
в субклеточных фракциях кардиомиоцитов крысы
в норме и при ишемии различной длительности 91
3.2. Определение содержания первичных и вторичных
продуктов пероксидного окисления липидов
в субклеточных фракциях кардиомиоцитов крысы
в норме и при ишемии 96
3.3. Активности и субклеточная локализация НАД- и
НАДФ-малатдегидрогеназ в кардиомиоцитах крысы
в норме и при патологии 99
ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ И
РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ
НАД-ЗАВИСИМОЙ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ
ИЗ СЕРДЦА КРЫСЫ В НОРМЕ И ПРИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ 103
Очистка митохондриальной и цитоплазматической НАД-малатдегидрогеназы из нормального и ишемизированного миокарда крысы 103
Исследование некоторых кинетических свойств изоформ НАД-зависимой малатдегидрогеназы
из нормального и ишемизированного миокарда крысы 106
Молекулярная масса изоформ НАД-малатдегидрогеназы из сердца крысы в норме и при патологии 114
Влияние рН среды на активность различно локализованных форм НАД-зависимой малатдегидрогеназы
из нормального и подвергшегося ишемии сердца 115
Влияние температуры на функционирование НАД-малатдегидрогеназы из сердца крысы в норме и при ишемии 118
Регуляторные свойства изоформ НАД-малатдегидрогеназы
из сердечной мышцы крысы в норме и при патологии 122
4.6.1. Влияние ионов некоторых металлов на
активность НАД-малатдегидрогеназы 122
Влияние пероксида водорода на функционирование НАД-малатдегидрогеназы в норме и при патологии 125
Регуляция НАД-зависимой малатдегидрогеназы
под действием глутатиона 129
Регуляция активности НАД-малатдегидрогеназы из миокарда крысы в норме и при ишемии под действием интермедиатов цикла Кребса 132
Исследование регуляции активности НАД-малатдегидрогеназы из кардиомиоцитов
крысы адениннуклеотидами 140
ГЛАВА 5. КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ И
РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА НАДФ-МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ
ИЗ СЕРДЦА КРЫСЫ В НОРМЕ И ПРИ ИШЕМИИ 143
5.1. Очистка НАДФ-малатдегидрогеназы из нормального
и ишемизированного миокарда 143
5.2. Кинетические параметры НАДФ-малатдегидрогеназы
из кардиомиоцитов крысы в норме и при ишемии 144
5.3. Молекулярная масса НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы
из нормального и ишемизированного миокарда 149
5.4. Влияние рН среды на функционирование фермента
в норме и при патологии 150
Исследование влияния температуры на активность НАДФ-малатдегидрогеназы из нормального и ишемизированного сердца крысы 152
Исследование регуляции активности
НАДФ-малатдегидрогеназы 155
5.6.1. Регуляция активности НАДФ-малатдегидрогеназы
под действием ионов некоторых металлов 155
Влияние пероксида водорода на активность фермента 158
Регуляция НАДФ-малатдегидрогеназы
под действием глутатиона 158
5.6.4. Исследование влияния интермедиатов
цикла трикарбоновых кислот на активность
НАДФ-малатдегидрогеназы из сердца крысы
в норме и при ишемии 163
5.6.5. Исследование функционирования НАДФ-зависимой
малатдегидрогеназы из кардиомиоцитов крысы в норме и при
патологии в присутствии адениннуклеотидов 166
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 169
ВЫВОДЫ 177
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 179
ПРИЛОЖЕНИЕ 224
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АОС - антиоксидантная система
АФК - активные формы кислорода
БХЛ - биохемилюминесценция
ДДС-Na - додецилсульфат натрия
ДК - диеновые конъюгаты
ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтил-целлюлоза
ИБС — ишемическая болезнь сердца
ИОХ - ионообменная хроматография
КК - креатинкиназа
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
МДА — малоновый диальдегид
МДГ - малатдегидрогеназа
НАД-МДГ - НАД-зависимая малатдегидрогеназа
НАДФ-МДГ - НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа
ОА - оксалоацетат
ПОЛ - пероксидное окисление липидов
СДГ - сукцинатдегидрогеназа
СОД — супероксиддисмутаза
ТБК - тиобарбитуровая кислота
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ФЕП - фосфоенолпируват
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭТЦ — электрон-транспортная цепь
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время одной из важнейших проблем биохимии является исследование функционирования метаболических систем разного уровня в условиях развития патологического процесса. Согласно современным воззрениям, в основе патогенеза многих заболеваний, в том числе и заболеваний сердечно-сосудистой системы, лежит нарушение баланса между интенсивностью свободнорадикальных процессов и активностью антиоксидантных систем (АОС) организма (Панкин, 2000; Бурлакова, 1980; Меерсон, 1982). Активные формы кислорода (АФК), выполняющие в организме ряд функций, при интенсификации их образования способны приводить к нарушению клеточного метаболизма и, как следствие, к гибели клеток (Кулинский, 1999). Интенсивность свободнорадикальных процессов, в которых принимают участие АФК, регулируется сложной, многоступенчатой системой антиоксидантной защиты (Young, 2001). Предполагается, что одним из механизмов подавления процессов СРО в митохондриях может служить ингибирование ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) (Skulachev, 1996). В этой связи вызывает интерес функционирование НАД-зависимой малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37; НАД-МДГ), катализирующей в ЦТК обратимое превращение малата в оксалоацетат. Цитоплазматическая форма НАД-МДГ участвует в обеспечении транспорта метаболитов между клеточными компартментами. Имеются данные о значительной роли субстрата МДГ - малата - в биохимической адаптации организма к гипоксии (Глотов, 1973). Способность малата диффундировать в митохондрии, передавая восстановительные эквиваленты в электрон-транспортную цепь (ЭТЦ), и повышать коэффициент дыхательного контроля митохондрий сердца (Малюк, 1977), а также высокое содержание МДГ по сравнению с другими дегидрогеназами субстратов цикла Кребса (Pette, 1962) подчеркивают ее важное место в регуляции редокс-потенциала
10 кардиомиоцитов. Все эти факты, наряду со способностью малата играть существенную роль в первичной реакции на стрессовые воздействия из-за возможности его быстрой утилизации, позволяют сделать предположение о возможном участии МДГ в регуляции образования АФК в условиях окислительного стресса. Кроме того, нельзя исключить, что НАДФН, образующийся в реакции обратимого превращения малата в оксалоацетат, катализируемой НАДФ-зависимой МДГ (КФ 1.1.1.82; НАДФ-МДГ), может использоваться при функционировании глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной системы - одной из важнейших ферментативных АОС организма. Хотя традиционно принято считать, что основным поставщиком НАДФН в клетке является пентозофосфатный путь, однако в кардиомиоцитах активность ферментов данного пути значительно ниже, чем в других органах (Диксон, 1982) и в качестве дополнительного источника НАДФН в клетках миокарда могут выступать другие ферменты, например, НАДФ-специфичная изоцитратдегидрогеназа (Медведева, 2002).
Таким образом, исследование особенностей функционирования НАД- и НАДФ-зависимых МДГ при усилении интенсивности СРО в условиях ишемического повреждения ткани миокарда может способствовать выяснению механизмов регуляции свободнорадикальных процессов и образования АФК, что может иметь значение для понимания развития патологического состояния организма и путей его коррекции.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось исследование кинетических свойств и регуляции активности НАД- и НАДФ-МДГ из сердца крысы при оксидативном стрессе, вызванном ишемическим повреждением ткани миокарда. В связи с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Определение интенсивности процессов СРО в субклеточных фракциях кардиомиоцитов крыс в норме и в динамике развития экспериментальной ишемии миокарда.
Определение активностей и субклеточной локализации НАД- и НАДФ-МДГ в клетках миокарда в норме и при ишемии.
Получение высокоочищенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-зависимых МДГ из нормального и ишемизированного миокарда крысы.
Сравнительная характеристика кинетических параметров каталитического действия НАД- и НАДФ-МДГ из сердца контрольных животных и крыс, подвергшихся воздействию экспериментальной ишемии.
Исследование регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ из сердечной мышцы крысы в норме и при патологии.
6. Создание гипотетической модели участия НАД- и НАДФ-МДГ в
регуляции интенсивности СРО в клетках миокарда в условиях ишемического
повреждения ткани.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование функционирования НАД- и НАДФ-МДГ в кардиомиоцитах крысы в условиях увеличения интенсивности процессов СРО при ишемии. Разработаны процедуры выделения и очистки и получены гомогенные препараты различно локализованных изоформ НАД- и НАДФ-МДГ из нормального и ишемизированного миокарда крыс. Впервые дана сравнительная характеристика каталитических свойств и регуляции активности данных ферментов в сердечной мышце в норме и при экспериментальной ишемии миокарда. Выявлено изменение активности, кинетических и регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ в условиях окислительного стресса, вызванного ишемией. Предполагается участие НАД- и НАДФ-МДГ в регуляции генерирования АФК и интенсивности СРО в условиях ишемического повреждения ткани. Полученные данные свидетельствуют, что контроль образования АФК может осуществляться за счет изменения активности данных ферментов, происходящего в результате модификации кинетических свойств и регуляции активности под действием ионов металлов Fe , Са , пероксида водорода, глутатиона, интермедиатов цикла Кребса и адениннуклеотидов. Полученные данные способствуют расширению и
12 углублению фундаментальных представлений об организации, регуляции и механизмах сопряжения выработки АФК с функционированием ключевых ферментов клеточного метаболизма в условиях нормы и патологии сердца.
Практическая значимость. Исследование особенностей
кинетических и регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ в условиях окислительного стресса, развивающегося при ишемии миокарда, способствует выяснению механизмов регуляции образования АФК, что играет существенную роль в понимании развития патологического процесса и поиске путей его коррекции в медицинской практике.
Разработанные способы получения высокоочищенных препаратов НАД- и НАДФ-МДГ из миокарда крысы могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», «Медицинская биохимия» (для студентов физического факультета), спецкурсов по энзимологии и аналитической биохимии. Кроме того, они используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ.
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 6ой, 7ой и 8ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2002, 2003, 2004), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2002), III Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2003), конференции молодых ученых ВГМА «Перспективы развития теоретической и практической медицины» (Воронеж, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 3-ей междисциплинарной конференции с международным участием "НБИТТ-21" (Петрозаводск, 2004), X Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных
13 процессов» (Воронеж, 2004), VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), VI Съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2004), ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2004).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 18 публикациях - 8 статьях и 10 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
В условиях интенсификации СРО при экспериментальной ишемии миокарда происходит снижение активности НАД-МДГ в митохондриях и цитоплазме клеток миокарда и увеличение активности НАДФ-МДГ в цитоплазматической фракции клеток сердца крысы. С использованием гомогенных ферментных препаратов различно локализованных форм НАД-МДГ и цитоплазматической НАДФ-МДГ показано, что в условиях патологии изменяется ряд кинетических параметров каталитического действия и регуляции активности ферментов под действием ионов металлов Fe2+, Си+, Са+, пероксида водорода, глутатиона, интермедиатов цикла Кребса и адениннуклеотидов.
Ряд модификаций регуляторных свойств митохондриальной и цитоплазматической НАД-МДГ, характерных для фермента из ишемизированного миокарда, такие как повышение степени ингибирования ионами Fe +, Си2+, некоторыми интермедиатами цикла Кребса, ингибирование восстановленным глутатионом, могут приводить к снижению активности НАД-МДГ, сопровождающимся торможением ЦТК при ишемии и, как следствие, окислению ферментов ЭТЦ - восстановителей 02 до 02"~.
Имеет место ряд изменений регуляторных свойств НАДФ-МДГ из ишемизированной ткани миокарда по сравнению с нормой (снижение
14 чувствительности к ингибирующему действию пероксида водорода, отсутствие ингибирования окисленным глутатионом), которые могут способствовать стимуляции фермента. Это может отражаться на активности глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС через изменение содержания НАДФН в клетке. 4. С учетом полученных данных по исследованию функционирования НАД- и НАДФ-МДГ в миокарде крысы в условиях ишемии предложена гипотетическая схема, отражающая их возможное участие в регуляции интенсивности СРО.
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 264 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы (383 источника) и приложения. Иллюстративный материал включает 38 рисунков и 14 таблиц. В приложении содержатся 37 рисунков и 3 таблицы.
