Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов приспособления человека и животных к меняющимся условиям окружающей среды имеет первостепенное значение для современной биологии и медицины. В процессе адаптации организма к воздействию стрессорных факторов важным и необходимым условием является вовлечение генетического аппарата клеток в реакции, направленные на восстановление и поддержание гомеостаза. Это в первую очередь относится к печени. Однако, механизм активации хроматина в печени, связанный с усилением адаптивных биосинтетических и пролиферативных процессов, остается во многом не ясным. Несмотря на большой прогресс в изучении действия адаптивных гормонов, тонкие, интимные механизмы влияния их на геном не ясны. Обнаружены рецепторы стероидных гормонов и различные медиаторы действия пептидных гормонов и катехоламинов ( Sutherland, Rail, 1960; Beato, Feigelson, 1972; Litwack et al., 1973). Показана транслокация гормон-рецепторних комплексов в ядро и их взаимодействие с акцепторными участками хроматина ( Beato et al. , 1973 ). Однако, сама природа этих акцепторных участков, как и механизм дерепрессии определенных генов широко дискутируются.
Особый интерес в этом плане представляет изучение ядерных белков хроматина, и в частности, гистонов. Являясь белками основного характера, гистоны связываются с ДНК, образуя нуклеосо-мы - структурную основу хроматина - и репрессируют считывание матрицы РНК-полимеразой ( Huang, Bonner, 1962 ). Различные химические модификации гистонов, наблюдаемые в активном хроматине, дестабилизируют нуклеосомы и способствуют процессу транскрипции генов.
Особого внимания заслуживает изучение этих процессов в условиях функционального напряжения организма. В этом плане несомненное значение приобретают различные гормональные и метаболические факторы, которые оказывают свое регуляторное воздействие на генетический аппарат клетки, изменяя спектр ядерных белков. При стрессе происходит гормонально-метаболическая перестройка организма, заключающаяся в повышении продукции глюко-кортикоидов и катехоламинов, снижении содержания инсулина При
- 2 -некоторых видах стресса показан сдвиг липопротеидцого спектра плазмы крови в сторону липопротеидов высокой плотности С ЛПВП ) ( Панин Л.Е., 1983 ). При атом в печени запускается синтез ключевых ферментов обмена аминокислот, глюконеогенеза, а также других белков, имеющих адаптивное значение. Липопротеиды высокой плотности,- глюкокортикоиды и катехоламины ( последние играют потенцирующую роль по отношению к первым двум физиологически активным соединениям ) кооперативным образом осуществляют индукцию синтеза глккозо-б-фосфатдегидрогеназы (Панин Л.Е. , "Филатова Т. Г., 1986), фосфознолпируваткарбоксикиназы, липопротеидов низкой и очень низкой плотности и, вероятно, многих других белков. Данный эффект получил свое подтверждение как на переживающих срезах печени, так и в опытах in vivo ( Панин л. Е. , 19S3-, Панин Л. Е., Маянская а, К , 1987;.
Однако, механизм проявления кооперативного эффекта глюко-кортикоидов и ЛПШ на уровне индукции генов не изучен до конца. Не известно, каким образом осуществляется активация хроматина в условиях указанной эндокринно-метаболической перестройки организма, происходящей при стрессе.
Известно, что механизм действия гормонов в. тканях опосредован, как правило, рядом промежуточных мессенджеров, среди которых ведущее место принадлежит циклическим нуклеотидам. Однако, не исключено участие в регуляции и других посредников, модулирующих действие гормонов. К ним следует отнести и липопротеиды крови. В литературе обсуждается также возможность участия лизо-сомального аппарата клетки в механизме действия гормонов (Szego, 1974 ). Важное значение приобретают лизосомы в условиях функционального напряжения организма. В таких случаях лизосомы, кроме выполнения обычной для них функции, связанной с внутриклеточным пищеварением, выступают как модуляторы действия адаптивных гормонов. Однако, эта роль дизосом до сих пор остается мало изученной.
Дедь исследования. Изучить роль глюкокортикоидов и ЛПВП в активации хроматина при стрессе.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. В опытах in vivo на моделях интенсивной физической нагрузки и частичной гепатэктомии исследовать изменения матричной
активности хроматина.
-
Изучить влияние адаптивных гормонов и ЛПВП на матричную активность хроматина в переживающих срезах печени крыс.
-
Оценить вклад различных подклассов ЛПВП (ЛПВІЕ и ЛПВПЗ) в активацию хроматина в условиях, моделирующих зндокринно-метаболические сдвиги при стрессе.
-
Исследовать роль лизосомального аппарата печени в развитии кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП на уровне хроматина.
-
Изучить изменение спектра гистоновых белков хроматина печени крыс при стрессе и в условиях in vitro, моделирующих усиление экспрессии генов.
Научная новизна. Раскрыт механизм кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП на активацию хроматина клеток печени в условиях, моделирующих гормонально-метаболические сдвиги при стрессе.
Показано, что главными составляющими кооперативного эффекта адаптивных гормонов и липопротеидов высокой плотности на хроматин являются гидрокортизон и ЛПВП. Адреналин вносит в этот эффект лишь незначительные изменения. Оба подкласса ЛПВП С ЛПВП2 и ЛПВПЗ ) принимает участие в формировании кооперативного эффекта.
Впервые показано, что механизмы активации хроматина под влиянием одного гидрокортизона и при совместном действии гидрокортизона и ЛПВП отличаются друг от друга. В первом случае наблюдается гораздо меньшая степень его активации, но возрастает сродство зонда акридинового оранжевого к ДНК Во втором случае константа связывания зонда с ДНК не меняется, но значительно возрастает эффективность связывания акридинового оранжевого с хроматином. По-видимому, оба воздействия направлены на разные участки хроматина.
Показано, что уже через 7 минут инкубации переживающих срезов печени с гидрокортизоном и меченными флуоресцеинизотио-цианатом ЛПВП флуоресцентная метка появляется в ядерной фракции. Содержание основного белка ЛПВП апо-А-І в ядре в этих условиях также повышается.
Показана роль лизосомальной системы в реализации коопера-
- 4 -тивного эффекта гидрокортизона и ЛШП на хроматин клеток печени. Увеличение активности некоторых лизосомальных ферментов в ядре является необходимой предпосылкой усиления экспрессии генов. Впервые показано, что при инкубации срезов печени с гидрокортизоном и ЛПШ в присутствии ингибиторов протеиназ, бло-каторов интернализации и внутриклеточного перемещения кооперативный эффект, связанный с активацией хроматина и изменением спектра гистоновых белков, не проявляется.
Впервые выявлено, что общим в активации хроматина при физической нагрузке, частичной гепатзктомии и под влиянием кооперативного действия гидрокортизона и ЛПВП является протеолкз обогащенных лизином гистонов и ацетилирование гистонов, обогащенных аргинином, в частности, Н4.
Впервые показано, что изменения в спектре гистоновых белков хроматина под влиянием одного гидрокортизона и при совместном действии гидрокортизона и ЛПВП имеют как общие, так и различные черты. Общими чертами являются ацетилирование обогащенных аргинином гистонов, и в частности, Н4, а также убикви-тинизация Н2А. Отличие состоит в протеолизе обогащенных лизином гистонов ( HI, Н2А и Н2В ), а именно тех из изоформ, биосинтез которых поддерживается на базальном уровне на протяжении Бсего клеточного цикла, в условиях реализации кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП.
Теоретическое и практическое значение. Работа представляет собой экспериментальное изучение молекулярных механизмов активации хроматина клеток печени .и носит преимущественно теоретический характер. Выяснение регуляторной роли липопротеидов сыворотки крови ( кооперативный эффект липопротеидов и адаптивных гормонов) позволяет глубже понять механизмы активации хроматинь при стрессе, роль различных модификаций гистоновых белков и функцию лизосом в этом процессе.
Положения, выносимые на защиту:
1. Реализация кооперативного эффекта гидрокортизона и ЖВП в печени крыс приводит к активации хроматина, что выражается е общем усилении его матричной активности. Оба подкласса ЖВП С ЖШП2 и ЛПВПЗ ) принимают участие в формировании кооперативного эффекта.
- Б -
-
Механизм активации хроматина под влиянием гидрокортизона и ЛПВП отличается от такового при воздействии одного гидрокортизона. Первый является лизосомозависимым и характеризуется повышением эффективности связывания АО с хроматином, а также резким усилением его матричной активности. Второй характеризуется повышением константы связывания АО с хроматином, но гораздо меньшей степенью его активации.
-
Кооперативный эффект гидрокортизона и ЛПВП на хроматин клеток печени сопровождается протеолиаом обогащенных лизином гистонов ( НІ и Н2В ) и повышением содержания обогащенного аргинином гистона Н4.
-
Выявленные изменения в спектре гистоновых белков являются общими как в условиях активации хроматина in vivo ( при физической нагрузке на фоне введения продигиозана и при час- -тичной гепатэктомии ), так и при кооперативном воздействии гидрокортизона и ЛПВП на хроматин в условиях in vitro.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на V Всесоюзном биохимическом съезде ( Москва, 1986 ), III Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Структура и Функции лизо-сом" ( Тбилиси, 1986 ), X конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных соединений" f Рига, 1939 ), конференциях молодых ученых ( Новосибирск, 1985; 1989 ).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объем работы. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста. Содержит введение, обзор литературы, главы, включающие материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы ( 85 отечественных и 204 иностранных источника ). Работа иллюстрирована 20 таблицами и 6 рисунками.
Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии СО РАМН по теме "Изучить механизмы липопротеидной регуляции внутриклеточного метаболизма при стрессе с целью разработки новых принципов управления и коррекции процессов адаптации и восстановления", N государственной регистрации темы 01.8.90.056645.
