Введение к работе
Актуальность проблемы. Процессы свободнорадикального окисления (СО) биосубстратов протекают в условиях физиологической нормы на стационарном уровне. В то же время чрезмерному образованию свободных радикалов (СР) способствуют многие патологические процессы (Болдырев А.А., 2001). В настоящее время существует концепция о существенной патогенетической роли СР в повреждении клеток головного мозга, обусловленном ишемией. Именно ишемия является наиболее распространенной причиной нарушений функций мозга (Sawhney S.N., 1991), что взаимосвязано с нарушением работы антиоксидантной защиты (АОЗ) организма. Нарушение функционирования системы АОЗ, контролирующей каскад свободнорадикальных реакций, неизбежно отражается на эффективности процессов детоксикации активных форм кислорода (АФК) в клетке и может привести к возникновению окислительного стресса и связанных с ним необратимых изменений в тканях. Если нарушение кровообращения было длительным - больше нескольких минут или часов, то вслед за восстановлением кровотока возникает каскад патологических изменений, лежащих в основе негативных явлений, связанных с реперфузией, которые включают, в частности, постишемическую гиперперфузию, а далее постишемическую гипоперфузию.
Актуальной проблемой является поиск средств, способных повышать резистентность организма к повреждающему действию СР при данной патологии. В медицинской практике при лечении заболеваний различной этиологии, в том числе и патологий головного мозга, когда атиоксидантная система (АОС) организма не справляется с усиленной продукцией АФК, широко используют антиоксиданты природного и синтетического происхождения. Гетероциклические производные гуанидина обладают широким спектром биологической активности (S. Loprasert, 2005). Они проявляют антигипертензивные и кардиопротекторные свойства, являются супрессорами пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и ингибиторами адренорецепторов и натриевых каналов (Беленичев И.Ф., 2010), обладают бактерицидной и фунгицидной активностью, способствуют всасыванию глюкозы в желудочно-кишечном тракте, уменьшают глюконеогенез, снижают уровень холестерина, триглицеридов и инсулина у больных страдающих ожирением (Владимиров Ю.В., 1972). Однако вопрос о возможности применения бигуанидов в области нейропротекции до сих пор остается открытым. Исходя из этого, был проведен поиск бигуанидиновых
производных с целевой биологической активностью с помощью программы
прогноза «структура-свойство» PASS (Prediction of Activity Spectrafor
Substances), доступной в режиме on-line по адресу
(А.В. Садым, 2002; V.V.Poroikov, 2002; С. Szabo,
1997). Компьютерному анализу было подвергнуто несколько сотен веществ с
наиболее высокой вероятностью (>0,7-0,9) проявления той или иной
активности. В результате нами были отобраны бигуаниды: N-[hmhho(4-
морфолинил)метил]гуанидина (ИММГ) и N-[hmhho(1-
пиперидинил)метил]гуанидина (ИПМГ) с предполагаемым спектром интересующей нас биологической активности: данные вещества обладают противоишемическим, кардио-, церебропротекторным эффектами.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование воздействия ИММГ и ИПМГ на свободнорадикальный гомеостаз при ишемии-реперфузии головного мозга (ИРГМ) у крыс. В связи с поставленной целью решались следущие задачи:
Оценка влияния гуанидиновых производных на параметры биохемилюминесценции при ИРГМ у крыс, отражающие интенсивность свободнорадикальных процессов и общий антиоксидантный потенциал.
Исследование действия бигуанидов на содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых коньюгатов (ДК) при ИРГМ у крыс.
Исследование фрагментации ДНК в мозге крыс в норме, при ишемии-реперфузии и при введении ИММГ и ИПМГ.
Изучение влияния производных гуанидина на активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) при ИРГМ у крыс.
Исследование действия гуанидиновых производных на функционирование глутатионовой антиоксидантной системы при ИРГМ у крыс.
Определение кинетических параметров каталитического действия и оценка уровня экспрессии генов глутатионредуктазы (ГР) и глутатионпероксидазы (ГП) в мозге крысы при ИРГМ и действии ИММГ и ИПМГ.
Оценка воздействия бигуанидов на активности НАДФН-генерирующих ферментов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ), при ИРГМ у крыс.
Исследование действия ИММГ и ИПМГ на метаболизм цитрата и активности ферментов, катализирующих его превращения.
9. Создание гипотетической модели участия гуанидиновых производных в регуляции свободнорадикального гомеостаза при ИРГМ у крыс.
Научная новизна. Проведены комплексные исследования воздействия бигуанидиновых производных на интенсивность СО и активность ферментативных и неферментативных компонентов АОС при ИРГМ у крыс. Установлено, что гуанидиновые производные могут проявлять нейропротекторные свойства, они способствуют торможению свободнорадикальных процессов и могут выступать в качестве антиоксидантов, уменьшая нагрузку на АОС организма. Выявлены особенности экспрессии некоторых ферментов АОС при патологии и действии ИММГ и ИПМГ. Впервые установлено, что модификации активностей ГР и ГП при ИРГМ и введении бигуанидов связаны с изменением уровня их экспрессии, а также ряда кинетических параметров каталитического действия. Выявлены оптимальные дозы для действия данных производных гуанидина, обеспечивающие наиболее выраженное изменение параметров, отражающих состояние свободнорадикального гомеостаза, в сторону нормальных значений. Предложена гипотетическая схема влияния производных гуанидина на свободнорадикальный гомеостаз организма на фоне развития ИРГМ.
Практическая значимость. Полученные данные имеют значение с точки зрения выявления молекулярных механизмов патологических нарушений при ИРГМ, а также поиска оптимальных путей их коррекции в медицинской практике. Данные о позитивном воздействии ИММГ и ИПМГ на свободнорадикальный гомеостаз представляют собой основу для практических рекомендаций при проведении клинических испытаний при лечении больных с ишемическими повреждениями головного мозга. Результаты работы углубляют фундаментальные представления о путях реализации протекторного действия веществ, обладающих антирадикальным потенциалом, что создает основы для развития антиоксидантной терапии.
Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы в биологических системах», а также спецкурсов по клинической биохимиии и энзимологии. Кроме того, они используются при проведении практикумов, выполнении курсовых, дипломных работ и магистерских диссертаций студентами Воронежского госуниверситета.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены
на: 1-ой Общероссийской электронной научной конференции «Актуальные
вопросы современной науки и образования» (Красноярск, 2010); 2-ой
Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика»
(Томск, 2010); 4-ой Всероссийской с международным участием научно-
методической конференции «Пути и формы совершенствования
фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных
веществ» (Воронеж, 2010); Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Актуальные проблемы
современной науки и образования» (Уфа, 2010); Конференция «Первые
международные Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010); На 4-ой
Всероссийской научно-практической конференции с международным
участием «Биомедицинская инженерия и биотехнологии» (Курск, 2011); 4-ом
Всероссийском с международным участием Конгрессе студентов и
аспирантов биологов «Симбиоз-Россия» (Воронеж, 2011); Ежегодной
научно- отчетной конференции Воронежского госуниверситета (Воронеж,
2011).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 13 публикациях, в том числе - 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Выявлено протекторное действие гуанидиновых производных (ИММГ
и ИПМГ) при ИРГМ. Введение бигуанидов приводит к улучшению
маркерных показателей при данной патологии и способствует торможению
свободнорадикальных процессов, значительно интенсифицирующихся в
патологическом состоянии.
2. Введение бигуанидов животным с ИРГМ приводит к снижению
степени мобилизации АОС и приближению ряда показателей
антиоксидантной защиты к контрольным значениям.
3. Под воздействием гуанидиновых производных происходит изменение
в сторону нормы активности ряда ферментов окислительного метаболизма,
способных оказывать лимитирующие действие на интенсивность СО.
4. В условиях интенсификации СО при ИРГМ происходит возрастание
уровня транскриптов генов ГР и ГП в мозге животных. Снижение активности
данных ферментов при введении бигуанидиновых производных при
патологии сопряжено с уменьшением степени их экспрессии.
5. На основе полученных данных предложена гипотетическая схема, отражающая участие бигуанидов в регуляции свободнорадикального гомеостза организма при развитии ИРГМ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 глав), списка литературы (228 источников) и приложения. Иллюстрационный материал включает 20 рисунков и 7 таблиц. В приложении содержится 6 рисунков и 2 таблица.
