Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 10
1.1 АКМ в нормальном функционировании мозга 10
1.2 Роль АКМ в процессе старения мозга 20
1.3. Серотонинергическая система и старение 31
1.4 Антиоксид анты в профилактике старения 40
Заключение 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований. 51
ГЛАВА 3. Результаты исследований. 60
3.1. Возрастные изменения содержания окисленных белков и липидов в мозге крыс линий OXYS и Вистар 61
3.2. Возрастные изменения содержания восстановленного глутатиона и а-токоферола:. в мозге крыс линий OXYS и Вистар 63
3.3. Возрастные изменения активности СОД в ,мозге крыс линий OXYS и Вистар 67
3.4. Сравнительный анализ содержания продуктов ПОЛ в мозге крыс линий OXYS и: Вистар в различные возрастные периоды 69
3.5. Обмен серотонвна в структурах мозга крыс линий OXYS и Вистар разного возраста 77
3.6. Влияние экстракта черники: (Vaccinium Myrtillus) и а- токоферола на способность к однократному обучению и параметры окислительного стресса у крыс линий OXYS и Вистар 85
Обсуждение результатов 96
Выводы. 104
Список цитируемой литературы 106
- Роль АКМ в процессе старения мозга
- Антиоксид анты в профилактике старения
- Возрастные изменения содержания восстановленного глутатиона и а-токоферола:. в мозге крыс линий OXYS и Вистар
- Обмен серотонвна в структурах мозга крыс линий OXYS и Вистар разного возраста
Введение к работе
Актуальность темы. Существенный рост доли пожилых людей в населении развитых стран определил особую актуальность повышения качества жизни людей старшего- возраста, обеспечения полноценной активной старости. Поэтому не случайно в разработанной ООН программе научных исследований по проблеме старения в XXI веке концепция здорового старения отнесена к наиболее приоритетным направлениям (Анисимов, 2000). Очевидно, что выяснение биохимических механизмов и разработка средств профилактики преждевременного старения являются ключевыми задачами в реализации этих программ.
В последние годы активно развивается свободнорадикальная теория старения, практически одновременно выдвинутая Харманом: Д. (1956) и: Эмануэлем Н.М. (1958). Согласно этой теории, свободные радикалы, образующиеся в результате различных окислительных реакций в организме, оказывают множественные повреждающие эффекты на макромолекулы (нуклеиновые кислоты, белки, ли пиды), вызывая их деградацию и старение; Свободнорадикальная теория объясняет не только механизмы старения, но и широкий круг связанных с ним патологических процессов. Это привело к стремительному росту количества обладающих антиоксидантными свойствами фармакологических препаратов и биологически активных добавок, рекомендуемых для профилактики старения и лечения связанных с ним заболеваний, в том числе - нейродегенеративных (Middleton et al., 2000; Mattson M., 2001; Joseph et al., 2000; Head E. and Zicker S., 2004).
Между тем в последние годы представления об участии активированных кислородных метаболитов (АКМ) в физиологических процессах существенно расширились и польза от подавления свободнорадикальных процессов в организме, особенно в здоровом, уже не всегда представляется бесспорной. АКМ вовлечены в регуляцию многих физиологических процессов на всех уровнях - от активации внутриклеточных ферментов до нервной регуляции и регуляции сосудистого тонуса, от клеточной пролиферации и дифференцировки до апоптоза и регуляции экспрессии генов (Турпаев, 2002; Droge W., 2002; Macher P. and Schubert D., 2000; Esposito F. et alt 2004; Zhang J. et alt> 2004). AKM постоянно образуются в центральной нервной системе в процессе нормальной жизнедеятельности (окислительных процессов в митохондриях, метаболизма моноаминов и др.), однако подавляющее большинство из них нейтрализуется факторами антиоксидантной защиты организма (Remmen Н., 2001). С возрастом увеличивается вероятность развития окислительного стресса, который рассматривается как нарушение баланса в системе "про- и антиоксиданты" в сторону преобладания прооксидантов (Зенков и др., 2001). Накопление окислительных повреждений макромолекул в клетках мозга может приводить к деполяризации мембран нейронов, изменению порога их чувствительности к действию нейромедиаторов, к нарушению оптимальных условий функционирования рецепторов, транспортных систем, ферментов сигнальной трансдукции и, как следствие, к нарушению функций мозга, в том числе - способности к обучению, памяти (Nicholls D., 2000; Liu Л. et а/., 2002; Droge W., 2002). Стрессы, неблагоприятные воздействия окружающей среды, неполноценное питание,, заболевания, ведущие к активации свободнорадикальных процессов, способствуют раннему старению организма (Mattson, 2001; Sagara etal, 1998).
Выяснение биохимических механизмов, лежащих в основе возрастных нарушений: когнитивных функций и разработка эффективных средств их профилактики - актуальные задачи не только фундаментальной науки, но и практической медицины. Их решению способствует использование адекватных биологических моделей. Линия мышей SAMP (senescence-prone accelerated mice), созданная японскими учеными, на сегодня единственная общепризнанная модель преждевременного старения (Takeda Т. et aL, 1981, 1991), которое связывают с нарушением баланса между скоростями генерации и утилизации АКМ (Edamatsu R. et aLy 1995; Hosokawa M; et at, 2000),
Проведенные к моменту выполнения настоящей работы исследования позволили предположить, что адекватной моделью преждевременного старения могут служить также крысы OXYS. По многим параметрам прослеживается; очевидное сходство между этими животными и мышами линий SAMP, тем не менее, крысам линии OXYS присущи свои особенности, которые делают эту модель уникальной.
Линия крыс OXYS создана в Институте цитологии и генетики СО РАН селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы (Соловьева и др., 1975). Как показали исследования последних лет, этих животных отличает комплекс признаков, которые могут быть определены как синдром ускоренного старения: сниженная; максимальная продолжительность жизни, ранние катаракты, инволютивные изменения органов (Колосова и др., 2001, 2003а; Маркова, 2003). Уже в 3 месяца у крыс OXYS выявлены нарушения условной реакции пассивного избегания, проявляющиеся в снижении способности к запоминанию новой информации при ее однократном предъявлении (Лоскутова, Колосова, 2000; Лоскутова, Зеленкина, 2002). Из литературы известно, что этот признак является наиболее ранним симптомом нарушения памяти стареющих людей и животных (Huppert, 1991).
Преждевременное старение крыс OXYS ранее связывали с «врожденной гиперпродукцией свободных радикалов» (Salganik et ah, 1994а), которая стала ключевой характеристикой линии при ее регистрации (Rat genome, 1996). Однако оценка генерации АКМ митохондриями печени в различных, метаболических состояниях, проведенная методами хемилюминесцентного анализа, показала, что их продукция у крыс OXYS не только не повышена, а даже ниже, чем у крыс Вистар (Меньшикова и др., 2000; 2002; Панин и др., 2004).
В мозге крыс OXYS какие-либо параметры окислительного стресса ранее не исследовались, и вопрос о его участии в патогенезе ранних изменений в когнитивной и эмоциональной сфере оставался открытым. Возрастные нарушения когнитивных функций тесно связаны с изменениями в медиаторных системах мозга, в частности серотонинергической, оценка состояния которой у крыс OXYS не проводилась.
На основании вышеизложенного, целью настоящей работы явилось выяснение роли окислительного стресса и обмена серотонина в проявлениях преждевременного старения мозга крыс OXYS. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Сопоставить динамику возрастных изменений содержания окисленных белков и липидов в мозге крыс линий OXYS и Вистар.
Изучить возрастные изменения ряда параметров системы антиоксидантной защиты: активности СОД, содержания восстановленного глутатиона и а-токоферола в мозге крыс OXYS и Вистар.
Провести анализ содержания продуктов ПОЛ как маркеров окислительного стресса в структурах мозга морфофункциональной эмоциогенной системы, участвующей в процессах обучения и памяти, крыс OXYS и Вистар разного возраста.
Изучить изменения в обмене серотонина в структурах мозга крыс OXYS и Вистар в процессе старения.
Выяснить наличие взаимосвязи антиоксидантных свойств витамина Е и экстракта черники с их способностью предотвращать нарушения когнитивных функций у крыс OXYS.
Научная новизна. Впервые показано, что в мозге крыс OXYS накопление маркеров окислительного стресса - окисленных белков и липидов происходит интенсивней, чем у крыс Вистар, однако межлинейные различия по этим параметрам появляются позже, чем фиксируются характерные для стареющих людей и животных отклонения в когнитивной и эмоциональной сферах у крыс OXYS. Развитие этих отклонений у молодых животных протекает на фоне повышенной активности СОД и сниженного содержания восстановленного глутатиона, а также активации ПОЛ в критических для обучения и памяти структурах мозга. Выявлены значительные различия в активности процессов ПОЛ между регионами мозга, которые у крыс обеих линий оказались более существенными, чем возрастные.
Впервые установлено, что существует корреляционная связь между содержанием серотонина и продуктов ПОЛ в структурах мозга животных:, чем выше концентрация серотонин, тем ниже в них содержание продуктов; ПОЛ.
Впервые обнаружено, что возрастные изменения содержания серотонина и 5-ГИУК в отдельных структурах, мозга разнонаправлены и зависят от генотипа животных.. В критических, для обучения и памяти структурах мозга молодых крыс OXYS состояние метаболизма серотонина в значительной степени соответствует таковому у старых крыс Вистар, что свидетельствует о связи проявлений раннего старения мозга крыс OXYS с изменениями в серотонинергической системе.
Впервые продемонстрирована способность экстракта черники предупреждать нарушения памяти, снижая при этом содержание продуктов ПОЛ и активность СОД в мозге крыс OXYS;
Практическая значимость. Показано, что линия крыс OXYS может использоваться как перспективная модель для изучения, механизмов старения, патогенеза связанных с ним нейродегенративных процессов и разработки способов их профилактики, для оценки эффективности уже известных и новых фармакологических препаратов и биологически активных добавок. Результаты проведенного анализа эффектов экстракта черники и витамина Е расширяют представления о механизмах их геронтопротекторного действия. Экстракт черники может быть рекомендован для профилактики возрастных нарушений памяти у людей.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
В мозге молодых крыс OXYS содержание окисленных белков и липидов не отличается от крыс Вистар. Активность СОД увеличена на фоне сниженного количества восстановленного глутатиона, что служит доказательством повышенной генерации активированных кислородных метаболитов.
Нарушение способности к однократному обучению у крыс OXYS развивается на фоне активации ПОЛ и изменений обмена серотонина в структурах мозга, связанных с процессами обучения и памяти.
3. Возможность с помощью антиоксидантов предупреждать нарушение способности к однократному обучению свидетельствует об участии окислительного стресса в развитии дисфункций мозга у крыс OXYS.
Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были доложены на VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002), на IV съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002), на II Международной конференции по биоинформатики геномной регуляции и структуры (Новосибирск, 2002), на Национальной научно-практической конференции с международным участием "Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека" (Смоленск, 2003) и на I Международной конференции "Полифенолы и здоровье" (Виши, Франция, 2003).
Материалы диссертации представлены в 10 публикациях, 4 из них - в рецензируемых журналах.
Роль АКМ в процессе старения мозга
Огромное число систем в клетке, генерирующих кислородные радикалы, катализируют окислительные модификации белков, что приводит к серьезным нарушениям в структуре белковой молекулы и к изменениям ее физико-химических и биологических свойств и к старению. Подвергаясь окислительной инактивации АКМ, белки становятся более чувствительными к эндогенному протеолизу (Дубинина, Шугалей,1993).
Специфика окислительной модификации белков определяется особенностью аминокислотного состава и структурной организации биомолекул. Причем, в зависимости от интенсивности процессов генерации АКМ, степень окислительной модификаци белков может быть разной. В результате действия АКМ в большинстве случаев изменяется ферментативная активность белков. Супероксидный анион-радикал in vitro ингибирует активность ацетилхолинэстеразы, каталазы, ГТТ. Пероксид водорода инактивирует СОД, миелопероксидазу, участвует в инактивации цитохрома Р-450. Н2О2 взаимодействует с Fe гема цитохрома, в результате образуются гидроксил радикалы, которые модифицируют близлежащие аминокислотные остатки белков (Дубинина, Шугалей, 1993).
Обнаружено ингибирующее действие НО на активность ГП, СОД, лактатдегидрогеназы, трипсина, химотрипсина, алкогольдегидрогеназы и других ферментов(МісЬіеІ8 at al., 1990; Pigeolet, Remade, 1991; Davies, 1987).
Изменения активности ферментов под влиянием АКМ объясняют в основном локальными нарушениями в области активного центра. Эти нарушения могут быть связаны с модификацией аминокислотных остатков, изменением валентности и нарушением координационной геометрии металлов для ряда металлсодержащих ферментов (Condell, 1983;: Fuchs, Borders, 1983).
В: опытах in vitro было показано, что окислительная- модификация белков под действием АКМ сопровождается либо их агрегацией, либо фрагментацией на более мелкие компоненты. Причем такие измененные белки становятся более чувствительными к процессам протеолиза (Дубинина, Шугалей, 1993). Процессу агрегации предшествует процесс образования радикальных центров; под действием АКМ в различных структурных компонентах биомолекул, что повышает их способность к агрегации. Такими участками у белков могут быть углеводные, нуклеотидные, серосодержащие и ароматические фрагменты.
Было показано, что образование 90% агрегатов белков под действием ОН обусловлено межмолекулярными битирозиновыми сшивками и только 10% белков образуют агрегаты за; счет дисульфидных и нековалентных связей. Битирозин представляет собой ковалентныи бифенол, образованный в реакции двух молекул тирозил радикалов через бифенольные остатки (Дубинина, Шугалей, 1993).
Процесс фрагментации белка связан с отщеплением Н+ от карбонильной группы аминокислот за счет ОН и образованием в дальнейшем при взаимодействии с 02 или Ог перекисных соединений. Окислительным модификациям подвергаются практически все аминокислоты, но особенно триптофан, тирозин, гистидин и цистеин, что было показано на примерах бычьего сывороточного альбумина и pV микроглобулина (Berlett, Stadtman, 1997).
Мишенной группой при взаимодействии с АКМ могут служить дисульфидные, сульфгидрильные, карбонильные, карбоксильные и Шз+-группы. Наибольшей реакционной способностью обладает цистеин и цистин, что обусловлено легкой поляризуемостью SH- и SC-групп. Умеренной реакционной способностью характеризуются тирозин, фенилаланин и триптофан, гистидин (Berlett, Stadtman, 1997).
Известно, что фрагментацию белков могут вызывать органические радикалы, вовлеченные в ПОЛ, которые способны атаковать, белки гидрофобных областей мембран. Некоторые считают, что радикальной атаке подвергаются вначале не липиды, а белки плазматической мембраны, что приводит к ее деполяризации. Таким образом, накопление окисленных белков рассматривается как один из факторов регуляции синтеза и распада белков и активации протеаз, избирательно разрушающих такие модифицированные белки (Дубинина, Шугалей, 1993).
Было показано, что в процессе старения организма повышается чувствительность многих ферментов (в частности, протеаз) к действию АКМ, и в тканях накапливаются окисленные формы белков. Наиболее хорошо изучеными маркерами окисления белков являются карбонильные группы белков. Карбонильные группы белков формируются при окислении остатков лизина, пролина, аргинина; (Berlett et al., 1998) - как прямой результат окислительного стресса или как следствие перекисного окисления липидов. (Giammarioli, 1999). Таким образом, возрастное накопление в клетках карбонильных групп белков может служить маркером старения.
Антиоксид анты в профилактике старения
Увеличение продолжительности жизни человека является одной из важнейших задач геронтологии и, в целом, современной профилактической медицины. В настоящее время известен ряд веществ, в отношении которых показана способность увеличивать продолжительность жизни и улучшать качество жизни при старении, и получивших название геронтопротекторов (Анисимов, 2000). Предложенные на основе различных теорий старения геронтопротекторы обладают различным механизмом действия. Подтвержденное многочисленными исследованиями участие свободных радикалов в процессе старения (свободнорадикальная теория старения) вызвало закономерный интерес к использованию антиоксидантов в качестве геронтопротекторов (Анисимов, 2000; Harman, 1994).
Как правило, под антиоксидантами понимают широкий класс веществ различной химической природы, которые, присутствуя в низких, по сравнению с окисляемым субстратом, концентрациях, способны тормозить или устранять окисление органических соединений: (Меньшикова и др., 1993).
Ферментативные антиоксиданты, такие как СОД, каталаза, ГП, являются, в основном, средством внутриклеточной защиты, а в сыворотке, лимфе и других средах их содержание не велико. Вместе с тем во всех водных и липидных фазах организма; также протекают радикальные окислительные процессы, в защите от которых важную роль играют другие антиоксиданты. Среди таких антиоксидантов можно выделить большой ряд соединений, содержащих функциональные ОН-группы (к которым относятся фенольные антиоксиданты)..
Главным действующим началом, обеспечивающим фенольным, антиоксидантам способность тормозить радикальные процессы окисления, является гидроксильная группа, присоединенная к ароматическому ядру. Антиоксидантные свойства фенольных соединений существенно зависят от количества ОН-групп, их положения и степени экранирования (Бакалова и др., 1991; Бурлакова и др., 1992), а также, как в случае токоферолов и убихинонов, от строения углеводородного "хвоста",. обеспечивающего мобильность и ориентацию молекул в структурированных: субстратах (липосомы, микросомы, митохондрии): антиоксидантная активность токоферолов в этих условиях на 1-2 порядка; выше по сравнению с окислением в жидой фазе, что связано с ориентацией ОН-группы в сторону гидрофильной; среды (Бурлакова и др., 1985), повышение же степени ненасыщенности углеводородного "хвоста" приводит к усилению антиоксидантних свойств соединения (Suzuki et al., 1993).
В настоящее время выделено несколько тысяч фенольных соединений, среди которых выраженным антиоксидантним эффектом обладают витамин Е, убихиноны, триптофан, и фенилаланин, а также большинство растительных (флавоноиды, фенокарбоксильные кислоты) и животных пигментов (Абрамова, Оксенгендлер, 1985; Beyer, 1990).
В растениях фенольные антиоксиданты являются обязательным компонентом и присутствуют в значительных количествах (1-2% биомассы). Как правило, синтез; ароматического кольца возможен только у высших растений и микроорганизмов, в то время как животные преимущественно только преобразовывают различные ароматические соединения. Поэтому многие из фенольных антиоксидантов- входят в группу так называемых "пищевых антиоксидантов", то есть соединений, потребность организма в которых удовлетворяется поступлением с пищей.
Полифенолы, являясь природными антиоксидантами, обладают антипролиферативными и фермент-модулирующими активностями. Результаты исследований, полученные из различных областей, предполагают их участие в предотвращении дегенеративных заболеваний, таких как рак, сердечнососудистые заболевания, остеопороз и нейродегенеративные заболевания. В данной главе будут рассмотрены, используемые в работе фенольные антиоксиданты, гидрофобные и водорастворимые соединения, такие как Витамин Е и флавоноиды (они содержатся в экстракте черники).
Токоферолы синтезируются растениями и находятся преимущественно в растительном масле; они являются обязательными компонентами пищи человека и; животных. В клетках животных в наибольших концентрациях присутствует а-токоферол (витамин Е) (Reiter, 1994), в растениях же синтезируются и другие виды токоферолов, такие как р, у, 6. а-Токоферол представляет собой жирорастворимый, обрывающий цепь окисления антиоксидант, играющий существенную роль в биологических мембранах. Значительная часть внутриклеточного а- токоферола сосредоточена также в ядре, где он находится в связанном с негистоновыми белками состянии и защищает хроматин от окислительных повреждений (Губский и др., 1993; Van Staden et al., 1993). Специфически связываясь с хроматином, он также оказывает влияние на процесс транскрипции как в ядрах, так и в митохондриях. В мозге а- токоферол оказывает влияние на экспрессию 2000 генов (Azzi et al., 1998). В разных тканях окислительный метаболизм а-токоферола идет по-разному: быстрее всего — в эритроцитах, печени, селезенке; медленнее — в сердце, мышцах,, спинном мозге; наиболее медленно - в головном мозге (Traber, 1995).
Витамин Е является количественно более важным антиоксидантом в плазме и в липопротеинах низкой плотности благодаря тому, что присутствует там в концентрациях по крайней мере в 15 раз выше, чем какие либо другие липид-растворимые антиоксиданты (Burton et al., 1983). а-Токоферол — обязательный компонент биологических мембран, обладающий мембран-стабилизирующими свойствами. С помощью гидрофобного конца а-токоферол встраивается в липопротеины или закрепляется в мембранах рядом с ненасыщенной жирной кислотой (Diploch, 1985), и фенольная гидроксильная группа гасит свободные радикалы. Токоферолы эффективно ингибируют окислительное действие супероксидного анион-радикала (Zhou, Zheng, 1991), синглетного кислорода (Devasagayam et al., 1992; Dimascio et al., 1990; Kaiser et al., 1990), пероксирадикалов (Бурлакова, 1992), OH-радикалов (Miura et al., 1993), индуцированные ROO- и ОН-радикалами процессы ПОЛ (Абрамова, Оксенгендлер, 1985; Zhou, Zheng, 1991).
Возрастные изменения содержания восстановленного глутатиона и а-токоферола:. в мозге крыс линий OXYS и Вистар
Несмотря на наличие нарушения в способности к: однократному обучению у 3-хмесячных крыс OXYS (Лоскутова, 2000), не было выявлено достоверных отличий от молодых крыс Вистар в содержании окислительных повреждений белков и липидов в их мозге. Из литературы известно, что при развитии с возрастом нейродегенеративных процессов у людей мишенью окислительного стресса в первую очередь становятся отдельные регионы мозга (Mattson, 2001). В связи с этим мы предположили, что и в мозге крыс OXYS возможно развитие подобных градиентов, выявить которые из-за небольшого объема критических для обучения и памяти структур возможно только при дифференциальном анализе активности свободнорадикальных процессов в них. Такая постановка вопроса продиктовала необходимость использовать методический подход, позволяющий, с одной стороны, ограничиться малым объемом образцов (достаточно 3-5 мг, из которых возможна экстракция 0,2-0,3 мг липидов), с другой - возможность, измерив количество липидов в образце, дать количественную оценку содержания первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов, и конечных - оснований Шиффа (флуоресцирующих продуктов).
Используя содержание этих продуктов ПОЛ в качестве маркеров окислительного стресса, мы исследовали их содержание у 2- и 18- месячных крыс OXYS и Вистар в среднем мозге, гиппокампе, гипоталамусе, миндалине, фронтальной коре, прилежащих ядрах и стриатуме - структурах морфофункциональной эмоциогенной системы.. Выбор структур основывылся на литературных данных о том, что в процессе однократного обучения участвуют структуры, входящие именно в эту систему (Ильюченок, 1981).
Результаты исследования, приведенные на рис. 7 и 8, свидетельствуют о существенной зависимости содержания продуктов ПОЛ от исследуемой структуры мозга (для диеновых конъюгатов F6,2i6 = 28,9; р = 0,000003, для: оснований Шиффа F6,2n = 8,95; р=0,001), от возраста (для; диеновых конъюгатов F1?217=14,6; р=0,0002, для оснований Шиффа Fii2n=10,7; р=0,001) и от генотипа животных (Fi)2n=3,3; р=0,05).
Содержание продуктов ПОЛ независимо от возраста и- генотипа животных минимально в среднем мозге (Содержание диеновых конъюгатов (ОП233 нм/мг липидов) составило: 0,191±0,006 (для 2 мес, Вистар); 0,193±0,019 (для 18 мес. Вистар); 0,284±0,015 (для 2 мес. OXYS); 0,270±0,014 (для 18 мес. OXYS). Содержание оснований Шиффа (отн.едУмг липидов) составило: 5,55±0,35 (для 2 мес. Вистар); 6,91±0,97 (для 18 мес. Вистар); 8,05±0,64 (для 2 мес. OXYS); 11,93±2,25 (для 18 мес. OXYS)). У молодых крыс обеих линий содержание продуктов ПОЛ максимально во фронтальной коре (Содержание диеновых конъюгатов (ОП233 нм/мг липидов) составило: 0,517±0,024 (для Вистар); 0,502±0,039 (для OXYS), Содержание оснований Шиффа (отн.ед./мг липидов) составило: 15,02±1,07 (для Вистар); 14,85±1,95 (для OXYS)), в то время как в 18 мес. у крыс Вистар оно высоко в коре (0,454+0,045 (диеновые конъюгаты); 16,87±2,10 (основания Шиффа)) и миндалине (0,496±0,023 (диеновые конъюгаты)), у OXYS - в прилежащих ядрах (0.551± 0.052 (диеновые конъюгаты)).
Взаимодействие факторов возраста, генотипа и; структуры (F6)2i6=4,7; р=0,0002) указывает на различия в возрастных; изменениях содержания продуктов ПОЛ в регионах мозга крыс Вистар и OXYS. Анализ зависимости изменения признаков от генотипа и возраста не выявил влияния этих факторов только в одной структуре - фронтальной коре. В среднем мозге крыс OXYS содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов -выше, чем у Вистар и в 2 мес, и в 18 мес. (Fj,i6 = 20,3; р=0,01 и Fu8 = 5,9; р=0,032, соответственно), однако возраст на этот показатель не влияет. В то же время содержание в среднем мозге конечных продуктов ПОЛ, оснований Шиффа, зависит и от возраста (F3i=4,52, р = 0,041), и от генотипа (Fі,31=4,2; p = 0,042). Их содержание у крыс OXYS также выше, чем у Вистар: в 2 мес. в 1,5 раза, в 18 мес. - в 1,7 раз. Нужно отметить, что только в среднем мозге крыс OXYS выявлено значимое, в 1,5 раза увеличение содержания этих продуктов ПОЛ с возрастом.
Генотип влияет на содержание продуктов ПОЛ в гиппокампе -содержание оснований Шиффа в нем у молодых крыс OXYS на 28% выше, чем у Вистар (Fізі=8,14, р = 0,007). Зависит показатель и от возраста (F1 31=7,79, р=0,009): в 18 мес. у крыс обеих линий содержание продуктов ПОЛ ниже, чем у молодых животных. Однако достоверными оказались только возрастные изменения . содержания диеновых конъюгатов у крыс OXYS и флюоресцирующих продуктов ПОЛ - у Вистар (рис. 7-8).
На содержание продуктов ПОЛ в гипоталамусе генотип не влияет, но оно существенно изменяется с возрастом; (для диеновых конъюгатов FU1=11,74, р = 0,002, для оснований Шиффа FUi=18,34,p=0,0002). Содержание продуктов ПОЛ в этой структуре, как и в гиппокампе, у 18 мес. крыс обеих линий ниже, чем у молодых. Так, содержание диеновых конъюгатов у Вистар оказалось ниже на 20%, у OXYS - на 23%. Однако по данным однофакторного анализа внутри линий достоверным это снижение было только для крыс OXYS (Fi,i7=10,2, р = 0,005). Гораздо более существенными оказались возрастные различия в содержании оснований Шиффа - у 18-мес. крыс Вистар их содержание в 2: раза ниже, чем у 2-месячных (FU5=38,5, р = 0,00002), у OXYS - в 1,7 раз (FM5=3,97; р = 0,05).
Ни у молодых, ни у 18-мес. животных не выявлено межлинейных различий в миндалине, а с возрастные изменения - рост содержания продуктов ПОЛ - наблюдались только у крыс Вистар. Генотип и возраст влияют на активность ПОЛ в прилежащих ядрах: у крыс OXYS в 2 мес, содержание диеновых конъюгатов выше, чем у Вистар в 1,3 раза (Fij5 = 4,6; р = 0,041). С возрастом содержание диеновых конъюгатов растет (F n = 4,6; р = 0,041) и в 18 мес. становится в 1, 6 раза выше соответствующего контроля (Fi,i6 = 5,8; р = 0,0035). В то же время значимых межлинейных различии в содержании; оснований Шиффа не обнаружено. С возрастом показатель растет, но только у крыс Вистар он в 18 мес. значимо выше, чем в 2 мес. (FM7= 5,26; р = 0,024).
В стриатуме содержание продуктов ПОЛ от генотипа не зависит, но изменяется с возрастом: Fi 3i = 10,4; р = 0,003 для диеновых конъюгатов и Fi,3o = 3,5; р = 0,060 для оснований Шиффа. Взаимодействие факторов возраста и генотипа (Fli31 = 5,9; р. = 0,021) указывает на межлинейные различия возрастных изменений активности ПОЛ в этой структуре мозга. Действительно, только у OXYS они достоверны: в 18 мес. содержание диеновых конъюгатов на 39% (F\7ie = 19,51; р = 0,0004), а оснований Шиффа -на 23% (Fi,15 - 8,92; р = 0,009) ниже, чем в 2 мес.
Обмен серотонвна в структурах мозга крыс линий OXYS и Вистар разного возраста
Однофакторный дисперсионный анализ, проведенный отдельно для каждого генотипа, показал, что в среднем мозге 18 мес. крыс Вистар содержание 5-НТ выше, чем у 2 мес. (Fi ,н=6; р = 0,03). Несмотря на отсутствие значимых изменений в уровне 5-ГИУК (табл. 1), следует отметить отчетливую тенденцию роста к 18 мес. у крыс Вистар, У крыс OXYS картина изменения метаболизма 5-НТ в среднем мозге оказалась обратной (табл. 2) -к 18 мес. содержание 5-НТ снижалось (Ftji6=5,96; р = 0,03), также как и уровень его основного метаболита (Fij7=7,53; р 0,01). Показатель катаболизма серотонина (5-ГИУК/5-НТ) с возрастом не изменялся как у Вистар, так и у OXYS (табл. 3).
Post hoc сравнения выявили межлинейные различия в уровне 5-НТ (рЮ,001) и 5-ГИУК (р 0,01) в среднем- мозге 2 мес. животных: их содержание у крыс OXYS было выше, чем у Вистар, тогда как в 18 мес. такие различия отсутствовали. Следует также отметить, что содержание 5-НТ и 5-ГИУК в мозге молодых крыс OXYS оказалось более высоким, чем у 18 мес. Вистар (Fi,17=7,53; р = 0,037 и Fii7 =7,53; р 0,01, соответственно). Такие результаты согласуются с данными Н.Войтенко (2001) о том, что активность МАО А в стволе мозга молодых, 4-месячных крыс OXYS снижена, по сравнению с контрольными животными, но с возрастом активность фермента растет и к 8 мес. различия стираются.
В гипоталамусе, центральном звене трансформирования медиаторных процессов в гормональные, содержание 5-НТ и 5-ГИУК зависело только от возраста (Fi26=11,05; р 0,01 и FIJ29=8,46; р 0,01, соответственно).. В этой структуре мозга направленность возрастных изменений показателей оказалась одинаковой для крыс обеих линий: в 18 мес. содержание 5-НТ и 5-ГИУК в гипоталамусе животных было выше, чем в 2 мес. Post hoc сравнения, проведенные в рамках двухфакторного анализа, выявили существенный рост 5-НТ у Вистар (р 0,05), тогда как у крыс с преждевременным старением увеличение было на уровне отчетливой тенденции. Достоверное же увеличение 5-ГИУК" с возрастом, напротив, отмечено у OXYS (р = 0,02),. тогда как у Вистар можно говорить только о тенденции к росту этого показателя. Рассчитанный для гипоталамуса коэффициент катаболизма не изменился с возрастом у OXYS, хотя у Вистар имеется отчетливая тенденция к его снижению у 18 мес. животных (табл. 3).
Как показал факторный анализ, с возрастом содержание 5-НТ меняется и в других структурах мозга, получающих серотониновую иннервацию от ядер шва среднего мозга. Было установлено влияние возраста на содержание 5-НТ в гиппокампе (Рі;л=11,77; р 0,001) и фронтальной коре (Fi,26=5,14; р = 0,03) (табл. 1 и 2). Post hoc анализ показал, что содержание 5-НТ в гиппокампе крыс Вистар в возрасте 18 мес. достоверно ниже, чем в 2 мес. (р 0,01), в то время как у OXYS наблюдалась только тенденция к его снижению. В миндалине уровень 5-ГИУК к 18 мес. также снижался (F]j27=H,25; р = 0,002), однако по результатам post hoc сравнения достоверно этот показатель изменялся только у крыс OXYS (р = 0,02). Важно отметить, что по результатам однофакторного дисперсионного анализа содержание 5-НТ в гиппокампе и миндалине молодых крыс OXYS выше, чем; у старых крыс Вистар (F]j5=5,0; р = 0,041 и FU3=5,0; р = 0,008, соответственно).
На содержание 5-НТ в стриатуме ни генотип, ни возраст не влияли, однако содержание 5-ГИУК зависело от генотипа (Flt31=24,25; р 0,001) и возраста (Рі,зі=9,89; р 0,01). Post hoc анализ показал достоверное увеличение 5-ГИУК к 18 мес. у Вистар (р 0,01), а также межлинейные различия: у крыс OXYS содержание основного метаболита серотонина в стриатуме выше, чем у Вистар, и в 2 (р 0,001), и в 18 мес. (р 0,01). Анализ эффективности катаболизма 5-НТ в исследованных структурах выявил отчетливую тенденцию к его снижению с возрастом в миндалине и повышению - в прилежащих ядрах крыс обеих линий. В стриатуме же увеличение 5-ГИУК/5-НТ с возрастом происходило только у крыс Вистар (р = 0,006), однако и в 2 мес. эффективность катаболизма 5-НТ у крыс OXYS была выше соответствующего контроля (р = 0,006) и не отличалась от значений, характерных для 18 мес. крыс Вистар.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о вовлечении серотониновой системы мозга в центральные механизмы старения. Как отмечалось выше, в литературе нет единой, точки зрения о характере возрастных изменений обмена серотонина в мозге. По данным (Petkov et aL, 1987), в стареющем мозге крыс преобладает тенденция к снижению содержания 5-НТ. В работе Li и соавт. (1995), проводивших оценку обмена серотонина в лимбических структурах мозга крыс, напротив, утверждается, что с возрастом; содержание 5-НТ растет, и это ведет к повышению тревожности животных. Как показали результаты наших исследований, неоднозначность оценки возрастных изменений обмена 5-НТ могла быть обусловлена тем, что направленность изменений не одинакова для различных, структур мозга и зависит от генотипа животных. Если в гипоталамусе и фронтальной коре крыс Вистар и OXYS с возрастом содержание 5-НТ растет, то в гиппокампе, миндалине и стриатуме - снижается. В то же время в основной серотонинергической структуре мозга, среднем мозге, возрастные изменения обмена 5-НТ разнонаправлены. У крыс Вистар в процессе старения содержание 5-НТ и 5-ГИУК растет, у крыс OXYS - снижается, в результате чего к 18 мес. межлинейные различия стираются.
Анализируя полученные данные, следует отметить, что обмен 5-НТ в структурах мозга, получающих серотониновую иннервацию и являющихся ключевыми в возникновении ранних нарушений памяти, ассоциативного обучения, селективного внимания, тормозных процессов у молодых крыс OXYS в значительной степени соответствует таковому у старых крыс Вистар.
Результаты оценки содержания 5-НТ в структурах мозга животных были сопоставлены с данными о содержании в них продуктов ПОЛ. Оказалось, что между этими показателями существует отрицательная связь -чем выше в структуре мозга животных концентрация 5-НТ, тем ниже в нём содержание продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и оснований Шиффа (г = - 0,59, р = 0,001 и г = - 0,54, р = 0,003, соответственно). Такие результаты указывают на то, что 5-НТ, один из важнейших медиаторов стресс-лимитирующей системы, способен существенно влиять на баланс в системе «про- и антиоксиданты» в мозге животных. К тому же ранее была показана высокая антирадикальная активность серотонина в экспериментах in vitro (Бурлакова и др., 1992; Sariahmetoglu et al., 2003).
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о вовлечении серотониновои системы мозга в центральные механизмы старения, а также о том, что появление признаков раннего старения мозга у крыс OXYS может быть связано с изменениями в обмене серотонина. С повышенным содержанием серотонина в отдельных структурах мозга может быть связана и высокая тревожность молодых крыс OXYS, что ранее было показано в работе Лоскутовой Л.В. и Колосовой Н.Г. (2000).
