Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы
1.1 Биохимические механизмы поражения нервных клеток при ишемии 14
1.1.1 Этап инициации 16
1.1.2 Этап экспрессии 19
1.1.3 Этап терминации 23
1.2 Различия в чувствительности нейронов разных областей мозга к ишемическому воздействию 24
1.2.1 Области мозга, особо чувствительные к ишемии 25
1.2.2 Причины селективной гибели клеток : 27
1.3 Токсическое действие глутамата при ишемии 31
1.3.1 Пути выброса глутамата при ишемии 32
1.3.2 Типы глутоматных рецепторов 33
1.3.3 Эксайтотоксичность при ишемии и нейродегеперативных заболеваниях 35
1.4 Образование свободных радикалов при ишемии 36
1.4.1 Типы свободных радикалов 37
1.4.2 Пути образования свободных радикалов при ишемии 39
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования
2.1 Модели токсического действия глутамата при ишемии 50
2.1.1 Модель воздействия глутамата на нервные окончания мозга 50
2.1.2 Модель глобальной ишемии переднего мозга in vivo 52
2.1.3 Микродиализ при глобальной ишемии переднего мозга in vivo 53
2.2 Показатели метаболических процессов в ткани мозга 54
2.2.1 Определение внутриклеточной концентрации ионов кальция 54
2.2.2 Определение активности Na+,1С -АТФазы 55
2.2.3 Определение содержания малонового диалъдегида 57
2.2.4 Определение входа 4 Са + в синаптосомы 57
2.2.5 Определение содержания диеновых конъюгатов 58
2.2. б Определение концентрации нейромедиаторных аминокислот 58
2.2.7 Определение содержания белка 60
2.2.8 Определение содержания фосфора неорганического 60
2.3 Анализ данных и статистическая обработка результатов 61
2.3.1 Анализ данных, полученных in vitro 61
2.3.2 Анализ данных, полученных in vivo 62
ГЛАВА 3 Результаты
3.1 Роль различных путей образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата in vitro 64
3.1.1 Действие глутамата и ингибиторов реакций образования свободных радикалов на показатели метаболизма в сшаптосомах коры больших полушарий 64
3.1.2 Действие глутамата и ингибиторов реакций образования свободных радикалов на показатели метаболизма в синаптосомах стриатума 77
3.1.3 Действие глутамата и ингибиторов реакций образования свободных радикалов на показатели метаболизма в синаптосомах гиппокампа 82
3.2 Роль фосфолипазного пути образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата in vivo 88
3.2.1 Действие ишемии и реперфузии на внеклеточную концентрацию нейромедиаторных аминокислот, активность Na+,К-АТФазы и накопление диеновых конъюгатов 89
3.2.2 Действие ингибиторов фосфолипазы А2 и циклооксигеназы на активность Ыа+Х-АТФазы и накопление диеновых конъюгатов при глобальной церебральной ишемии 94
ГЛАВА 4 Обсуждение
4.1 Роль различных путей образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата in vitro 100
4.1.1 Участие свободных радикалов в токсическом действии глутамата 100
4.1.2 Роль NO-синтазного пути образования свободных радикалов... 103
4.1.3 Роль фосфолипазного пути образования свободных радикалов 106
4.1.4 Роль ксантиноксидазного пути образования свободных радикалов 108
4.1.5 Роль митохондриального пути образования свободных радикалов 109
4.2 Роль фосфолипазного пути образования свободных рдикалов в токсическом действии глутамата in vivo 111
4.2.1 Общая характеристика модели глобальной церебральной ишемии и реперфузии 1 11
4.2.2 Роль фосфолипазного пути образования свободных радикалов в окислительном ингибировании Na+,lC-АТФазы и накоплении диеновых конъюгатов при ишемии и реперфузии 114
Заключение 118
Выводы 124
Список литературы 126
- Этап инициации
- Модель воздействия глутамата на нервные окончания мозга
- Действие глутамата и ингибиторов реакций образования свободных радикалов на показатели метаболизма в сшаптосомах коры больших полушарий
- Участие свободных радикалов в токсическом действии глутамата
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ишемия головного мозга возникает в результате снижения мозгового кровотока при окклюзии артерий мозга или нарушениях системного кровообращения. На сегодняшний день эффективный способ лечения последствий глобальной церебральной ишемии неизвестен, поэтому изучение метаболических нарушений, происходящих в нервных клетках при ишемии головного мозга и приводящих к нарушению функции нейронов, является актуальной задачей.
При глобальной церебральной ишемии мозговой кровоток снижается в различных областях головного мозга, вызывая гибель нейронов в особо чувствительных к ишемии областях мозга, таких как кора головного мозга, стриатум и гиппокамп. Процесс гибели нейронов возможно предотвратить лишь на ранних этапах развития ишемического поражения, тогда как сама гибель клеток происходит через несколько дней после начала заболевания (Lipton, 1999, Demaerschalk, 2003). Динамика ишемического поражения нейронов в значительной мере отличается в разных областях головного мозга, что может быть обусловлено биохимическими особенностями каскада патологических реакций (Sims, Zaidan, 1995).
Недостаточное снабжение нервной ткани кислородом при снижении мозгового кровотока приводит к сокращению выработки АТФ и как следствие к нарушению активного ионного транспорта, деполяризации плазматической мембраны нейронов и выбросу во внеклеточное пространство нейротрансмиттеров, в частности глутамата (Phillis, O'Regan, 2000, Erecinska, Silver, 2001). Выброс глутамата во внеклеточное пространство, активация его рецепторов и повышение внутриклеточной концентрации свободного кальция ([Са ]j) являются ключевыми событиями каскада патобиохимических реакций, приводящих к формированию инфаркта мозга. При этом происходит стимуляция работы кальций-зависимых протеаз, фосфолипаз и эндонуклеаз, окислительная деструкция белков и ДНК, и как следствие, активация процесса
клеточной гибели (Lipton, 1999). Для стойкого увеличения [Са ]j, необходимого для запуска каскада патобиохимических реакций при ишемии, одного входа Са через ионотропные глутаматные рецепторы недостаточно. Активация этих рецепторов инициирует обменные процессы, которые приводят к устойчивому повышению [Ca2+]i (Paschen, 2000, Limbrick et al., 2001). К числу таких процессов относят и образование свободных радикалов. Ранее считалось, что активация свободнорадикальных реакций происходит непосредственно перед гибелью нервных клеток. Однако в последнее время появились свидетельства того, что повышение образования свободных радикалов характерно и для ранних стадий ишемического поражения нейронов, усугубляя дисбаланс ионов Са и приводя к повышению их концентрации в цитозоле (Mattson et al., 1995, Castilho et al., 1999, Pereira, Oliveira, 2000, Starkov et al., 2004). Образование свободных радикалов при ишемии происходит за счет активации ряда ферментативных реакций, в том числе катализируемых фосфолипазой А2, циклооксигеназой, NO-синтазой и ксантиноксидазой, а так же в результате работы электрон-транспортной цепи митохондрий. Различия в механизме образования свободных радикалов могут, наряду с другими факторами, определять региональные особенности ишемической гибели нейронов в наиболее чувствительных к ишемии областях головного мозга (Sims, Zaidan, 1995).
Таким образом, как свидетельствуют данные последних лет, повышенное образование свободных радикалов, происходящее в нервных клетках при действии на них токсических концентраций глутамата при ишемии, может, по-видимому, вносить вклад в нарушение гомеостаза ионов кальция. При этом в различных областях головного мозга могут преимущественно активироваться разные пути образования свободных радикалов (фосфолипазный, NO-синтазный, митохондриальный и другие), что может обуславливать особенности механизма гибели нейронов в этих областях. Это определяет актуальность изучения вклада разных путей образования свободных радикалов
в нарушения метаболизма в нервных окончаниях из разных областей головного мозга при действии на них глутамата.
Синаптосомы, представляющие собой выделенные нервные окончания, содержат практически все органеллы нервных клеток, кроме ядра, и являются удобной моделью для изучения метаболических нарушений на ранних этапах токсического действия глутамата, предшествующих изменению экспрессии генов. Эта модель была выбрана для проведения исследований роли флсфлипазного, NO-синтазного, ксантиноксидазного и митохондриального путей образования свободных радикалов в нарушении ионного гомеостаза под действием глутамата в нервных окончаниях коры головного мозга, стриатума и гиппокампа. Для подтверждения полученных результатов было проведено сравнительное изучение влияния ингибиторов арахидонатного пути образования свободных радикалов на метаболические нарушения в нервной ткани коры, стриатума и гиппокампа, вызванные глобальной церебральной ишемией и реперфузией.
Цель и задачи исследований. Целью данного исследования является сравнительное изучение роли различных путей образования свободных радикалов в инициации вызванных глутаматом нарушений метаболизма в нервных окончаниях из трех отделов переднего мозга (кора больших полушарий, стриатум, гиппокамп). Поставленная цель достигается путем решения ряда задач, среди которых необходимо выделить следующие:
Изучение действия глутамата на [Ca2+]j, вход 45Са2+, активность Na+, К+-АТФазы и накопление конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) малонового диальдегида (МДА) в выделенных нервных окончаниях (синаптосомах) коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа in vitro.
Определение влияния антиоксидантов на изменение [Ca2+]j, входа 45Са2+ в синаптосомы, активности Na+, К+-АТФазы и содержания МДА, вызванное глутаматом в синаптосомах коры головного мозга.
Определение влияния ингибиторов фосфолипазы А2, циклооксигеназы, ксантиноксидазы, NO-синтазы и комплекса I электрон-транспортной цепи
митохондрий на обусловленное глутаматом изменение изученных параметров в синаптосомах коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа in vitro.
Изучение действия глобальной церебральной ишемии и реперфузии in vivo на внеклеточную концентрацию глутамата, аспартата и глицина в стриатуме.
Изучение действия глобальной церебральной ишемии и реперфузии, а также ингибиторов фосфолипазы А2 и циклооксигеназы на активность Na+, К+-АТФазы и накопление продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) в коре головного мозга, стриатуме и гиппокампе.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение роли
различных путей образования свободных радикалов (NO-синтазного,
фосфолипазного, циклооксигеназного, ксантиноксидазного и
митохондриального) в вызванном глутаматом нарушении метаболизма в нервных окончаниях разных областей переднего мозга. Объектами исследования были области мозга, наиболее чувствительные к ишемии - кора больших полушарий, стриатум и гиппокамп. Впервые были отмечены существенные региональные особенности механизмов нарушения метаболизма в нервных окончаниях коры головного мозга, стриатума и гиппокампа при действии токсических доз глутамата. Так, было показано большее влияние NO-синтазного пути образования свободных радикалов на нарушения метаболизма синаптосом коры мозга и стриатума, чем гиппокампа. Впервые были описаны различия во вкладе фосфолипазного пути образования свободных радикалов в нарушении метаболизма при действии глутамата и ишемическом повреждении нервной ткани различных областей переднего мозга. Показано, что этот путь образования свободных радикалов в большей степени участвует в ишемическом поражении коры головного мозга, чем стриатума.
Научно-практическое значение. Проведенное исследование вносит вклад в понимание процессов, происходящих на ранних этапах ишемии и токсического действия глутамата на клетки мозга. Полученные данные подтверждают
участие свободных радикалов, образующихся в результате активации фосфолипазного, циклооксигеназного, NO-синтазного и ксантиноксидазного путей, в нарушении метаболических процессов в выделенных нервных окончаниях под действием глутамата. Так, было показано, что ингибиторы фосфолипазы Аг, циклооксигеназы, NO-синтазы и ксантиноксидазы предотвращают или значительно снижают нарушения метаболизма в выделенных нервных окончаниях коры головного мозга, вызванные глутаматом. Аналогичный эффект на изученные метаболические показатели оказывали антиоксиданты а-токоферол и супероксиддисмутаза (СОД).
В результате проведенного исследования были показаны существенные различия в механизме нарушения метаболизма нервных клеток под действием глутамата в трех особо чувствительных к ишемии областях переднего мозга: коре, стриатуме и гиппокампе. Так, было показано, что ингибитор фосфолипазного пути образования свободных радикалов предотвращает все изученные нарушения метаболизма в выделенных нервных окончаниях коры головного мозга и гиппокампа, но не стриатума. В то же время ингибитор NO-синтазного пути образования свободных радикалов снижал вызванное глутаматом увеличение [Са2+]; и инактивацию Na+, К+-АТФазы в синаптосомах коры головного мозга, но не гиппокампа. Полученные данные вносят вклад в понимание различий в развитии ишемического поражения ткани этих областей.
Было определено, что ингибирование митохондриального пути образования свободных радикалов приводило к нарушению метаболизма в синаптосомах из всех изученных областей мозга, и усугубляло токсическое действие глутамата в синаптосомах коры мозга. Полученные данные согласуются с представлениями о том, что на ранних этапах ишемического воздействия митохондрии могут выполнять защитную роль, аккумулируя излишки Са из цитозоля и тем самым предотвращая активацию путей образования свободных радикалов в цитозоле (Khodorov et al., 1999, Saybasili et al., 2001).
Данные, полученные при использовании модели токсического действия глутамата на нервные окончания, сравнивали с результатами экспериментов, проведенных с использованием модели глобальной двухсосудистой ишемии переднего мозга крыс. Было показано многократное увеличение содержания глутамата, аспартата и глицина во внеклеточном пространстве мозга при ишемическом воздействии. При этом также были выявлены существенные региональные особенности механизмов нарушения метаболизма в коре головного мозга, стриатуме и гиппокампе при ишемии и реперфузии. Полученные данные подтверждают результаты, полученные при исследовании выделенных нервных окончаний, и, наряду с другими экспериментальными данными, могут быть использованы в дальнейшем при разработке рекомендаций по медикаментозному лечению последствий инсультов в разных областях головного мозга.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в форме устных сообщений и постерных презентаций на 7 Российских и Международных конференциях и симпозиумах: "Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging" (Санкт-Петербург, 2001); XII Международное совещание и V школа по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001); Пятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2002); III Съезд Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); Симпозиум "Reactive oxygen and nitrogen species: diagnostic, preventive and therapeutic values" (Санкт-Петербург - Кижи, 2002); X Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2003); Summer school of molecular neurobiology (Варшава, Польша, 2003).
Положения, выносимые на защиту. 1. Токсические концентрации глутамата вызывают увеличение [Са ];, входа
45Са2+, накопление МДА и снижение активности Na+, К+-АТФазы в
выделенных нервных окончаниях (синаптосомах) из разных отделов
переднего мозга. Антиоксиданты а-токоферол и СОД предотвращают изменение этих параметров в синаптосомах коры головного мозга, вызванное действием глутамата.
Выявлены региональные особенности нарушения метаболизма при действии глутамата и ингибиторов разных путей образования свободных радикалов на синаптосомы, выделенные из различных областей переднего мозга. Показано, что фосфолипазный и NO-синтазный пути образования свободных радикалов вносят различный вклад в нарушения метаболических процессов в синаптосомах коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа при действии на них глутамата.
При глобальной ишемии переднего мозга крыс во внеклеточном пространстве мозга происходит многократное увеличение содержания возбуждающих аминокислот глутамата и аспартата, а также коагониста NMDA рецепторов глицина.
Фосфолипазный путь образования свободных радикалов играет, очевидно, большую роль в токсическом эффекте глутамата при ишемии в коре больших полушарий, чем в стриатуме, что показано в опытах на синаптосомах и подтверждено при использовании модели глобальной ишемии переднего мозга.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ - 7 тезисов докладов, представленных на Международных и Российских конференциях и симпозиумах, и 6 полнотекстовых статей, из которых 4 - в отечественных журналах, 1 - в международном журнале и 1 - в сборнике статей.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, методы, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 154 страницы машинописного текста, включая 17 рисунков, 6 таблиц и список литературы из 228 наименований.
Этап инициации
Ткань мозга особенно чувствительна к условиям гипоксии и ишемии. Мозг содержит относительно малое количество запасных углеводов (в форме гликогена), а также в большей мере, чем остальные органы, зависим от окислительного метаболизма, потребляя в норме около 20% кислорода, поступающего в организм (Silver, Erecinska, 1998). Снижение перфузии ткани мозга при ишемии приводит к уменьшению доставки кислорода и глюкозы из кровеносного русла к клеткам. В результате глобальной церебральной ишемии ток крови в областях переднего мозга крыс может снижаться до 1% от нормального тока крови (Smith et al., 1984a,b). При этом содержание глюкозы и давление кислорода в ткани уменьшается, достигая значений, при которых изменяется скорость синтеза АТФ (Erecinska, Silver, 2001). В течение первых двух минут ишемии уровень АТФ в ткани мозга может упасть до 15% от нормальных величин (Lipton, 1999). Являясь субстратом терминального фермента митохондриальной дыхательной цепи, цитохромоксидазы, кислород участвует в реакциях аэробного образования энергии. При недостаточном поступлении кислорода происходит ингибирование митохондриального дыхания и синтеза АТФ. Цитохромоксидаза является единственным ферментом, имеющим очень высокое сродство к кислороду (Км 0,05-0,5 мМ). В результате этого активный сайт этого фермента насыщен кислородом в широком диапазоне физиологических условий (Erecinska, Silver, 2001). При недостатке кислорода изменения активности электрон-транспортной цепи происходят поэтапно и затрагивают все компоненты. При этом активность цитохромоксидазы снижается только при полной аноксии - состоянии, редко встречающемся при глобальной церебральной ишемии (Лукьянова, 1997).
При нормальных условиях 95% АТФ в мозге синтезируется в результате окислительного фосфорилирования (Kristian, 2004). При ишемии в первую очередь страдает именно этот путь образования АТФ. Нехватка макроэргов на начальных стадиях ишемии компенсируется активацией других путей синтеза АТФ. За счет активации фосфофруктокиназы в условиях гипоксии активируется образование АТФ путем гликолиза. Кроме того, активируется синтез АТФ из АДФ с переносом фосфата с фосфокреатина. Эта реакция катализируется креатинкиназой. Показано, что запасы фосфокреатина в мозге расходуются практически полностью в течение первых двух минут ишемии (Erecinska, Silver, 2001). Также возможен синтез АТФ из АДФ, катализирующийся аденилаткиназой (Kristian, 2004). Однако активации дополнительных путей синтеза АТФ недостаточно для полной компенсации энергетических потребностей нервных клеток в условиях ишемии.
Расстройства энергопродукции в нервных клетках сопровождаются изменением их интегрального редокс-состояния и сдвигом рН в кислую сторону (Самойлов, 1985, 1999). Было показано, что за счет более высокой чувствительности к кислороду внемитохондриальных оксидаз, увеличение концентрации восстановительных эквивалентов (или Н+) предшествует ингибированию митохондриальной дыхательной цепи (Самойлов, 1985). Ингибирование митохондриальной электрон-транспортной цепи приводит к дальнейшему накоплению восстановительных эквивалентов. Кроме того, активация гликолиза и накопление в клетках его конечного продукта, лактата, приводит к так называемому лактат-ацидозу (Гусев, Скворцова, 2001). Значительное увеличение концентрации лактата в первые часы развития ишемического инсульта вызывает снижение рН до 6,4-6,7 и является неблагоприятным прогностическим признаком. Внутриклеточное увеличение уровня восстановительных эквивалентов оказывает влияние на метаболизм, возбудимость нейронов и синаптическую передачу посредством модификации состояния мембранных ионных каналов и рецепторов нейромедиаторов. Клеточный ацидоз также ведет к нарушению секвестрации ионов Са в митохондриях и эндоплазматической сети вследствие конкуренции Н7Са2+ за анионные участки связывания на мембранах.
Около 60% АТФ в головном мозге расходуется на поддержание ионного градиента на плазматической мембране (Erecinska, Silver, 2001). Значительная часть потребляется Na+, К+-АТФазой, и активность именно этого фермента может снижаться при ишемии вследствие нехватки субстрата, приводя к деполяризации плазматической мембраны нейронов. Деполяризация при ишемии приводит к открытию потенциал-зависимых ионных каналов, позволяя ионам Са2+, Na+, К+ и СГ двигаться по градиентам их концентраций. В результате происходит нарушение ионных градиентов на мембране и увеличение внутриклеточных концентраций Са , Na и CI, а также снижение внутриклеточной концентрации К+.
Таким образом, нехватка кислорода и глюкозы приводит к снижению концентрации макроэргов, накоплению восстановительных эквивалентов и деполяризации плазматической мембраны. При глобальной церебральной ишемии этот процесс происходит очень быстро, в течение первых двух минут после остановки кровотока. По окончании ишемии клеточная концентрация макроэргов быстро восстанавливается. Было показано, что снижение синтеза АТФ при ишемии не является фактором, определяющим последующую клеточную гибель (Sims and Zaidan, 1995). Однако энергетический дефицит и ацидоз запускают ключевые механизмы ишемической клеточной гибели, такие как выброс глутамата во внеклеточное пространство и вход ионов кальция в клетку (Гусев, Скворцова, 2001).
Уже на начальных этапах патобиохимического каскада реакций в результате снижения концентрации макроэргов, деполяризации мембраны и ацидоза, начинается процесс внутриклеточного накопления кальция, являющийся одним из ключевых механизмов деструктивных процессов, лежащих в основе ишемической гибели нейронов. Наблюдения, свидетельствующие о быстром перемещении Са2+ из внеклеточных во внутриклеточные компартменты в условиях аноксии, дали начало кальциевой теории гибели нервных клеток при ишемии (Choi, 1988, Kristian and Siesjo, 1997, Doble, 1999). Эта теория предполагает, что нарушение мембранных градиентов Na+ и СГ приводит к осмотическому разбуханию клетки, однако, отсроченная гибель клетки обуславливается именно нарушением 04- -+ распределения Са . Действительно, удаление из инкубационной среды Na предотвращает осмотическое разбухание нейронов при ишемии, но не влияет 04 на гибель клеток, которая зависит от присутствия в инкубационной среде Са (Choi, 1987).
Модель воздействия глутамата на нервные окончания мозга
При изучении токсического действия глутамата in vitro использовали фракцию нервных окончаний - синаптосом, выделенных методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы по методу Хайоша с модификациями (Hajos, 1975), и фракцию неочищенных митохондрий (Р2 фракция). После инкубации выделенных фракций с глутаматом оценивались следующие параметры: [Са2+],-, вход 45Са2+, активность Na+, К+-АТФазы и содержание МДА.
Выделение субклеточных фракций ткани мозга крыс. В экспериментах использовали самцов крыс линии Wistar (250-270 г). Животных убивали декапитацией. Неокортекс, стриатум и гиппокамп выделяли согласно атласу (Fifkova, Marsall, 1967). Ткань исследуемых областей мозга очищали от сосудов и гомогенизировали в 10 объемах 0,32 М сахарозы на 40 мМ трис-НС1 (рН 7,4). Все процедуры проводили при 4С. Полученный гомогенат центрифугировали 10 минут при 1500 g. Осадок суспендировали в исходном растворе и вновь центрифугировали в том же режиме. Объединенный супернатант центрифугировали 20 минут при 20000 g. Полученный осадок, представляющий собой Р2 фракцию, использовали в ряде экспериментов по определению содержания МДА.
Для выделения очищенных синаптосом Р2 фракцию наносили на градиент плотности сахарозы (1,2 М, 0,8 М и 0,32 М сахароза на 40 мМ трис-НС1) и центрифугировали при 20000 g в течение часа. Фракцию синаптосом, образовавшуюся на границе 0,8 и 1,2 М растворов сахарозы, отбирали пастеровской пипеткой и дважды промывали 40 мМ трис-HCl (рН 7,4), центрифугируя каждый раз по 10 минут при 20000 g (Hajos, 1975). Препарат синаптосом использовали в экспериментах по определению [Ca2+]j, входа 45Са2+ и активности №+,К+-АТФазы, а так же в ряде экспериментов по определению содержания МДА.
Инкубация синаптосом с глутаматом. Для определения [Са2+], полученные синаптосомы ресуспендировали в среде следующего состава (мМ): 135 NaCl, 2,0 KCl, 1,0 СаС12, 10 глюкозы, 20 трис-HCl, рН 7,4. При определении активности №+,К+-АТФазы и содержания МДА состав инкубационной среды был следующим (мМ): 135 NaCl, 1,2 К2Р04, 3,0 КС1, 1,0 СаСЬ, Ю глюкозы, 40 трис-HCl, рН 7,4. Для определения входа 45Са2+ синаптосомы ресуспендировали в среде, содержащей (мМ): 135 NaCl, 1,2 Na2HP04, 5 KCl, 1 СаС12, 10 глюкозы, 20 трис-HCl, рН 7,4. Конечная концентрация белка в пробах составляла 1,5-2 мг/мл.
Инкубацию фракций с 1 мМ глутаматом проводили в течение 15 минут при 37С. Преинкубацию с а-токоферолом (0,133 мМ), СОД (10 МЕ/мл), МК-801 (1цМ) и интибиторами реакций образования свободных радикалов (таб. 2.1) квинакрином (50 дМ), метиловым эфиром NG-HHTpo-L-apraHHHa (L-NAME, 200дМ), аллопуринол ом (ЮОнМ), индометацином (100 дМ), ротенононом (20 цМ) и олигомицином (20 дМ) проводили в течение 5 минут при комнатной температуре. В случае использования в экспериментах МК-801, квинакрина и L-NAME эти ингибиторы растворяли в воде. Аллопуринол и ротенон растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО); а-токоферол, индометацин и олигомицин растворяли в этиловом спирте. При использовании растворов ингибиторов в спирте или ДМСО конечная концентрация растворителей не превышала 0,5 %. В этом случае равные объемы растворителя добавлялись и в пробы, не содержащие ингибитора. По окончании инкубации с глутаматом пробы хранились на льду до момента определения внутриклеточной концентрации ионов кальция, входа 45Са2+, содержания МДА или активности Ш+,К+-АТФазы.
Опыты проводились на анестезированных животных. Протокол исследований составлялся в соответствии с Директивой Европейского Сообщества по этике использования экспериментальных животных (European Community Directive for the ethical use of experimental animals). Было сделано все возможное для уменьшения страдания животных.
Двухсосудистую ишемию переднего мозга вызывали у самцов крыс линии Wistar весом 250-300 г. путем окклюзии сонных артерий в сочетании с гипотензией (Dirnagi et al., 1993). Для анестезии животным внутрибрюшинно вводили нембутал в дозе 50 мг на 1 кг веса. После наступления операционного уровня анестезии обнажали коронарные и бедерную артерии. Для измерения среднего артериального давления крови и создания гипотензии в течение ишемии в бедренную артерию вводили катетер (РЕ 50, Clay-Adams, Inc). Ишемия переднего мозга осуществлялась пережатием сонных артерий и созданием контролируемой гипотензии. Для этого среднее артериальное давление снижалось до 50 мм рт. ст. путем отбирания крови в гепаранизированный шприц (0,5 мл раствора, содержащего 160 единиц гепарина в 1 мл физраствора). После 20-минутной ишемии животным вводили ранее отобранную кровь и освобождали сонные артерии от зажимов. При этом среднее артериальное давление повышалось до базальных значений (80-120 мм рт. ст.). Время реперфузии составляло 1 час. Ложнооперированным животным вводили нембутал в той же дозе (50 мг на 1 кг веса) и делали разрезы, позволяющие сделать доступными для манипуляций коронарные и бедренную артерии. Однако, таким животным не проводили ни окклюзии артерий, ни отбора крови из бедренной вены. За 20 минут до начала ишемии крысам внутрибрюшинно вводили индометацин (10 мг на 1 кг веса, раствор в 100 мМ NaI-ІСОз) или квинакрин (5 мг на 1 кг веса, раствор в 0,9 % NaCl). Полученные данные сравнивали с результатами, полученными при изучении мозга ложнооперированных животных и животных, подвергнутых ишемии и реперфузии, но получавших инъекцию растворителей без ингибиторов.
Крыс убивали декапитацией, кору мозга, стриатум и гиппокамп выделяли на льду согласно атласу (Fifkova, Marsall, 1967). Полученные образцы гомогенизировали в 0,32 М сахарозе и выделяли Р2 фракцию по методике, описанной выше. Полученную фракцию использовали для определения активности Ыа+,К+-АТФазы. Содержание диеновых конъюгатов определяли в гомогенатах коры мозга, стриатума и гиппокампа.
Действие глутамата и ингибиторов реакций образования свободных радикалов на показатели метаболизма в сшаптосомах коры больших полушарий
Влияние глутамата и антиоксидантов на показатели метаболизма в синаптосомах коры мозга крыс. Используя синаптосомы, выделенные из коры больших полушарий головного мозга крыс, было охарактеризовано токсическое действие глутамата in vitro. Инкубация синаптосом коры головного мозга с глутаматом приводила к достоверному увеличению [Са ];, входа 45Са2+ в синаптосомы и содержания МДА (табл. 3.1). Активность Na+,K+-АТФазы под действием глутамата достоверно снижалась. В контрольных синаптосомах [Са ]І составляла 251±17,6 нМ, а глутамат повышал значение этого параметра до 301,9±23,7 нМ (р 0,05 по сравнению с контролем по t-критерию Стьюдента). Инкубация синаптосом с глутаматом приводила к увеличению входа 45Са2+ с 0,34+0,02 до 0,63±0,02 нмоль 45Са2+/мг белка/30 с (р 0,05 по сравнению с контролем по t-критерию Стьюдента). Активность Na+,K+-АТФазы в присутствии глутамата снижалась с 18,74+1,5 до 12,41 ±1,74 цмоль Ф„/мг белка в час (р 0,05 по сравнению с контролем по t-критерию Стьюдента). В контрольных пробах содержание МДА составляло 1,74±0,1 нмоль/мг белка, а в присутствии глутамата значения этого параметра увеличивались до 2,91+0,23 нмоль/мг белка (р 0,05 по сравнению с контролем по t-критерию Стьюдента)
Изменения, наблюдаемые при инкубации синаптосом с глутаматом, являются следствием активации ионотропных глутаматных рецепторов. Действительно, преинкубация синаптосом с блокатором глутаматных NMDA рецепторов МК-801 предотвращала индуцированное глутаматом увеличение входа 45Са2+ и ингибирование активности Ка+,К+-АТФазы, а также снижала накопление продуктов перекисного окисления липидов. Так, МК-801 в присутствии глутамата снижал вход 45Са2+ с 0,63±0,02 до 0,36+0,02 нмоль 45Са2+/мг белка/30 с (р 0,05 по сравнению с глутаматом по t-критерию Стьюдента). В присутствии глутамата МК-801 повышал активность Na+,K+-АТФазы с 12,41±1,74 до 17,58+1,36 имоль Фн/мг белка в час (р 0,05 по сравнению с глутаматом по t-критерию Стьюдента). При добавлении МК-801 также было отмечено снижение содержания МДА с 2,91 ±0,23 до 2,13+0,16 нмоль/мг белка (р 0,05 по сравнению с глутаматом по t-критерию Стьюдента).
Для определения степени участия активных форм кислорода в биохимических процессах, приводящих к нарушению ионного гомеостаза клетки при действии глутамата, было исследовано влияние преинкубации синаптосом коры головного мозга крыс с а-токоферолом и СОД. Как видно из представленных данных, инкубация синаптосом коры головного мозга крыс с этими антиоксидантами предотвращала нарушение метаболизма, вызванное глутаматом или значительно снижала эффект глутамата (табл. 3.1). В присутствии антиоксиданта а-токоферола значения изученных параметров достоверно отличались от данных, полученных при инкубации с одним глутаматом. Так, а-токоферол предотвращал глутамат-индуцированное увеличение [Са2+]і, снижая ее до 186,5+18,5 нМ (р 0,05 по сравнению с глутаматом критерием Стьюдента). В присутствии этого антиоксиданта также снижались вход 45Са2+ и накопление МДА до 0,38±0,02 нмоль 45Са2+/мг белка/30 с и 1,2+0,08 нмоль/мг белка, соответственно (р 0,05 в обеих случаях, по сравнению с глутаматом по t-критерию Стьюдента). а-Токоферол так же достоверно снижал ингибирование Ка+,К+-АТФазы, приводя к повышению активности этого фермента до 16,32±1,46 цмоль Фн/мг белка в час (р 0,05 по сравнению с глутаматом по t-критерию Стьюдента). При этом а-токоферол в отсутствие глутамата не влиял на активность №+,К+-АТФазы и вход 45Са2+ (103,8+3,8% и 98,5+6,47% от контрольных значений, соответственно). Преинкубация с СОД практически предотвращала вызванные глутаматом изменения в активности Ка+,К+-АТФазы, входе 45Са2+ и содержании МДА (табл. 3.1). Так, СОД приводила к снижению под действием глутамата входа 45Са2+ с 0,63+0,02 до 0,33+0,02 нмоль 45Са2+/мг белка/30 с (р 0,05 по сравнению с глутаматом по t-критерию Стьюдента). Содержание МДА в этих условиях также снижалось с 2,91+0,23 до 1,68+0,11 нмоль/мг белка (р 0,05 по сравнению с глутаматом по t-критерию Стьюдента). Активность Na+,K+-АТФазы под действием СОД увеличивалась с 12,41+1,74 до 17,16+1,34 цмоль Фн/мг белка в час (р 0,05 по сравнению с глутаматом по t-критерию Стьюдента). При инкубации синаптосом без глутамата добавление в среду СОД не приводило к достоверным изменениям изученных параметров. Так, активность Ма+,К+-АТФазы в этих условиях составляла 107,6±3,0% от контрольных значений, вход Са - 91,1+7,3%, а содержание МДА -96,5±8,6%.
Влияние ингибиторов различных путей образования свободных радикалов на изменение показателей метаболизма в синаптосомах коры мозга крыс, вызванное действием глутамата. В качестве ингибиторов различных путей образования свободных радикалов использовали L-NAME (ингибитор NO-синтазы и NO-синтазного пути образования свободных радикалов), квинакрин, индометацин (ингибиторы фосфолипазы А2 и циклооксигеназы, оба ингибируют фосфолипазный путь), аллопуринол (ингибитор ксантиноксидазы и ксантиноксидазного пути), и ротенон в сочетании с олигомицином (ингибитор митохондриального комплекса I и АТФ-синтазы, одновременное применение этих веществ ингибирует митохондриальный путь образования свободных радикалов).
Все ингибиторы, кроме ротенона в сочетании с олигомицином, не изменяли параметры метаболизма в синаптосомах коры больших полушарий при их инкубации в отсутствие глутамата. Так, активность Ма+,К+-АТФазы составляла в присутствии L-NAME 97,3+8,8%; квинакрина - 94,0±2,0%; индометацина -101,0+1,81%; аллопуринола - 101,0+2,6% от контрольных значений. Содержание МДА также не изменялось, составляя 102,6+2,7% в присутствии L-NAME; 98,9±2,9% в присутствии квинакрина, 109,3+14,2% в присутствии индометацина и 101,0±2,6% от контроля в присутствии аллопуринола. L-NAME и квинакрин не влияли и на вход 45Са2+ в синаптосомы, величина этого параметра составляла 107,2+12,5% и 90,7+3,5% от контроля, соответственно. [Ca2+]j под действием L-NAME также не изменялась, составляя 106,0+3,0% от контроля. Ротенон в сочетании с олигомицином сами по себе обладали токсическим действием, которое будет описано ниже.
Участие свободных радикалов в токсическом действии глутамата
Взаимодействие глутамата с его рецепторами приводит к деполяризации мембраны и входу ионов натрия и кальция в клетку (Doble, 1999). Важнейшим последствием этих событий является устойчивое увеличение [Ca2+]i, приводящее к последующей дегенерации нейронов. Образование свободных радикалов связано с действием глутамата и накоплением внутриклеточного кальция (Kristian, Siesjo, 1998). Однако причинно-следственные отношения между активацией свободнорадикальных процессов и повышением [Са2+], далеки от понимания. В диссертационной работе было проведено изучение роли различных путей образования свободных радикалов в эксайтотоксическом нарушении метаболизма в нейронах. Это исследование было выполнено при использовании синаптосом коры головного мозга, стриатума и гиппокампа. Для того, чтобы охарактеризовать роль реакций образования свободных радикалов в нарушении ионного гомеостаза в синаптосомах, были выбраны несколько параметров: [Ca2+]j, вход 45Са2+, накопление МДА и активность Na+, К+-АТФазы. Было показано, что при действии глутамата на синаптосомы коры головного мозга происходят изменения всех выбранных параметров. Описанные изменения связаны с активацией NMDA рецепторов, так как преинкубация с антагонистом этих рецепторов МК-801 предотвращала повреждающее действие глутамата. Важно отметить, что преинкубация синаптосом с а-токоферолом и СОД оказывала протекторное действие, предотвращая или значительно снижая эффекты глутамата на нарушение обмена кальция и натрия, а также накопление продуктов ПОЛ. Это свидетельствует о том, что именно активация свободнорадикальных реакций, вызванная взаимодействием глутамата с его рецепторами, приводит к нарушению метаболизма в синаптосомах.
В частности, нами было показано, что при действии глутамата повышается [Ca2+]i, а антиоксиданты предотвращают это повышение. Полученные нами данные согласуются с работами, проведенными на культурах нейронов. Mattson с соавторами показали, что различные антиоксиданты, в том числе и а-токоферол, уменьшают инициированное глутаматом накопление [Са ]; в культуре клеток гиппокампа (Mattson et al., 1995). Так же было показано, что антиоксиданты предотвращают увеличение [Са2+]; в культуре клеток PC 12, инициированное Р-амилоидом (Zhou et al., 1996), тогда как пероксиды и активные формы кислорода, напротив, увеличивают [Ca2+]j в синаптосомах мозга (Tretter et al., 1997).
Таким образом, повышение образования активных форм кислорода на ранних этапах воздействия возбуждающих аминокислот вносит важный вклад в последующее увеличение [Са ]j. Можно предположить, что свободные радикалы влияют на механизмы поступления ионов кальция в цитозоль. При действии глутамата важную роль играет увеличение входа внеклеточного кальция в клетку извне. Так, устойчивое увеличение [Ca2+]j под действием глутамата не наблюдалось при отсутствии ионов кальция в среде инкубации после аппликации глутамата (Randall, Thayer, 1992). Как глутамат, так и агонисты ионотропных глутаматных рецепторов вызывали увеличение входа 45Са2+ и уменьшение выживаемости нейронов (Hartley et al., 1993). В диссертационной работе показано, что глутамат приводил к увеличению входа 45Са2+ в синаптосомы коры головного мозга. Добавление антиоксидантов предотвращало данное увеличение входа 45Са2+, подтверждая, что активация свободнорадикальных реакций при действии глутамата может приводить к увеличению входа Са2+ в клетку извне.
Известны два пути поступления Са в клетку извне при эксайтотоксичности: через потенциалзависимые каналы при деполяризации и через неспецифические каналы, образуемые, в частности, при накоплении продуктов ПОЛ в плазматической мембране клеток. Было показано, что активация потенциалзависимых кальциевых каналов участвует в обеспечении устойчивого увеличения [Са ]; в синаптосомах гиппокампа при действии глутамата (Malva et al., 1998). Избыточное действие глутамата на его рецепторы приводит к первичной деполяризации плазматической мембраны, которая впоследствии усугубляется последующим нарушением метаболизма в нейронах. Вторичная деполяризация может быть обусловлена окислительной инактивацией Ма+,К+-АТФазы. Действительно, ранее было показано, что токсические дозы глутамата приводят к повышению генерации активных форм кислорода и ингибированию Ыа+,К+-АТФазы вследствие окислительной инактивации фермента (Huang et al., 1992, Булыгина и др., 2002, Boldyrev et al., 2003). Нами было показано, что инкубация синаптосом коры головного мозга с глутаматом приводит к существенному снижению активности №+,К+-АТФазы. Антиоксиданты полностью предотвращают это снижение, что позволяет сделать вывод, что окислительная инактивация Ка+,К+-АТФазы имеет место и при действии глутамата на синаптосомы.
Другим механизмом увеличения входа Са в синаптосомы может быть его поступление через неспецифические каналы, образуемые продуктами ПОЛ. Накопление таких продуктов нарушает упорядоченность мембран и приводит к увеличению их проницаемости. В диссертационной работе показано увеличение образования МДА в синаптосомах мозга крыс под действием глутамата. Полученные данные согласуются с исследованиями других авторов in vitro и in vivo (Herrera et al., 2001, Yang et al, 2003).
Все эти литературные и полученные нами данные позволяют полагать, что используемая нами модель отражает ранние этапы поражения нейронов, вызванных глутаматом. Наш объект исследования - синаптосомы, или изолированные нервные окончания. Они содержат митохондрии и другие клеточные органеллы, но не содержат ядра. Поэтому те метаболические эффекты глутамата, которые связаны с изменением экспрессии генов, на этой модели не проявляются. Инкубация синаптосом с глутаматом изменяет [Са ]j, вход 45Са2+, активность Ма+,К+-АТФазы и концентрацию МДА. Первые три параметра характеризуют гомеостаз ионов и функционирование мембран в синаптосомах и отражают активацию при действии глутамата различных путей входа кальция в клетки, регулируемые активными формами кислорода. Накопление МДА отражает интенсивность процесса перекисного окисления липидов.
Наши исследования подтвердили, что активация образования свободных форм кислорода участвует не только на заключительных этапах ишемического поражения нервной ткани, но и играет активную роль в событиях раннего ишемического ответа. Следующей целью нашей работы является выяснение вклада разных свободнорадикальных реакций в нарушении метаболизма в нервных окончаниях из разных отделов переднего мозга (кора головного мозга, стриатум и гиппокамп). В частности, было исследовано участие N0-синтазного, фосфолипазного, ксантиноксидазного и митохондриального путей образования свободных радикалов.
