Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 10
1.1 АКМ в нормальном функционировании мозга 10
1.2 Роль АКМ в процессе старения мозга 20
1.3. Серотонинергическая система и старение 31
1.4 Антиоксид анты в профилактике старения 40
Заключение 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований. 51
ГЛАВА 3. Результаты исследований. 60
3.1. Возрастные изменения содержания окисленных белков и липидов в мозге крыс линий OXYS и Вистар 61
3.2. Возрастные изменения содержания восстановленного глутатиона и а-токоферола:. в мозге крыс линий OXYS и Вистар 63
3.3. Возрастные изменения активности СОД в ,мозге крыс линий OXYS и Вистар 67
3.4. Сравнительный анализ содержания продуктов ПОЛ в мозге крыс линий OXYS и: Вистар в различные возрастные периоды 69
3.5. Обмен серотонвна в структурах мозга крыс линий OXYS и Вистар разного возраста 77
3.6. Влияние экстракта черники: (Vaccinium Myrtillus) и а- токоферола на способность к однократному обучению и параметры окислительного стресса у крыс линий OXYS и Вистар 85
Обсуждение результатов 96
Выводы. 104
Список цитируемой литературы 106
- АКМ в нормальном функционировании мозга
- Серотонинергическая система и старение
- Возрастные изменения содержания восстановленного глутатиона и а-токоферола:. в мозге крыс линий OXYS и Вистар
- Обмен серотонвна в структурах мозга крыс линий OXYS и Вистар разного возраста
Введение к работе
Актуальность исследования. Существенный рост доли пожилых людей в населении развитых стран определил особую актуальность повышения качества жизни людей старшего возраста, обеспечения полноценной активной старости. Не случайно в разработанной ООН программе научных исследований по проблеме старения в XXI веке концепция здорового старения отнесена к наиболее приоритетным направлениям (Анисимов, 2000). Очевидно, что выяснение биохимических механизмов и разработка средств профилактики преждевременного старения являются ключевыми задачами в реализации этих программ.
В последние годы активно развивается свободнорадикальная теория старения, практически одновременно выдвинутая Харманом Д. (1956) и Эмануэлем Н.М. (1958). Согласно этой теории, свободные радикалы, образующиеся в результате различных окислительных реакций в организме, вызывают множественные повреждения макромолекул (нуклеиновых кислот, белков, липидов), приводя кихдеградации и старению. Свободнорадикальная теория объясняет не только механизмы старения, но и широкий круг связанных с ним патологических процессов (Middleton et al, 2000; Mattson, 2001). Это привело к стремительному росту количества обладающих антиоксидантными свойствами фармакологических препаратов и биологически активных добавок, рекомендуемых для профилактики старения и лечения связанных с ним заболеваний, в том числе - нейродегенеративных (Joseph etal., 2000; Head and Zicker, 2004).
Между тем в последние годы представления об участии активированных кислородных метаболитов (АКМ) в физиологических процессах существенно расширились, и польза от подавления свободнорадикальных процессов в организме, особенно в здоровом, уже не всегда представляется бесспорной. АКМ' вовлечены в регуляцию многих физиологических процессов на всех уровнях - от активации внутриклеточных ферментов до нервной регуляции и регуляции сосудистого тонуса, от клеточной пролиферации и дифференцировки до апоптоза и регуляции экспрессии генов (Турпаев, 2002; Droge, 2002; Macher and Schubert, 2000; Esposito ef al., 2004; Zhang ef al., 2004).
АКМ постоянно образуются в центральной нервной системе в процессе
нормальной жизнедеятельности (окислительных процессов в митохондриях,
метаболизма моноаминов и др.), однако подавляющее большинство из них
нейтрализуется факторами антиоксидантной защиты организма (Remmen,
2001). С возрастом увеличивается вероятность развития окислительного
стресса, который рассматривается как нарушение баланса в системе "про- и
антиоксиданты" в сторону преобладания прооксидантов (Зенков и др., 2001).
Накопление окислительных повреждений макромолекул в клетках мозга
может приводить к деполяризации мембран нейронов, изменению порога их
чувствительности к действию нейромедиаторов, к нарушению оптимальных
условий функционирования рецепторов, транспортных систем, ферментов,
сигнальной трансдукции и , ^Щ^^Ш^Ж^^^Г3' ТМ
09 ЮЭ(
числе - способности к обучению, памяти (Nicholls, 2000; Liu etal., 2002; Droge, 2002). Стрессы, неблагоприятные воздействия среды, неполноценное питание, заболевания, ведущие к активации свободнорадикальных процессов, способствуют раннему старению организма (Sun, Chen, 1998; Mattson, 2001).
Выяснение биохимических механизмов, лежащих в основе возрастных нарушений когнитивных функций и разработка эффективных средств их профилактики - актуальные задачи не только фундаментальной науки, но и практической медицины. Их решению способствует использование адекватных биологических моделей. Линия мышей SAMR (senescence-prone accelerated mice), созданная японскими учеными, на сегодня является единственной общепризнанной моделью преждевременного старения (Takeda ef а/., 1981, 1991), которое связывают с нарушением баланса между скоростями генерации и утилизации АКМ (Edamatsu etal., 1995; Hosokawa ef a/., 2000). Проведенные к моменту выполнения настоящей работы исследования . позволили предположить, что адекватной моделью преждевременного старения могут служить также крысы OXYS. По многим параметрам прослеживается очевидное сходство между этими животными и мышами линий SAMP, тем не менее, крысам линии OXYS присущи свои особенности, которые делают эту модель уникальной.
Линия крыс OXYS создана в Институте цитологии и генетики СО РАН селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы (Соловьева и др., 1975). Как показали исследования последних лет, этих животных отличает комплекс признаков, которые могут быть определены как синдром ускоренного старения: сниженная максимальная продолжительность жизни, ранние катаракты, инволютивные изменения органов (Колосова и др., 2001, 2003а; Маркова, 2003). Уже в 3 месяца у крыс OXYS выявлены нарушения условной реакции пассивного избегания, проявляющиеся в снижении способности к запоминанию новой информации при ее однократном предъявлении (Лоскутова, Колосова, 2000; Лоскутова, Зеленкина, 2002). Из литературы известно, что этот признак является наиболее ранним симптомом нарушения памяти у стареющих людей и животных (Huppert, 1991).
Преждевременное старение крыс OXYS ранее связывали с «врожденной гиперпродукцией свободных радикалов» (Salganikef а/., 1994а), которая стала ключевой характеристикой линии при ее регистрации (Rat genome, 1996). Однако оценка генерации АКМ митохондриями печени в различных метаболических состояниях, проведенная методами хемилюминесцентного анализа, показала, что их продукция у крыс OXYS не только не повышена, а даже ниже, чем у крыс Вистар (Меньщикова и др., 2000; 2002; Панин и др., 2004).
В мозге крыс OXYS какие-либо показатели окислительного стресса ранее не исследовались, и вопрос о его участии в патогенезе ранних изменений когнитивных функций и эмоциональной сферы остается открытым. Возрастные нарушения когнитивных функций тесно связаны с изменениями в медиаторных системах мозга, в частности серотонинергической, оценка состояний которой у крыс OXYS ранее не проводилась.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выяснение роли окислительного стресса и обмена серотонина в проявлениях преждевременного старения мозга крыс OXYS.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
-
Сопоставить динамику возрастных изменений содержания окисленных белков и липидов в мозге крыс OXYS и Вистар.
-
Изучить возрастные изменения ряда параметров системы антиоксидантной защиты: активности супероксиддисмутазы, содержания восстановленного глутатиона и а-токоферола в мозге крыс OXYS и Вистар.
-
Провести анализ содержания продуктов перекисного окисления липидов как маркеров окислительного стресса в структурах мозга морфофункциональной эмоциогенной системы, участвующией в процессах обучения и памяти, крыс OXYS и Вистар разного возраста.
-
Изучить изменения в обмене серотонина в структурах мозга крыс OXYS и Вистар в процессе старения.
-
Выяснить наличие взаимосвязи антиоксидантных свойств витамина Е и экстракта черники с их способностью предотвращать нарушения когнитивных функций у крыс OXYS.
Научная новизна работы. Впервые показано, что в мозге крыс OXYS накопление маркеров окислительного стресса - окисленных белков и липидов - происходит интенсивней, чем у крыс Вистар, однако межлинейные различия по этим параметрам появляются позже, чем фиксируются характерные для стареющих людей и животных отклонения в когнитивной и эмоциональной сферах крыс OXYS. Развитие этих отклонений у молодых животных протекает на фоне повышенной активности супероксиддисмутазы (СОД) и сниженного уровня восстановленного глутатиона, а также активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в критических для обучения и памяти структурах мозга. Выявлены значительные различия в активности процессов ПОЛ между регионами мозга, которые у крыс обеих линий оказались более существенными, чем возрастные.
Впервые установлено, что существует корреляционная связь между содержанием серотонина и продуктов ПОЛ в структурах мозга животных: чем выше концентрация серотонина, тем ниже в них содержание продуктов ПОЛ.
Впервые обнаружено, что, возрастные изменения содержания серотонина и 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в отдельных структурах мозга разнонаправлены и зависят от генотипа животных. В критических для обучения и памяти структурах мозга молодых крыс OXYS состояние метаболизма серотонина в значительной степени соответствует таковому у старых крыс Вистар, что свидетельствует о связи проявлений раннего старения мозга крыс OXYS с изменениями в серотонинергической системе.
Впервые продемонстрирована способность экстракта черники предупреждать нарушения памяти, снижая при этом содержание продуктов ПОЛ и активность СОД в мозге крыс OXYS.
Практическая значимость работы. Показано, что линия крыс OXYS может использоваться как перспективная модель для изучения механизмов старения, патогенеза связанных с ним неиродегенративных процессов и разработки способов их профилактики, для оценки эффективности уже известных и новых фармакологических препаратов и биологически активных добавок. Результаты проведенного анализа эффектов экстракта черники и витамина Е расширяют представления о механизмах их геронтопротекторного действия. Экстракт черники может быть рекомендован для профилактики возрастных нарушений памяти у людей.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
В мозге молодых крыс OXYS содержание окисленных белков и липидов не отличается от крыс Вистар. Активность СОД увеличена на фоне сниженного количества восстановленного глутатиона, что служит доказательством повышенной генерации активированных кислородных метаболитов
2. Нарушение способности к однократному обучению у крыс OXYS развивается на фоне активации ПОЛ и изменений обмена серотонина в структурах мозга, связанных с процессами обучения и памяти
3 Возможность с помощью антиоксидантов предупреждать нарушение способности к однократному обучению свидетельствует об участии окислительного стресса в развитии дисфункций мозга у крыс OXYS.
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Основные результаты работы были доложены на VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002), на IV съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002), на Third International conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, Russia, 2002), на International conference "Reactive oxygen and nitrogen nitrogen species, antioxidants and human health" (Smolensk, Russia, 2003) и на I International conference on Polyphenols and Health (Vichy, France, 2003).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (Х5Інаименования) Работа изложена на /?>0 страницах машинописного текста, и содержит^ таблицы и тТ'Рисунков.
АКМ в нормальном функционировании мозга
Зарождение свободнорадикальной биологии ведет свое начало с работ великого французского химика Антуана Лавуазье (1743-1794), который впервые показал роль кислорода в процессах горения, окисления и дыхания. Впервые реакционная способность кислородных радикалов была выявлена Фентоном в 1894 году. Изучая окисление различных соединений, он показал, что окислительная способность перекиси водорода значительно возрастает в присутствии сульфата железа (Aukrust et al., 1995). И только в последние годы научная общественность начала принимать во внимание возможность того, что свободные радикалы и активированные кислородные метаболиты (АКМ) могут играть существенную роль в клеточной физиологии (Droge, 2001).
В процессе жизнедеятельности аэробного организма наряду с полным, четырехэлектронным восстановлением молекулярного кислорода, растворенного в тканях, в многочисленных метаболических реакциях постоянно образуются и продукты неполного восстановления - активные кислородные частицы, такие как синглетный кислород, супероксидный анион-радикал, гидроксильный радикал, перекись водорода, пероксинитрит, нитроксильный радикал, перекисный радикал, пергидроксильный радикал и другие. На образование различных форм неполного восстановления кислорода в организме расходуется до 5% поглощенного кислорода (Анисимов, 2000).
Все формы АКМ обладают высокой цитотоксичностью в отношении любых типов клеток и клеточных образований, что определяется их высокой реакционной способностью. Можно выделить три наиболее вероятных механизма окислительной цитотоксической атаки АКМ в мозге: индукция процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах (Владимиров и др., 1991), повреждение белков (Richards et al., 1988; Drapier, Hibbs, 1988) и повреждение ДНК клеток (Hoffman et al., 1984). Супероксидный анион-радикал (Ог "), синглетный кислород и гидроксильный радикал обладают высокой реакционной способностью и малыми значениями времен жизни в биологических субстратах, что делает их эффективным инструментом локального действия в мозге.
Гидроксильный радикал (ОН») наиболее агрессивен, с его образованием часто связывают цитотоксическое и мутагенное действие АКМ в условиях окислительного стресса. ОН может разрывать любую С-Н- или С-С- связь При этом скорость его взаимодействия с большинством макромолекул достигает величин, равных скорости диффузии, в результате чего время жизни ОН» в биологических субстратах составляет 10"9 с, а радиус миграции ограничен размером средней органической молекулы (Vanasbeck, 1991).
Напротив, супероксидный анион-радикал (02 ) и синглетный кислород обладают большим радиусом действия, сравнимым с размером клетки. Время их жизни составляет 10" с. На клеточном уровне их воздействие контролируется наличием высокоэффективного ферментативного антиоксиданта - супероксиддисмутазы (СОД), а также других антиоксидантов - таких, как а-токоферол (Dimascio et; al., 1990). СОД существенно (в 1000-10000 раз) ускоряет спонтанную дисмутацию Ог , в результате которой образуются перекись водорода и молекулярный кислород (Berthon, 1993; Cominacini et al.,. 1993; Nohl, 1990). При наличии ионов восстановленных переходных металлов, перекись водорода может переходить в высоко реакционноспособный гидроксильный радикал (ОН ) согласно реакции Фентона (Aukrust et al., 1995). Еще один АКМ в клетке - оксид азота (NO). In vivo NO образуется в реакции окисления L-аргинина семейством изоферментов - NO синтазами (Hevel, Marietta, 1992). Молекулы NO легко диффундируют в биологических средах и являются достаточно долгоживущими: среднее время жизни в биологических тканях 5,6 с. В результате реакции N0 с супероксидным анионом образуется более высокореакционная молекула — пероксинитрит (Saran et al., 1990).: Следует отметить, что сфера влияния N0 распространяется на определенные клеточные структуры, например, на мышечные клетки сосудов, вызывая их релаксацию (Furlong et al., 1987). Наибольшим радиусом действия, проявляющимся на тканевом и: организменном уровнях, обладают продукты взаимодействия радикалов с окисляемым субстратом. Например, процессы ПОЛ приводят к образованию альдегидов, эпоксидов, липидных перекисей, которые ингибируют синтез ДНК и деление клеток и, в то же время, индуцируют развитие опухоли (Galeotti et al., 1991). До недавнего времени АКМ рассматривали прежде всего как повреждающие агенты, и только в последнее 20-летие стало очевидно, что описанные выше уникальные свойства позволяют свободным радикалам и АКМ участвовать в нормальном метаболизме здоровых клеток в качестве регуляторов многих физиологических процессов, в том числе протекающих в мозге. Эта регуляция может осуществляться на всех уровнях - от активности внутриклеточных ферментов до нервной регуляции, регуляции сосудистого тонуса, от пролиферации и клеточной дифференцировки (Sohal et al., 1988) до апоптоза, экспрессии генов и др. (Ryter, Tyrrell, 1988).
Серотонинергическая система и старение
В головном, мозге млекопитающих существует обширная специфическая система нейронов, роль трансмиттера в которой выполняет серотонин (5-НТ) (Dahlstrom, 1973; Буданцев, 1976). Тела 5-НТ нейронов расположены в стволе мозга, они формируют ядра и функционально могут быть разделены на две группы (Jacobs, Azmitia, 1992). К первой, так называемой верхней группе, относятся 4 основных ядра - ядра шва среднего мозга. Перикарионы входящих в них нейронов дают начало системе восходящих нервных волокон, иннервирующих многие субкортикальные структуры и кортикальные области, причем эта иннервация не однородна (Moore, 1978). Вторую группу (нижняя группа ствола мозга) составляют 5 основных ядер. Основная часть аксонов этих нейронов: входит в состав бульбоспинального тракта и иннервирует моторные и вставочные нейроны спинного мозга (Azmitia, 1986, Jacobs, 1992).
В 5-НТ нейроне происходит синтез серотонина в перикарионе, транспорт его вдоль аксона, накопление медиатора в нервных окончаниях (Попова, 1978). Далее под влиянием нервного импульса происходит выделение 5-НТ в синаптическую щель, обратный захват выделившегося медиатора синаптическим окончанием и его окислительное дезаминирование моноаминооксидазой типа А (МАО А), локализованной в митохондриях.
Источник для синтеза 5-НТ - широко распространенная в природе незаменимая аминокислота L-триптофан. Синтез 5-НТ из триптофана происходит в два этапа. Вначале аминокислота гидролизуется до 5-гидрокситриптофана при участии фермента триптофан гидрокс ил азы (ТПГ), а во время второго этапа 5-гидрокситриптофан превращается в 5-гидрокситриптамин (серотонин) под влиянием декарбоксилазы.. Декарбоксилаза не имеет субстратной специфичности, проявляет большую по сравнению с ТПГ активность (Peters, 1968) и поэтому не является лимитирующим ферментом в биосинтезе 5-НТ. Что касается ТПГ, то она находится исключительно в клетках серотонинергической системы, т.е. специфична для нее. ТПГ является ферментом, который не насыщен субстратом, поэтому повышение содержания триптофана приводит к усилению активности фермента и, как следствие, к увеличению синтеза 5-НТ (Fernstrom, 1983). Также показано, что ТПГ в мозге не насыщена кислородом (Попова, Жнаева, 1988). Уровень триптофана и содержание кислорода в ткани мозга однонаправлено воздействуют на активность ТПГ: с ростом концентрации триптофана величина Кп, для кислорода падает, что отражает облегчение условий связывания ТПГ с кислородом. При окислении SH-rpynn и мест связывания Fe +, расположенных на каталитическом центре ТПГ, связывающем триптофан, фермент инактивируется (Попова, Жнаева, 1988). По изменению активности ТПГ можно судить о состоянии всей 5-НТ системы.
Инактивация серотонина происходит несколькими путями. Наибольший удельный вес имеют два из них.. Первый включает в себя обратный захват медиатора клеточным окончанием и дает возможность его повторного использования. Второй путь — метаболический: окислительное дезаминирование до 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК). Первой и ключевой стадией в этом процессе является отщепление аммиака с образованием 5-гидроксииндолацетальдегида и Н2Ог» что катализируется МАО A (Neff, 1974). Далее 5-гидроксииндолацетальдегид переходит в 5-ГИУК, которая является конечным продуктом обмена 5-НТ и выводится, в основном, почками. Таким путем разрушается до 90% серотонина (Попова, 1978). Поэтому на основании анализа содержания 5-НТ и 5-ГИУК можно -судить об интенсивности метаболизма этого медиатора. Для этого же был предложен так называемый катаболический коэффициент, то есть отношение 5-ГИУК/5-НТ. Чем больше концентрация 5-ГИУК по сравнению с медиатором и чем больше катаболический:коэффициент, тем; интенсивнее идет распад 5-НТ, а именно выделение в синаптическую щель, взаимодействие с рецепторами и разрушение МАО А до 5-ГИУК. Чем меньше катаболический коэффициент и больше концентрация 5-НТ по сравнению с метаболитом, тем он больше синтезируется и депонируется в аксонах.
Ауторегуляция 5-НТ нейронов осуществляется за счет ауторецепторов, которые при стимуляции ингибируют нейрональную активность и высвобождение медиатора в синаптическую щель (Sharp, 1992, Kulikov, 1997). Известно 14 подтипов, серотонинергических рецепторов, отличающихся по своим молекулярно - биологическим характеристикам, и количество вновь открытых рецепторов растет с каждым годом (Ноуег, 1994). Другим важным в серотонинергическои передаче элементом, является 5-НТ транспортер. Этот белок локализован на мембранах 5-НТ нервных окончаний и ответственен за захват и высвобождение серотонина в этих окончаниях (Dawson, 1983). Было показано, что в гиппокампе мышей, дефицитных по 5-НТ транспортеру, увеличено количество окисленных ДНК-аддуктов.. Учитывая важность гиппокампа для процессов обучения и памяти, становится очевидным, к каким нейрохимическим последствиям может привести отсутствие серотонинового транспортера в мозге (Davis et al., 2000).
В последние время накапливается все больше фактов свидетельствующих о том, что серотонин может участвовать в запуске различных путей клеточной трансдукции, в результате чего происходит генерация АКМ. Примером этому может служить участие серотонина, как вазоактивного пептида в качестве посредника при клеточной гипертрофии и гиперплазии в тканях с активным потреблением кислорода (Fanburg, Lee, 1997; Lee S. et al., 1994). Это происходит по следующему возможному механизму. Серотонин транспортируется В: клетку с помощью серотонинового транспортера или связываясь с рядом различных G-бел ков белок относится к семейству поверхностных клеточных рецепторов). Далее внутриклеточный транспорт 5-НТ индуцирует фосфорилирование тирозина GTP-аза-акти вирую щим белком, что в свою очередь вызывает активацию НАДФН-зависимой оксидазы, генерирующей супероксидный анион. Далее супероксидный анион активирует митоген-активированную МАР киназу, происходит индукция транскрипции, что и приводит к гипертрофии или гиперплазии ткани. Часть 02т при взаимодействии с СОД переходит в Н2О2. Оба этих продукта служат в различных системах как вторичные посредники для активации внутриклеточных сигнальных путей (Griendling et al., 2000; Irani, 2000; Rhee, 1999).
Связь между транспортом 5-НТ; и генерацией АКМ также была показана в стриатуме, где активация 5-НТ транспортера способствует 3,4-метилендиоксиметамфетамин — индуцированной генерации АКМ и уменьшению количества 5-НТ в мозге (Shankaran et al., 1999).
Возрастные изменения содержания восстановленного глутатиона и а-токоферола:. в мозге крыс линий OXYS и Вистар
Взаимодействие факторов возраста, генотипа и; структуры (F6)2i6=4,7; р=0,0002) указывает на различия в возрастных; изменениях содержания продуктов ПОЛ в регионах мозга крыс Вистар и OXYS. Анализ зависимости изменения признаков от генотипа и возраста не выявил влияния этих факторов только в одной структуре - фронтальной коре. В среднем мозге крыс OXYS содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов -выше, чем у Вистар и в 2 мес, и в 18 мес. (Fj,i6 = 20,3; р=0,01 и Fu8 = 5,9; р=0,032, соответственно), однако возраст на этот показатель не влияет. В то же время содержание в среднем мозге конечных продуктов ПОЛ, оснований Шиффа, зависит и от возраста (F3i=4,52, р = 0,041), и от генотипа (Fі,31=4,2; p = 0,042). Их содержание у крыс OXYS также выше, чем у Вистар: в 2 мес. в 1,5 раза, в 18 мес. - в 1,7 раз. Нужно отметить, что только в среднем мозге крыс OXYS выявлено значимое, в 1,5 раза увеличение содержания этих продуктов ПОЛ с возрастом.
Генотип влияет на содержание продуктов ПОЛ в гиппокампе -содержание оснований Шиффа в нем у молодых крыс OXYS на 28% выше, чем у Вистар (Fізі=8,14, р = 0,007). Зависит показатель и от возраста (F1 31=7,79, р=0,009): в 18 мес. у крыс обеих линий содержание продуктов ПОЛ ниже, чем у молодых животных. Однако достоверными оказались только возрастные изменения . содержания диеновых конъюгатов у крыс OXYS и флюоресцирующих продуктов ПОЛ - у Вистар (рис. 7-8).
На содержание продуктов ПОЛ в гипоталамусе генотип не влияет, но оно существенно изменяется с возрастом; (для диеновых конъюгатов FU1=11,74, р = 0,002, для оснований Шиффа FUi=18,34,p=0,0002). Содержание продуктов ПОЛ в этой структуре, как и в гиппокампе, у 18 мес. крыс обеих линий ниже, чем у молодых. Так, содержание диеновых конъюгатов у Вистар оказалось ниже на 20%, у OXYS - на 23%. Однако по данным однофакторного анализа внутри линий достоверным это снижение было только для крыс OXYS (Fi,i7=10,2, р = 0,005). Гораздо более существенными оказались возрастные различия в содержании оснований Шиффа - у 18-мес. крыс Вистар их содержание в 2: раза ниже, чем у 2-месячных (FU5=38,5, р = 0,00002), у OXYS - в 1,7 раз (FM5=3,97; р = 0,05).
Ни у молодых, ни у 18-мес. животных не выявлено межлинейных различий в миндалине, а с возрастные изменения - рост содержания продуктов ПОЛ - наблюдались только у крыс Вистар. Генотип и возраст влияют на активность ПОЛ в прилежащих ядрах: у крыс OXYS в 2 мес, содержание диеновых конъюгатов выше, чем у Вистар в 1,3 раза (Fij5 = 4,6; р = 0,041). С возрастом содержание диеновых конъюгатов растет (F n = 4,6; р = 0,041) и в 18 мес. становится в 1, 6 раза выше соответствующего контроля (Fi,i6 = 5,8; р = 0,0035). В то же время значимых межлинейных различии в содержании; оснований Шиффа не обнаружено. С возрастом показатель растет, но только у крыс Вистар он в 18 мес. значимо выше, чем в 2 мес. (FM7= 5,26; р = 0,024).
В стриатуме содержание продуктов ПОЛ от генотипа не зависит, но изменяется с возрастом: Fi 3i = 10,4; р = 0,003 для диеновых конъюгатов и Fi,3o = 3,5; р = 0,060 для оснований Шиффа. Взаимодействие факторов возраста и генотипа (Fli31 = 5,9; р. = 0,021) указывает на межлинейные различия возрастных изменений активности ПОЛ в этой структуре мозга. Действительно, только у OXYS они достоверны: в 18 мес. содержание диеновых конъюгатов на 39% (F\7ie = 19,51; р = 0,0004), а оснований Шиффа -на 23% (Fi,ls - 8,92; р = 0,009) ниже, чем в 2 мес.
Таким образом, и у крыс Вистар, и у OXYS регионы мозга существенно различаются по активности процессов ПОЛ. Наглядно полученные результаты можно представить как отклонения от средневзвешенного содержания продуктов ПОЛ (рис.9). Независимо от возраста, эти отклонения более выражены у крыс Вистар и между "полярными" структурами достигают 270% у молодых и 240% у 18-мес. животных, в то время как у OXYS - 177% и 230%, соответственно.
Результаты настоящего исследования подтвердили полученные ранее данные, что активации процессов ПОЛ, затрагивающей все регионы мозга у крыс OXYS не происходит, однако в четырех структурах мозга молодых животных содержание продуктов ПОЛ выше, чем у Вистар: в среднем мозге, гиппокампе, прилежащих ядрах и стриатуме - структурах, связанных с процессами обучения, памяти. В возрасте 18 мес. повышенный, по сравнению с соответствующим контролем, уровень, продуктов ПОЛ наблюдался только среднем мозге, гиппокампе и прилежащих ядрах.
Следует отметить, что в ряде структур мозга содержание продуктов ПОЛ в 18 мес. оказалось более низким, чем в 2 мес. Такими структурами оказались гиппокамп и гипоталамус для крыс обеих линий и стриатум - для крыс OXYS. Более высокий, чем у молодых животных уровень продуктов ПОЛ регистрировался у 18 мес. крыс Вистар в миндалине и прилежащих ядрах, у крыс OXYS - в прилежащих ядрах и среднем мозге. Эти результаты дают основание заключить, что разнонаправленность изменений в значительной степени стала причиной того, что при анализе целого мозга не удалось выявить межлинейных различий в уровне продуктов ПОЛ.
В литературе есть прямые и косвенные свидетельства того, что активность свободнорадикальных процессов в регионах мозга не одинакова и с возрастом изменяется (Arivazhagan et al., 2002; Cardozo-Pelaez et al., 2000). Изменения активности ПОЛ в регионах мозга крыс с возрастом разнонаправлены и менее выражены, чем. межструктурные различия (Kristofikova et al., 1995). Но данных по этому вопросу мало и они не однозначны. Максимальным количеством структур, исследуемых в одной работе, было 3 структуры. Наши данные согласуются с литературными данными, действительно, межрегиональные различия у наших животных значительно больше, чем возрастные.
Межструктурные различия в содержание продуктов ПОЛ нельзя объяснить недостаточностью антиоксидантной защиты в той или иной структуре.. Их. присутствие в мозге молодых животных скорее отражает различия в напряжении кислорода, интенсивности регионарного кровотока, соотношения процессов доставки и потребления кислорода и, соответственно, разной интенсивности окислительного метаболизма. Подтверждением нашей точки зрения явилась работа, в которой показано, что содержание продуктов ПОЛ в мозге интенсивно растущих 20-дневных крыс существенно выше, чем у 3-месячных (Галкина и др., 2002).
Обмен серотонвна в структурах мозга крыс линий OXYS и Вистар разного возраста
Однофакторный дисперсионный анализ, проведенный отдельно для каждого генотипа, показал, что в среднем мозге 18 мес. крыс Вистар содержание 5-НТ выше, чем у 2 мес. (Fi ,н=6; р = 0,03). Несмотря на отсутствие значимых изменений в уровне 5-ГИУК (табл. 1), следует отметить отчетливую тенденцию роста к 18 мес. у крыс Вистар, У крыс OXYS картина изменения метаболизма 5-НТ в среднем мозге оказалась обратной (табл. 2) -к 18 мес. содержание 5-НТ снижалось (Ftji6=5,96; р = 0,03), также как и уровень его основного метаболита (Fij7=7,53; р 0,01). Показатель катаболизма серотонина (5-ГИУК/5-НТ) с возрастом не изменялся как у Вистар, так и у OXYS (табл. 3).
Post hoc сравнения выявили межлинейные различия в уровне 5-НТ (рЮ,001) и 5-ГИУК (р 0,01) в среднем- мозге 2 мес. животных: их содержание у крыс OXYS было выше, чем у Вистар, тогда как в 18 мес. такие различия отсутствовали. Следует также отметить, что содержание 5-НТ и 5-ГИУК в мозге молодых крыс OXYS оказалось более высоким, чем у 18 мес. Вистар (Fiii7=7 3; р = 0,037 и F117 =7,53; р 0,01, соответственно). Такие результаты согласуются с данными Н.Войтенко (2001) о том, что активность МАО А в стволе мозга молодых, 4-месячных крыс OXYS снижена, по сравнению с контрольными животными, но с возрастом активность фермента растет и к 8 мес. различия стираются.
В гипоталамусе, центральном звене трансформирования медиаторных процессов в гормональные, содержание 5-НТ и 5-ГИУК зависело только от возраста (Fi26=11,05; р 0,01 и FIJ29=8,46; р 0,01, соответственно).. В этой структуре мозга направленность возрастных изменений показателей оказалась одинаковой для крыс обеих линий: в 18 мес. содержание 5-НТ и 5-ГИУК в гипоталамусе животных было выше, чем в 2 мес. Post hoc сравнения, проведенные в рамках двухфакторного анализа, выявили существенный рост 5-НТ у Вистар (р 0,05), тогда как у крыс с преждевременным старением увеличение было на уровне отчетливой тенденции. Достоверное же увеличение 5-ГИУК" с возрастом, напротив, отмечено у OXYS (р = 0,02),. тогда как у Вистар можно говорить только о тенденции к росту этого показателя. Рассчитанный для гипоталамуса коэффициент катаболизма не изменился с возрастом у OXYS, хотя у Вистар имеется отчетливая тенденция к его снижению у 18 мес. животных (табл. 3).
Как показал факторный анализ, с возрастом содержание 5-НТ меняется и в других структурах мозга, получающих серотониновую иннервацию от ядер шва среднего мозга. Было установлено влияние возраста на содержание 5-НТ в гиппокампе (Рі;л=11,77; р 0,001) и фронтальной коре (Fi,26=5,14; р = 0,03) (табл. 1 и 2). Post hoc анализ показал, что содержание 5-НТ в гиппокампе крыс Вистар в возрасте 18 мес. достоверно ниже, чем в 2 мес. (р 0,01), в то время как у OXYS наблюдалась только тенденция к его снижению. В миндалине уровень 5-ГИУК к 18 мес. также снижался (F]j27=H,25; р = 0,002), однако по результатам post hoc сравнения достоверно этот показатель изменялся только у крыс OXYS (р = 0,02). Важно отметить, что по результатам однофакторного дисперсионного анализа содержание 5-НТ в гиппокампе и миндалине молодых крыс OXYS выше, чем; у старых крыс Вистар (F]j5=5,0; р = 0,041 и FU3=5,0; р = 0,008, соответственно).
На содержание 5-НТ в стриатуме ни генотип, ни возраст не влияли, однако содержание 5-ГИУК зависело от генотипа (Flt31=24,25; р 0,001) и возраста (Рі,зі=9,89; р 0,01). Post hoc анализ показал достоверное увеличение 5-ГИУК к 18 мес. у Вистар (р 0,01), а также межлинейные различия: у крыс OXYS содержание основного метаболита серотонина в стриатуме выше, чем у Вистар, и в 2 (р 0,001), и в 18 мес. (р 0,01). Анализ эффективности катаболизма 5-НТ в исследованных структурах выявил отчетливую тенденцию к его снижению с возрастом в миндалине и повышению - в прилежащих ядрах крыс обеих линий. В стриатуме же увеличение 5-ГИУК/5-НТ с возрастом происходило только у крыс Вистар (р = 0,006), однако и в 2 мес. эффективность катаболизма 5-НТ у крыс OXYS была выше соответствующего контроля (р = 0,006) и не отличалась от значений, характерных для 18 мес. крыс Вистар.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о вовлечении серотониновой системы мозга в центральные механизмы старения. Как отмечалось выше, в литературе нет единой, точки зрения о характере возрастных изменений обмена серотонина в мозге. По данным (Petkov et aL, 1987), в стареющем мозге крыс преобладает тенденция к снижению содержания 5-НТ. В работе Li и соавт. (1995), проводивших оценку обмена серотонина в лимбических структурах мозга крыс, напротив, утверждается, что с возрастом; содержание 5-НТ растет, и это ведет к повышению тревожности животных. Как показали результаты наших исследований, неоднозначность оценки возрастных изменений обмена 5-НТ могла быть обусловлена тем, что направленность изменений не одинакова для различных, структур мозга и зависит от генотипа животных. Если в гипоталамусе и фронтальной коре крыс Вистар и OXYS с возрастом содержание 5-НТ растет, то в гиппокампе, миндалине и стриатуме - снижается. В то же время в основной серотонинергической структуре мозга, среднем мозге, возрастные изменения обмена 5-НТ разнонаправлены. У крыс Вистар в процессе старения содержание 5-НТ и 5-ГИУК растет, у крыс OXYS - снижается, в результате чего к 18 мес. межлинейные различия стираются.
Анализируя полученные данные, следует отметить, что обмен 5-НТ в структурах мозга, получающих серотониновую иннервацию и являющихся ключевыми в возникновении ранних нарушений памяти, ассоциативного обучения, селективного внимания, тормозных процессов у молодых крыс OXYS в значительной степени соответствует таковому у старых крыс Вистар.
Результаты оценки содержания 5-НТ в структурах мозга животных были сопоставлены с данными о содержании в них продуктов ПОЛ. Оказалось, что между этими показателями существует отрицательная связь -чем выше в структуре мозга животных концентрация 5-НТ, тем ниже в нём содержание продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и оснований Шиффа (г = - 0,59, р = 0,001 и г = - 0,54, р = 0,003, соответственно). Такие результаты указывают на то, что 5-НТ, один из важнейших медиаторов стресс-лимитирующей системы, способен существенно влиять на баланс в системе «про- и антиоксиданты» в мозге животных. К тому же ранее была показана высокая антирадикальная активность серотонина в экспериментах in vitro (Бурлакова и др., 1992; Sariahmetoglu et al., 2003).
