Введение к работе
Актуальность проблемы. В условиях окислительного стресса
гиперпродукция активных форм кислорода (АФК) приводит к
окислению липидов, повреждению белков, нуклеиновых кислот и
других компонентов живых клеток. В число самых распространенных
повреждений ДНК входит окисленное производное гуанина - 8-
оксогуанин (8-oxoG). Это окисленное основание у эукариот
выщепляется 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой (OGG1). Нарушение
механизмов репарации ДНК приводит к различным патологическим
процессам, в число которых входят мутагенез, канцерогенез, дефекты
развития и старение. Основной проблемой при изучении влияния
окислительного стресса на ДНК при тех или иных патологиях человека
является отсутствие доступных методов количественного определения
поврежденных компонентов нуклеиновых кислот в клетках, а также
отсутствие адекватных экспериментальных моделей животных. На
сегодняшний день разработаны различные методы количественного
определения 8-oxoG в ДНК, однако экспериментальные трудности,
связанные с измерением, приводят к очень большому разбросу
получаемых величин уровня 8-oxoG в ДНК. Метод
иммунофлуоресцентного анализа позволяет определять
количественное содержание и локализацию 8-oxoG и OGG1, а также отслеживать корреляцию между этими маркерами в различных клетках.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было исследование возрастной динамики маркеров окислительного стресса - 8-оксогуанина (8-oxoG) и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (OGG1) у крыс линии OXYS и контрольной линии Wistar, поиск ранних маркеров окисления ДНК, а также тестирование ряда новых антиоксидантов. В ходе исследования решались следующие задачи:
оптимизация методов иммуносорбентного анализа и иммунофлуоресцентной микроскопии для оценки относительного количества 8-oxoG в геномной ДНК крыс, и для количественного многоцветного совместного определения 8-oxoG и OGG1 методом иммунофлуоресцентной микроскопии;
определение методом иммуносорбентного анализа относительного количества 8-oxoG в ДНК, выделенной из легких и печени крыс линий OXYS и Wistar, в зависимости от возраста животных, а также оценка методом иммунофлуоресцентной микроскопии / относительного количества 8-oxoG в геномной ДНК клеток печени крыс линий OXYS и Wistar различных возрастных групп;
1 /' ' Г
анализ методом многоцветной иммунофлуоресцентной микроскопии содержания 8-oxoG и OGG1 в ядрах нервных клеток различного типа СА-1 и СА-3 области гиппокампа и фронтальной коры левого полушария головного мозга 1- и 3-месячных крыс линий OXYS и Wistar;
исследование антиокислительной активности, мутагенности и генотоксичности трех новых серусодержащих производных 2,6-диметилфенола в бактериальных тест-системах, а также в зародышевых клетках мышей методом учета доминантных летальных мутаций, кроме того, оценка влияния антиоксидантных препаратов на уровень 8-oxoG и OGG1 у экспериментальных крыс линий OXYS и Wistar.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе представлены результаты исследования по изучению возрастной динамики маркеров окислительного стресса 8-оксогуанина и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы у крыс линии OXYS, характеризующейся гиперпродукцией свободных радикалов. Оптимизированы условия для количественного определения 8-oxoG методом иммуносорбентного анализа. Впервые показано повышенное окисление геномной ДНК с образованием 8-oxoG в органах крыс линии OXYS по сравнению с контрольной линией крыс Wistar, при этом в клетках легких 8-oxoG образуется интенсивнее, чем в клетках печени у крыс обеих линий. Оптимизированы условия для количественного анализа методом иммунофлуоресцентной микроскопии 8-oxoG и OGG1 в клетках мозга крыс и определена возрастная динамика содержания этих маркеров в ядрах различных нервных клеток СА-1 и СА-3 области гиппокампа и фронтальной коры левого полушария головного мозга OXYS и Wistar. Выявлено статистически достоверное увеличение количества 8-oxoG в ДНК клеток головного мозга гиппокампа и коры левого полушария у крыс линии OXYS по сравнению с крысами линии Wistar, а также увеличение уровня 8-oxoG в составе ядер нестин- и GFAP-содержащих клеток по сравнению с другими типами клеток головного мозга для крыс трехмесячного возраста обеих линий. Показано увеличение содержания OGG1 в нестин- и GFAP-содержащих клетках по сравнению с другими клетками у 1- и 3-месячных крыс обеих исследуемых линий. Установлено, что три новых производных 2,6-диметилфенола проявляют выраженный антиокислительный эффект и не обладают мутагенностью и генотоксичностью. При этом, 4-(3-додецилтиопропил)-2,6-диметилфенол обладает более выраженными антиокислительными свойствами и способностью увеличивать
выживаемость клеток, лишенных ферментов репарации, а также существенно понижает уровень 8-oxoG в клетках мозга по сравнению с витамином Е. Полученные результаты позволяют использовать метод иммунофлуоресцентного анализа для определения 8-oxoG и OGG1 в других органах и тканях, а также для оценки антиокислительных свойств потенциальных антиоксидантов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы. Результаты работы были представлены на международной конференции «Chemical and biological problems of proteomics» (Новосибирск, 2004), Международной конференции «Химическая биология» (Новосибирск, 2005), Всероссийской конференции «Фундаментальные науки -медицине» (Новосибирск, 2005), Международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Дубна, 2005), SFRR Free Radical Summer School (Спетсес, Греция, 2006), III международной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2007) и др.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 16 таблиц. Библиография включает 299 литературных источников.
