Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ. 7
РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Общие представления о катехоламинах . и серотонине и их роль в ВДС 12
1.1.1. Метаболизм.катехоламинов.и.серотонина . в ВДС . 12
1.1.2. Локализация.катехоламинов и серотони-. на в ЦНС 13
1.1.3. Функциональное значение.катехоламинов и серотонина в ЦНС 18
1.2. Методы анализа катехоламинов и серотонина 21
І.2.І. Сравнительный анализ современных мето дов количественного определения катехол- . аминов и серотонина 21
1.2.1.1. Методы выделения катехоламинов и . серотонина 22
1.2.1.1.1. Экстракционный способ очистки БА 22
1.2.1.1.2. Обычная жидкостная хроматография 25
1.2.1.1.3. Высокоэффективная.жидкостная хро- . . матография 26
1.2.1.1.4. Газовая хроматография 27
1.2.1.2. Методы специфического количественно го определения катехоламинов и серо- . . тонина 28
I.2.1.2.1. Флуориметряческие методы 28
1.2.1.2.2. Электрохимические методы 29
1.2.1.2.3. Радиоэнзиматические методы 29
1.2.1.2.4. Масс-спектрометрические методы 30
1.2.1.3. Перспективы дальнейшего развития методов определения катехоламинов и серотонина 30
1.2.2. Методы выделения и очистки биогенных аминов органическими растворителями 32
1.2.3. Флуориметрические методы определения биогенных аминов 38
РАЗДЖ 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРШЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 41
2.1. Оптимизация экстракционного флуоримет- рического метода определения БА 41
2.1.1. Реактивы, используемые нами при определении биогенных аминов 41
2.1.2. Выделение структур мозга и хранение выделенных проб до анализа 42
2.1.3. Оптимизация количественного флуоримет- , , рического определения биогенных аминов.. 44
2.1.3.1. Модификация флуориметра ЭФ-ЗМА для ... определения биогенных аминов 44
2.1.3.1.1. Абсорбционные светофильтры для флу-ориметрического.определения биогенных аминов 45
2.1.3.1.2. Сливная кювета и термостатироваляе ыоветного отсека 48
2.1.3.2. Автоматизация проведения химических . процедур получения флуорофоров 53
2.1.3.3. Определение катехоламинов 55
2.1.3.4. Определение серотонина и 5-оксииндо- лилуксусной кислоты 56
2.1.3.5. Определение гомованилиновой кислоты 58
2.1.3.6. Математическая обработка результатов 60
2.1.4. Оптимизация процедур выделения и.очистки БА органическими растворителями 63
2.1.4.1. Общее описание процедур выделения и очистки биогенных аминов экстракцией органическими растворителями 65
2.1.4.2. Построение калибровочных кривых 67
2.1.4.2.1. Основные калибровочные кривые 68
2.1.4.2.2. Тканевые калибровочные кривые 71
2.1.4.3. Исследование наиболее общих факторов, определяющих эффективность и корректность экстракционных процедур при выделении и очистке БА органическими растворителями 72
2.1.4.4. Оптимизация экстракционных процедур при выделений и очистке БА органическими растворителями с учетом выявленных нами. . факторов . 89
2.1.4.5. Спектральная характеристика специфич ности экстракционного флуориметричес- . . кого метода 1Ь5
2.1.4.6. Определение ДА, НА, 50Т, 50ИУК и ГВК в "переднем мозге" и "стволе"головного мозга крыс ЇІ2
2.2. Оптимизированный экстракционный флуориметри- ческий метод в исследованиях функциональной . роли БА головного мозга крыс 115
2.2.1. Влияние условий содержания крыс на . . уровень ЕА головного мозга 116
2.2.2. Изучение роли уровня БА.в механизмах действия этанола 120
2.2.3. Изучение влияния на уровень БА головного мозга крыс хронического введения ингибитора моноаминоксйдазы ипрониазида, а также хронического введения предшественника ка-техоламинов ь-дофа в рамках комплексного исследования связи уровня БА.и.обучения с пищевым подкреплением 124
2.2.3.1. Исследование содержания БА в головном мозге крыс при хроническом.введении ипрониазида 125
2.2.3.2. Исследование содержания ЕА в головном . мозге крыс при хроническом введении L-ДОФА.
2.2.4. Изучение влияния оборонительного обучения на содержания БА головного мозга в выборках крыс из общей популяции линии "Вистар" по . устойчивости к аудиогенному.раздражителю 130
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 138
ВЫВОДЫ 140
ПРИЛОЖЕНИЯ .' 142
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 152
Введение к работе
Актуальность. Биогенные амины55 (катехоламины и серотонин) -широко распространенные в животном мире соединения, выполняющие медиаторные, модуляторные и гормональные функции. Принимая участие во многих сторонах .жизнедеятельности организмов, они особенно большую роль играют в интегративной деятельности ЦНС, где занимают ключевые позиции во все еще недостаточно полно понимаеглых механизмах эмоций, памяти, управления поведением. Различные биогенные амины (БА) головного мозга .животных и их производные представляют в целом единую, тесно взаимосвязанную (морфологически, биохимически и функционально) систему биологических регуляторов. При биохимических исследованиях механизмов функциониро-. вания этой системы часто .желательно одновременное определение в биологическом материале возможно большего числа ее элементов. Однако, высокая трудоемкость методов определения этих соединений ограничивает возможности их одновременного изучения, особенно в связи с тем, что решение многих современных задач связано с необходимостью обработки значительного объема материала.
В ряду современных методов анализа экстракционный флуоримет-рический метод (этот метод сочетает выделение БА экстракцией органическими растворителями и их последующее флуориметрическое определение) наиболее приемлем для массового комплексного анали й Биогенные амины (БА), моноамины - синонимы, принятые в настоящее время в специальной литературе (и в настоящей.работе) обозначающие совокупность катехолшдинов и серотонина. Они не строги, т.к. ряд авторов.под этими терминами подразумевает также, ацетял-холин, гаммааминомаслянную кислоту, гистамин (биогенный диамин) и другие соединения.
за БА в биологических образцах, благодаря уникальному сочетанию высокой скорости анализа, возможности параллельного анализа большого числа проб, простоте и згДобству выполнения процедур /24/.
Наряду со всеми перечисленными достоинствами, существенным недостатком экстракционного флуориметрического метода определения БА являются значительные потери последних при экстракционной очистке /141/. Имеющиеся в настоящее время в литературе данные не позволяют с уверенностью судить о факторах, влияющих на полноту выхода биогенных аминов при их очистке органическиг-м растворителями. Кроме того, ни в одной из известных нам методических работ в этой области не приводятся полные данные о концентрационной зависимости выхода биогенных аминов при экстракционных процедурах в присутствии ткани. Такім образом, оптимизация факторов, влияющих на полноту и линейность выхода биогенных аминов при очистке органическим! растворителями является необходимым условием успешного практического использования этого метода. Кроме того, возможно повышение эффективности и флуориглетрических процедур - за счет оптимизации условий получения флуорофоров и условий измерения флуоресценции.
Особенно актуальными вопросами изучения функциональной роли БА ЦНС, по нашему мнению, являются следующие: их вовлеченность в механизмы памяти, роль в механизмах действия алкоголя и патологического влечения к последнему, нейрохимические особенности животных данного вида, отличающихся по устойчивости ЦНС к сильному раздражителю.
Цель работы: Оптимизация экстракционного флуориметрическо-го метода количественного определения норадреналина (НА), доф амина (ДА) и серотонина (5-окситриптамина - 50Т) в ткани головного мозга крыс с целью создания эффективного рутинного метода и апробирование его в исследованиях функциональной роли этих соединений в ЦНС.
Основные задачи исследования: I. Исследовать и оптимизировать факторы, определяющие эффективность и корректность экстракционного флуориметрического метода для определения БА в ткани головного мозга. 2. Продемонстрировать возможности оптимизированного нами экстракционного флуориметрического метода для определения биогенных аминов в ткани головного мозга при:
а) изучении роли уровня БА в механизмах действия этанола;
б) изучении влияния на уровень БА головного мозга крыс хронического введения ингибитора моноаминоксидазы ипрониазида, а также хронического введения предшественника катехоламинов L -ДОФА в рамках комплексного исследования связи уровня БА и обучения с пищевым подкреплением;
в) изучении влияния оборонительного обучения на содержание БА головного мозга в выборках крыс из общей популяции "Вистар", разделенных по устойчивости к аудиогенному раздражителю.
Научная новизна. Впервые изучено влияние ряда условий процедур экстракции и очистки ЕА ткани головного мозга • юргани-ческими растворителями на величину и линейность выхода выделяемых соединений. Впервые в практику биохимического анализа внедрены автоматические дозаторы системы "СІПАВ". Это позволило увеличить эффективность анализа за счет повышения скорости, точности и простоты дозирования, а также облегчило дозирование агрессивных жидкостей.
Модифицирован флуориметр ЭФ-ЗМА. Тщательный подбор абсорбционных светофильтров, установка сливной кварцевой кюветы и при нудительное воздушное охлаждение кюветного отсека позволили обеспечить высокую чувствительность, специфичность и скорость измерений, а также повысить воспроизводимость результатов при определении БА.
Благодаря оптимизации экстракционных процедур извлечения из ткани и очистки БА, химических процедур получения их флуорофоров и операций измерения флуоресценции нами предложено шесть новых высокоэффективных вариантов экстракционного флуориметрического метода определения в ткани головного мозга крыс норадреналина, дофамина и серотонина. Б пяти.из них возможно также определение и 5-оксииндолуксусной кислоты.
Нагл удалось показать особую эффективность использования оптимизированного нами метода анализа БА в изучении механизмов функционирования ЦНС.при их использовании в сочетании с физиологическими методами. Получен ряд новых данных о роли моноаминэрги-ческих систем мозга в механизмах эмоций, памяти, управления поведением.
Практическая ценность. Результаты изучения нами факторов определяющих эффективность экстракции БА органическими растворителями могут использоваться другими исследователями при разработке новых методов в этой области. Предложенные варианты экстракционного флуориметрического метода определения БА были успешно использованы нами в ряде экспериментов, требующих анализа БА в большом числе проб и зарекомендовали себя как простые и высокоэффективные. Они могут быть использованы также в следующих областях:
- клинические исследования;
- исследования механизмов действия фармакологических препаратов;
- исследования механизмов функционирования ЦНС.
Один из вариантов нашего метода внедрен в Лаборатории нейро-медиаторных систем. Отдела проблем пагляти Института биологической физики АН СССР.
Полученные нами результаты при изучении роли БА ЦНС в механизмах поведения, действия фармакологических препаратов и этанола могут найти практическое применение в соответствующих областях.
