Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 10
1.1. Коллаген: биохимические и морфо-функциональные особенности 10
1.1.1. Строение и функции коллагена. 10
1.1.2. Метаболизм коллагена и его регуляция . 21
1.2. Механизмы влияния глюкокортикоидов на костную ткань. 32
1.3. Сведения об изменениях костной ткани при сахарном диабете. 41
Глава 2. Материалы и методы исследования. 53
Глава 3. Обмен коллагена костной ткани при воздействии преднизолоном в условиях аллоксанового диабета 60
3.1. Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при введении преднизолона . 60
3.2. Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при аллоксанового диабете 68
3.3. Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при введении преднизолона на фоне аллоксанового диабета . 76
Глава 4. Обмен коллагена костной ткани в условиях гипокортицизма . 85
4.1. Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при введении аминоглютетимида 85
4.2. Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови при введении аминоглютетимида на фоне аллоксанового диабета 93
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 102
Выводы. 121
Литература 122
- Метаболизм коллагена и его регуляция
- Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при введении преднизолона
- Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при введении преднизолона на фоне аллоксанового диабета
- Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при введении аминоглютетимида
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Сахарный диабет (СД) в настоящее время является третьей по распространенности нозологией (М.И. Балаболкин, 2000; М.Г. Давыдович и соавт., 2009) и является глобальной медико-социальной проблемой для здравоохранения всех стран мира и пациентов всех возрастов. В настоящее время в мире насчитывается около 175 млн. больных СД, а к 2025 году, ВОЗ прогнозирует увеличение численности болеющих свыше 300 млн. человек, из которых 80-90 % составят больные СД 2 типа (Е.Б. Кравец, 2005; М.И. Балаболкин, 2007; М.Г. Давыдович и соавт., 2009; E.Adeghate et al., 2006). В развитых странах ВОЗ предсказывает к 2025 году увеличение числа больных СД на 41 % (с 51 до 72 млн. человек) (К.Ф. Вартанян, 1999; А.Н. Шишкин и соавт., 2008).
Большая социальная значимость СД заключается в ранней инвалидизации и летальности в связи с поздними осложнениями. Метаболические нарушения, сосудистые и неврологические осложнения СД приводят к развитию изменений практически всех органов и тканей (М.И. Балаболкин, 2000; М.Г. Давыдович и соавт., 2009). Среди них значительное место занимают поражения костной ткани (С.Н. Ткач и соавт., 1986; Н.В. Савинова, 2004). Потеря минеральных компонентов и изменения костной ткани признаны хроническим осложнением СД (В.Л. Орленко, 2000; Я.В. Гирш, 2003).
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области диагностики, изучения патогенеза СД и его влияния на различные органы и системы организма, многие аспекты этой проблемы остаются недостаточно освещенными, в том числе вопрос о развитии костных изменений при этой патологии. Имеющие данные литературы об особенностях метаболизма костной ткани, частоте и механизмах развития остеопении при СД носят достаточно противоречивый характер (Р.Е. Чечурин, 1999; К.Ф. Вартанян, 2003).
Поражение костной системы при СД является одним из малоизученных и малоосвещенных в литературе разделов клинической диабетологии (В.Л. Орленко, 2000). Анализ литературы позволяет заметить, что единого мнения по вопросу о частоте поражения костной системы не существует. По данным различных авторов, патологические изменения костной ткани при диабете встречаются от 0,1 % до 77,8 % наблюдений. Опасность развития малообратимых изменений костной ткани и их значительная роль в снижении качества жизни больных СД определяют необходимость дальнейшего изучения механизмов развития диабетической остеопатии.
В патогенезе изменений костной ткани при СД, помимо инсулиновой недостаточности, важную роль играет избыток глюкокортикоидов (ГК) в организме (С.Н. Ткач и соавт., 1986), способный вызывать нарушение минерального обмена, что приводит к развитию остеопороза (Е.Л. Насонов, 1999). В целом сведения об этом влиянии ГК противоречивы и не поддаются однозначной трактовке (З.А. Бурнашова, 2000).
Основным условием динамической устойчивости костной ткани является функциональное состояние белкового компонента кости и, прежде всего, коллагена (П.А. Ревелл 1993, Н.В. Корнилов и соавт., 2000). В связи с этим возникает интерес к вопросу о состоянии обмена костного коллагена в условиях диабета и гиперкортицизма.
Определить особенности обмена коллагена в костной ткани и продуктов его метаболизма в плазме крови крыс при аллоксановом диабете, экзогенном гиперкортицизме, их сочетании, а также в условиях дефицита кортикостероидных гормонов.
-
Изучить изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и плазме крови крыс в динамике аллоксанового диабета.
-
Исследовать показатели обмена коллагена в костной ткани и плазме крови крыс при введении высоких доз преднизолона.
-
Изучить изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и плазме крови крыс при сочетании аллоксанового диабета с введением высоких доз преднизолона.
-
Выявить особенности обмена коллагена и его метаболитов в костной ткани и плазме крови крыс при аллоксановом диабете в условиях дефицита кортикостероидных гормонов.
В работе впервые выявлено, что экзогенный гиперкортицизм вызывает в начальные сроки воздействия усиление, как процессов синтеза, так и распада коллагена костной ткани. Преобладание катаболизма приводит к снижению содержания суммарного коллагена. Невысокая активность анаболических процессов во второй декаде опыта сопровождается низким содержанием нерастворимого и суммарного коллагенов в губчатой костной ткани.
Впервые получены данные об особенностях обмена коллагена в диафизе бедренной кости и теле 2-го поясничного позвонка в динамике экзогенного гиперкортицизма, аллоксанового диабета и их сочетании. Показано, что в обмене коллагена костной ткани при аллоксановом диабете в первые 30 дней эксперимента превалировали процессы катаболизма на фоне стойкого угнетения процессов его синтеза.
Показано, что при аллоксановом диабете, протекающем на фоне введения преднизолона, в первые дни опыта наблюдалось одновременное угнетение процессов синтеза и распада. В последующие сроки эксперимента рассогласованность анаболических и катаболических реакций в костной ткани вызвали неодинаковые изменения: в компактной кости – усиление катаболизма, а в губчатой – угнетение и синтеза, и распада коллагена.
Обнаружено, что угнетение стероидогенеза при аллоксановом диабете вызывает снижение интенсивности катаболизма коллагена костной ткани и преобладание его синтеза, что приводит к увеличению содержания суммарного коллагена в компактной и губчатой костной ткани.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Полученные в ходе эксперимента данные расширяют имеющиеся представления об особенностях обмена коллагена костной ткани при экзогенном гиперкортицизме, аллоксановом диабете, их сочетании, а также дополняют имеющиеся в литературе сведения, касающиеся важной роли глюкокортикоидов в регуляции обмена коллагена костной ткани при диабете.
Результаты исследований могут быть использованы в изучении патогенеза остеопатий у больных СД.
Примененные биохимические методы определения уровня метаболитов коллагена в крови могут быть использованы, в комплексе с другими методами, для оценки состояния обмена коллагена костной ткани у больных СД.
Метаболизм коллагена и его регуляция
Биосинтез коллагена протекает преимущественно в клетках фибробластического ряда и представляет собой частный случай процесса биосинтеза белков, поэтому полностью подчиняется всем общим закономерностям этого процесса (Л.И. Слуцкий, 1969).
Экспрессия коллагена достаточно хорошо изучена. Ген цепи коллагена состоит из 18000-40000 пар нуклеотидов. Гены коллагена имеют большое количество интронов: последовательность, кодирующая aj - цепи коллагена I типа содержит 51 интрон. Другим характерным признаком является наличие экзонов, многие из которых состоят из 54 и 108 пар нуклеотидов, и в положении 6 и 13 содержат триплеты, кодирующие последовательности Гли-Х-Y. Из синтезированного в ядре первичного транскрипта такого гена образуется проколлагеновая м-РНК размером около 6000 нуклеотидов (Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Е.Г. Бутолин и соавт., 2005; E.Vuorio et аі, 1990; Е. Ekholm, 2001).
Полипептидные цепи коллагена синтезируются на полирибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, в виде более длинных, чем зрелые цепи предшественников - препро-а-цепей. У этих предшественников имеется гидрофобный «сигнальный» пептид на N-конце, содержащий около 100 аминокислот. Основная функция сигнального пептида-ориентация синтеза пептидных цепей в полость эндоплазматического ретикулума. После выполнения этой функции сигнальный пептид сразу же отщепляется (В. Родуэлл и соавт., 1993; Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Е.С Северин, 2003; И.Г. Щербак, 2005). Синтезированная молекула проколлагена содержит дополнительные участки - N- и С-концевые пропептиды, имеющие около 100 22 250 аминокислот, соответственно. С-концевые пропептиды есть в предшественниках только фибриллярных коллагенов (I, II, III, V, и XI) и всегда содержат по 7-8 радикалов цистеина. Дисульфидные мостики, возникающие между С-концевыми пропептидами всех трех про-а-цепей, облегчают «правильное» формирование трехцепочечной суперспирали, так как способствуют установке субъединиц в положение, благоприятное для сплетения их в единый «жгут». Концевые пропептиды не образуют тройную спираль, а формируют глобулярные домены (В. Родуэлл и соавт., 1993; Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Е.С Северин, 2003; И.Г. Щербак, 2005). Синтезируемые исходно предшественники не содержат ни гидроксипролина, ни гидроксилизина. Гидроксилирование пролина и лизина начинается в период трансляции коллагеновой мРНК на рибосомах и продолжается на растущей полипептидной цепи вплоть до её отделения от рибосом. Происходит эта модификация под действием монооксигеназ, сопряженных с окислением а-кетокислот. Пролиловые и лизиловые остатки в Y-положении пептида (Гли-Х-Y)n подвергаются действию, соответственно, пролил-4-гидроксилазы и лизил-5-гидроксилазы. Лизил-гидроксилаза окисляет определенные лизильные радикалы в положении 5. Пролил-4-гидроксилаза воздействует на остатки пролина, но только из числа тех, что соединены с соседним глицином своей карбоксильной группой (то есть находятся в положении X коллагеновой триады). Существует еще пролил-3-гидроксилаза, внедряющая кислород в положение 3 пролина, если он своей аминогруппой связан с глицином, а карбоксильной - с образовавшимся ранее 4-гидроксипролином. Гидроксилирование пролина необходимо для стабилизации тройной спирали коллагена, так как ОН-группы гидроксипролина участвуют в образовании водородных связей. Гидроксилирование лизина очень важно для последующего образования ковалентных связей между молекулами коллагена при сборке коллагеновых фибрилл (В. Родуэлл и соавт., 1993; Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Е.С Северин, 2003; И.Г. Щербак, 2005; Е.Г. Бутолин и соавт., 2005). Необходимыми компонентами данной реакции является а-кетоглутарат, 02 и аскорбиновая кислота. Гидроксилазы пролина и лизина содержат в активном центре атом железа Fe +, а для поддержания его в восстановленном состоянии нуждаются в аскорбиновой кислоте. Установлено, что аскорбат, помимо этого, еще и стимулирует биосинтез пролил-гидроксилаз в клетках, усиливая экспрессию соответствующего гена (А. М. Хилькин и соавт., 1976; В. Родуэлл и соавт., 1993; Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Е.С Северин, 2003; И.Г. Щербак, 2005).
Другая реакция постсинтетической модификации коллагена - N-гликозилирование единичных радикалов аспарагина под действием соответствующих гликозилтрансфераз. Обычно а-цепь содержит 1-2 олигосахаридных фрагмента. В коллагенах типа I и III возможно также О-гликозилирование гидроксилизина. При этом в костной ткани к нему присоединяются обычно галактоза, а в коллагене дермы - а-глюкозидо-( 1,2)-галактоза. После образования тройной спирали процессы гидроксилирования и гликозилирования прекращаются (В. Родуэлл и соавт., 1993; Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Е.С Северин, 2003; И.Г. Щербак, 2005). Каждая про-а-цепь соединяется водородными связями с двумя другими про-а-цепями, образуя тройную спираль проколлагена. Эти процессы происходят еще в просвете эндоплазматического ретикулума и начинаются после образования межцепочечных дисульфидных мостиков в области С-концевых пропептидов. Суперспирализация охватывает только центральную часть молекулы проколлагена. Из эндоплазматического ретикулума молекулы проколлагена перемещаются в аппарат Гольджи, включаются в секреторные пузырьки и секретируются в межклеточное пространство (В. Родуэлл и соавт., 1993; Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Дж.М. Фаллер и соавт., 2003; Е.С Северин, 2003; И.Г. Щербак, 2005).
Внеклеточный этап биогенеза коллагена протекает в 4 последовательные реакции, из них только превая и третья являются ферментативными (И.Г. Щербак, 2005). 1-ая стадия — отщепление N- и С-терминальных пропептидов интерстициальных фибриллярных коллагенов типа I, II, III, V и XI с помощью внеклеточных амино- и карбоксипептидаз. В результате образуется тропоколлаген, молекулы которого способны к самоорганизации в надмолекулярные волокнистые структуры. На концах сохраняются, как правило, неспирализованные телопептиды, содержащие от 9 до 35 аминокислотных остатков у фибриллярных коллагенов. У минорных коллагенов, типа V, XI, телопептиды бывают на порядок крупнее (В. Родуэлл и соавт., 1993; Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Дж.М. Фаллер и соавт., 2003; Е.С Северин, 2003; И.Г. Щербак, 2005; Н.М. Kagan, 2000). 2-ая стадия - самосборка коллагеновых волокон, не требующая участия ферментов. Начинается она с формирования коллагеновой микрофибриллы: десятки молекул тропоколлагена уложены в одну линию по типу «голова к хвосту»: начало каждой из них направлено к С-концу предшествующей. В местах сближения эти суперспирали никак не связаны между собой, а между ними имеется промежуток 35-40 нм. Поддерживается такое расположение молекул тропоколлагена слабыми взаимодействиями «бок о бок» со смежными укладками, но сдвинутыми почти на четверть длины каждой молекулы (В. Родуэлл и соавт., 1993; Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Дж.М. Фаллер и соавт., 2003; Е.С Северин, 2003; И.Г. Щербак, 2005). Регулярность смещения обусловлена тем, что места сосредоточения заряженных радикалов аминокислот вдоль тройной суперспирали чередуются с участками скопления незаряженных радикалов. Периодичность чередования составляет примерно 67 нм (отсюда -упомянутое расстояние в 35 нм между концами молекул: 67x5=335, а реальная длина тропоколлагена фибриллярного, типа составляет 300 нм) (Б.Л. Риггз и соавт., 2000; И.Г. Щербак, 2005; J.E. Scott, 1995). Свободные промежутки в 35 нм часто называют просветами («зазорами»). В костной ткани и дентине здесь формируются центры кристаллизации фосфорно-кальциевых солей (Б.Л. Риггз и соавт., 2000; Е.С Северин, 2003; И.Г. Щербак, 2005).
Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при введении преднизолона
Надпочечниковый индекс значимо изменялся лишь на 15 день исследования, когда возрастал до 20,93 мг/ЮОг (р=0,014) и на 28,53 % превышал контрольные значения (16,28+0,76 мг/100г).
Концентрация глюкозы в плазме крови экспериментальных животных была повышена в течение 30 дней опыта и достигала максимума на 5 день наблюдения (7,7+0,50 ммоль/л; р=О,004). В последующие дни уровень гликемии медленно снижался, оставаясь при этом выше контрольных значений. На 45 день эксперимента зафиксировано снижение содержания глюкозы в крови до 5,42+0,23 ммоль/л, что на 11,21 % (р=0,022) меньше значений интактных животных. Уровень гликированного гемоглобина значимо не менялся на протяжении всего опыта (рис. 3.1).
Изменения концентрации общего кальция в плазме крови отмечались на 5, 15 и 45 дни наблюдения, когда исследуемый показатель снижался на 19,84 % (р=0,003), 11,27 % (р=0,04) и 8,08 % (р=0,023) соответственно (табл. 3.1). В остальные дни содержание общего кальция не отличалось от .контрольных значений (2,45±0,08 ммоль/л). Активность щелочной фосфатазы значимо повышалась на 5 и 30 дни наблюдения соответственно на 66,45 % (р=0,03) и 72,80 % (р=0,04).
Содержание свободного гидроксипролина в плазме крови опытных животных достоверно изменялось лишь на 5 и 20 дни эксперимента, когда его концентрация возрастала до 23,78±1,21 мкмоль/л (+39,96 %; р=0,0002) и 28,34±3,88 мкмоль/л (+66,83 %; р=0,01) соответственно (табл. 3.1). Пептидносвязанный гидроксипролин повышался на 5 день наблюдения на 68,09 % (р=0,048), затем снижался к 15 дню до 4,13+1,06 мкмоль/л (-74,36 %; р=5 10" 6) против 16,09+1,37 мкмоль/л в контроле, а с 20 дня наблюдения значимо не изменялся. (р=0,0002) соответственно, хотя и была повышена в течение всего эксперимента.
Содержание кальция в диафизе бедренной кости последовательно снижалось на 5, 15 и 20 дни опыта, достигая минимальных значений на 20 день - 6,55±0,01 моль/кг (-6,27 %; р=1,36 10"9) против 6,99±0,02 моль/кг в контроле. На 30 день наблюдения показатель превышал контрольные значения на 9,19 % (р= 1,5 10"12), затем, к 45 дню вновь снижался до 6,70±0,01 моль/кг (р=10-7), что на 4,15 % меньше аналогичного показателя интактных крыс. Содержание кальция в ткани позвонка, было значимо снижено в течение всего срока наблюдения, наиболее выраженные изменения показателя определялись на 5 и 20 день: 5,13±0,009 моль/кг (р=10 19) и 5,32±0,008 моль/кг (р=2,9 10"17) соответственно против 5,77±0,009 моль/кг в контроле.
В табл. 3.2 представлена динамика изменения показателей обмена коллагена в костной ткани крыс при введении преднизолона. Содержание суммарного коллагена в диафизе бедренной кости резко снижалось на 5 день опыта с 187,32±4,03 до. 138,26±6,57 ммоль/кг (-26,18 %; р=10"6). Уровень суммарного коллагена в теле второго поясничного позвонка был снижен относительно контрольных значений с 5 по 20 дни эксперимента. При этом минимальное значение отмечалось на 5 день - 136,92±6,30 ммоль/кг (-30,57 %; р=2,5 10"9), на 15 и 20 дни наблюдения снижение исследуемого показателя составило соответственно 25,15 % (р=7,6 10" ) и 9,29 % (р=0,044). В этот же период уровень СК в теле позвонка отрицательно коррелировал с концентрацией 11-ОКС в плазме крови экспериментальных животных (г=-0,71; р 0,01).
Динамика содержания нейтральносолерастворимого коллагена в диафизе бедренной кости носила фазный характер: увеличение его на 5 день с 10,54±0,41 до 17,51±0,95 ммоль/кг (р=6 10 б) сменилось снижением на 15 и 20 дни наблюдения на 20,39 % (р=0,027) и 52,96 % (р=2,1 10 8) соответственно, а с 30 дня не отличалось от контроля. В теле поясничного позвонка динамика содержания данного показателя до 20 дня носила аналогичный характер (табл. 3.2, рис. 3.2), а на 30 день отмечалось значительное увеличение содержания исследуемой фракции коллагена на 83,34 % (22,31±1,79 ммоль/кг; р=0,0002). На 45 день опыта содержание неитральносолерастворимого коллагена не отличалось от контрольных значений.
Изменения в содержании цитратрастворимого коллагена в диафизе бедренной кости отмечались лишь на 20 и 30 день эксперимента, когда было отмечено снижение его относительно контроля (4,23±0,45 ммоль/кг) на 86,48 % (р=1,9 10") и 41,96 % (р=0,003) соответственно. В теле 2-го поясничного позвонка уровень данного показателя изменялся волнообразно: повышение на 5 день наблюдения (+23,82 %; р=0,026) сменилось выраженным снижением к 20 дню на 79,36 % (1,03±0,06 ммоль/кг; р=7,7 10"9). К 30 дню уровень исследуемой фракции на 73,38 % (р=6,1 10) превышал показатели интактных крыс, а на 45 день снижался до 2,61 ±0,3 ммоль/кг (-47,64 %; р=0,0001) против 4,99±0,39 ммоль/кг в контроле (табл. 3.2, рис. 3.2).
В диафизе бедренной кости крыс в опыте с введением преднизолона потеря нерастворимой фракции коллагена составила на 5 день наблюдения 30,41 % (121,81±6,29 ммоль/кг; р=2,2 10 5 против 175,05±6,16 в контроле). В остальные дни наблюдения уровень исследуемой фракции в бедренной кости значимо не отличался от показателей интактных животных. В теле позвонка содержание нерастворимого коллагена было снижено во все дни опыта, кроме 20 дня. При этом наименьший уровень НК отмечался на 5 день исследования -113,35±6,30 ммоль/кг (р=2,6 10"7), что на 37,83 % ниже контроля. На 15, 30 и 45 дни исследования потери нерастворимого коллагена относительно значений интактных крыс составили 28,12 % (р=Ю"6), 13,99 % (р=0,026) и 19,61 % (р=0,002) соответственно (табл. 3.2, рис. 3.2).
Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при введении преднизолона на фоне аллоксанового диабета
Активность общей щелочной фосфатазы плазмы крови была снижена на 5 и 15 день сочетанного воздействия на 19,26 % (р=0,049) и 31,04 % (р=0,011) соответственно, возрастала на 30 день на 50,86 % (р=1,4 10-5) и не отличалась от контрольных цифр на 20 и 45 дни.
Коллагенолитическая активность в плазме крови крыс при введении преднизолона на фоне аллоксанового диабета на 5, 15 и 20 дни была повышена, достигая максимума на 15 день - 0,26±0,04 мкмоль/г/ч (р-0,0002), против 0,067±0,01 мкмоль/г/ч в контроле. На 30 день исследования КА составляла 0,031±0,003 мкмоль/г/ч (р=0,003), снижаясь вдвое относительно показателей контроля. На 45 день значимых изменений КА в плазме крови не выявлено (табл. 3.5).
Содержание свободного гидроксипролина в плазме крови экспериментальных животных на 20 и 30 дни исследования возрастало соответственно до 55,39±4,24 мкмоль/л (р=5,1 10"8) и 30,94±3,40 мкмоль/л (р=0,008) против 16,99±0,74 мкмоль/л в контроле. В остальные дни опыта достоверных изменений в концентрации СО не определялось. Уровень пептидносвязанного гидроксипролина в плазме на 5, 15 и 20 дни опыта достоверно превышал контрольные показатели соответственно на 65,79 % (р=0,011), 125,54 % (р=10"8) и 58,77 % (р=0,036), затем снижался и до 45 дня исследования не отличался от контроля.
Содержание кальция в диафизе бедренной кости на 20, 30 и 45 дни снижалось относительно контроля и составляло соответственно 6,7±0,05 (р=5,8 10 5), 6,72±0,07 (р=0,002) и 6,67±0,05 (р=0,005) моль/кг. Содержание кальция в ткани позвонка было снижено на 5 и 20 дни эксперимента на 2,44 % и 3,40 % (р=0,002) соответственно против контроля (5,77±0,01 моль/кг).
В табл. 3.6 представлены показатели обмена коллагена в костной ткани крыс при введении преднизолона на фоне аллоксанового диабета. В диафизе бедренной кости содержание суммарного коллагена было снижено к 15, 30 и 45 дням с 187,32±4,03 до 148,43±4,62 (р=2 10"6), 170,53±4,35 (р=0,011) и ,22±4,03 ммоль/кг (р=6,3 10 ) соответственно. Уровень суммарного коллагена в теле поясничного позвонка на 20 и 30 дни исследования возрастал на 18,37 % (р=0,002) и 12,01 % (р=0,011) соответственно, в остальные дни эксперимента достоверных отличий от контроля не выявлено.
Изменения концентрации нейтральносолерастворимого коллагена в бедренной кости (табл. 3.6, рис. 3.6) носили фазный характер: к 5 дню исследования НРК снижался с 13,23±0,85 до 9,08±0,85 ммоль/кг (р=0,004), к 15 дню превышал контроль на 23,60 % (р=0,027), на 20 день вновь снижался, на 17,4 % (р=0,049), а к 30 дню содержание его достигло 17,24±0,86 ммоль/кг, что на 30,30 % выше контрольных значений (р=0,007). Для сравнения, в опыте с «изолированным» введением преднизолона динамика изменений НРК носила противоположный характер: отмечался рост показателя на 5 день и снижение его на 15 и 20 дни опыта. При «чистом» же диабете содержание данной фракции в диафизе бедренной кости было снижено в течение 30 дней после введения аллоксана, а затем возрастало на 45 день. В ткани позвонка уровень НРК снижался к 5 дню вдвое (-49,42 %; р=4 10 ) по сравнению с контролем (11,50±0,45 ммоль/кг), к 15 дню он достигал 19,21±0,51 ммоль/кг (р=2,3 10 10), затем вновь падал - к 45 дню на 25,38 % (р=0,0011) был ниже аналогичного показателя контрольных крыс. В опыте с «чистым» введением преднизолона в отличие от сочетанного воздействия изучаемая фракция была повышена на 5 и 30 дни исследования и существенно снижена на 15 и 20 дни. При «изолированном» диабете показатель был снижен на 5, 20 и 30 дни и повышен на 45 день опыта. Изменения в содержании цитратрастворимого коллагена в диафизе бедренной кости были выражены незначительно, лишь на 45 день отмечено снижение ЦРК на 26,27 % (р=0,015) от контроля (5,16±0,36 ммоль/кг), в то время как при «изолированном» введении преднизолона изучаемая фракция существенно снижалась на 20 и 30 дни опыта, а при «чистом» диабете была меньше значений контроля на 5, 20 и 30 дни. ЦРК в позвонке при сочетанном воздействии изменялся волнообразно, однонаправлено с нейтральносолерастворимым коллагеном (табл. 3.6, рис. 3.6). Так, снижение содержания цитратрастворимой фракции на 5 день на 37,79 % (р=0,0011) сменилось ее значительным увеличением к 15 дню с 4,79±0,73 до 6,24±0,33 ммоль/кг (р=0,002). На 20 и 30 дни уровень ЦРК не отличался, а затем вновь снизился на 45 день на 47,45 % (р=4 10 6). В отличие от сочетанного воздействия на фоне «чистого» введения преднизолона содержание изучаемой фракции было выше контрольных значений на 5 и 30 дни, а на 20 и 45 дни оно существенно снижалось. После «изолированного» введения аллоксана ЦРК в теле позвонка был меньше контроля на 5, 20 и 30 дни диабета. В диафизе бедренной кости содержание нерастворимого коллагена было снижено во все сроки наблюдения, при этом минимальное значение определялось на 45 день - 11б,03±6,26 ммоль/кг (р=5 10 6) против 175,07±6,16 в контроле. В то время как в опыте с «изолированным» введением преднизолона, снижение уровня НК отмечалось лишь на 5 день исследования, а при «чистом» диабете данный показатель был снижен на 20 и, наоборот, повышен на 30 дни после введения аллоксана. В позвонке нерастворимый коллаген на 15 день сочетанного воздействия был на 9,93 % (р=0,019) ниже данного показателя контрольных животных (187,29±5,19 ммоль/кг), а на 20 день, наоборот, повышен на 19,57 % (р=0,017). При «чистом» введении преднизолона НК в гомогенате тела позвонка снижался на 5, 15, 30 и 45 дни, а при «изолированном» диабете - на 5, 20 и 45 дни исследования. Коллагенолитическая активность в диафизе бедренной кости значительно возрастала на 5 и 15 дни сочетанного эксперимента соответственно на 102,63 % (р=10"6) и 280,82 % (р=0,0012) относительно контрольных цифр и достоверно не отличалась в остальные дни наблюдения. Значимые изменения КА в теле 2-го поясничного позвонка выявлялись лишь на 30 и 45 дни сочетанного введения преднизолона с аллоксановым диабетом, когда их активность снижалась соответственно на 62,71 % (р=0,004) и 64,75 % (р=0,001).
Изменение показателей обмена коллагена в костной ткани и крови крыс при введении аминоглютетимида
Количество кальция в диафизе бедренной кости на протяжении опыта значимо не изменялось. Уровень кальция в позвонке снижался к 5 дню с 5,77±0,01 до 5,44±0,09 моль/кг (р=0,001), а на 20 и 45 дни был меньше показателей контрольной группы животных соответственно на 3,52 % (р=0,016) и6,56%(р=3 10-6).
В табл. 4.4 представлены сведения об обмене метаболитов коллагена в диафизе бедренной кости и теле 2-го поясничного позвонка при введении аминоглютетимида на фоне аллоксанового диабета. В ткани диафиза содержание суммарного коллагена на 15 и 45 дни опыта возрастало с 187,32±4,03 до 219,75±4,57 и 214,04±8, 95 ммоль/кг, что на 17,31 % (р=2 10-5) и 14,27 % (р=0,049) соответственно больше контроля. В гомогенате ткани тела позвонка уровень СК на 5 день на 32,35 % (р=6,7 10"п) превышал данные интактных крыс. В дальнейшем, на 15, 20 и 30 дни исследования изучаемый показатель оставался повышенным на 17,92 % (р=0,004), 13,03 % (р=0,04) и 14,25 % (р=0,02) соответственно. На 45 день статистически значимых отличий в содержании суммарного коллагена в исследуемой ткани не определялось.
Нейтральносолерастворимая фракция коллагена в диафизе бедренной кости на 15, 20 и 45 дни сочетанного воздействия возрастала с 13,23±0,85 до 16,91±0,9б (р=0,011), 16,31±0,95 (р=0,03) и 16,34±0,84 ммоль/кг (р=0,049) соответственно. В остальные дни значимых отличий от контроля не выявлено. Для сравнения, в опыте с «изолированным» введением аминоглютетимида НРК был снижен на 15 и повышен на 20 дни исследования, а при «чистом» диабете уровень нейтральносолерастворимой фракции был снижен в первые 30 дней, затем значимо повышался к концу эксперимента. Содержание НРК в теле позвонка носило фазный характер: на 15 и 20 день количество нейтрал ьносолерастворимого коллагена возрастало с 11,50±0,45 до 15,43±0,7б ммоль/кг и 15,74±1,28 ммоль/кг, что на 34,15 % (р=0,0012) и 36,89 % (р=0,02) превышало данные интактных животных. На 30 день НРК был ниже контроля на 29,05 % (р=0,001), а на 45 день его содержание вновь возросло до 19,79±1,48 ммоль/кг (+72,19 %; р=0,002). При «изолированном» введении аминоглютетимида уровень НРК был повышен на 5 и 20 дни и снижен на 15 день, а при «чистом» диабете содержание анализируемой фракции снижалось на 5, 20 и 30 дни, тогда как на 45 день исследования превышало контрольные значения.
Количество цитратрастворимого коллагена значимо изменялось в ткани бедренной кости лишь на 15 день опыта, в это время уровень его снижался до 3,24±0,39 ммоль/кг, что на 37,17 % (р=0,04) меньше соответствующих показателей контрольных животных. При «чистом» введении аминоглютетимида уровень ЦРК также снижался на 15 день исследования, а затем возрастал на 20 день. При «изолированном» аллоксановом диабете показатель был снижен на 5, 20 и 30 дни воздействия. В гомогенате ткани позвонка содержание цитратрастворимой фракции снижалось на 5 и 30 дни сочетанного воздействия соответственно на 48,49 % (р=0,0011) и 31,82 % (р=0,007) в сравнении с контрольными данными (4,79±0,23 ммоль/кг). В остальные дни опыта значимых изменений показателя не выявлялось. При «чистом» аллоксановом диабете ЦРК снижался относительно контроля на 5, 20 и 30 дни. В опыте с «изолированным» введением аминоглютетимида уровень ЦРК изменялся фазно: был снижен на 15 и 45 дни и повышен на 20 день исследования.
Содержание нерастворимого коллагена в образцах компактной костной ткани возрастало на 15 и 45 дни опыта на 19,50 % (р=0,001) и 15,18 % (р=0,018) относительно контроля (169,24±4,40 ммоль/кг).и не отличалось от последнего в остальные дни исследования. При «чистом» же введении аминоглютетимида уровень НК в диафизе бедренной кости был существенно снижен на 5 день исследования, затем с 10 по 30 день не отличался от контрольных значений, а на 45 день значимо превышал последние. А в опыте с «изолированным» аллоксановым диабетом отмечалось снижение НК на 20 день наблюдения, сменившееся его увеличением относительно контроля на 30 день. В позвонке НК был увеличен на 5, 15 и 30 дни опыта, при этом максимальные значения отмечались на 5 день сочетанного воздействия, когда содержание нерастворимого коллагена выросло с 187,29±5,19 ммоль/кг до 254,22±9,45 ммоль/кг (35,73 %; р=2 10"6). В отличие от сочетанного воздействия при «изолированном» введении аминоглютетимида содержание нерастворимой фракции в гомогенате тела поясничного позвонка возрастало на 30 и 45 дни наблюдения, в то время как «чистый» аллоксановый диабет сопровождался снижением показателя на 5, 20 и 45 дни.
Активность коллагенолитичесих ферментов в диафизе бедренной кости (табл. 4.4) повышалась на 15 и 20 дни опыта, соответственно на 237,24 % (р=0,005) и 88,57 % (р=0,026) в сравнении с контролем (0,87±0,09 мкмоль/г/ч). На 30 день КА снизилась до 0,33±0,10 мкмоль/г/ч (-62,37 %; р=0,002), а на 45 день не отличалась от данных интактных животных. В ткани позвонка динамика изменения коллагенолитической активности носила противоположный характер: отмечалось значительное снижение КА соответственно на 15 и 20 дни эксперимента на 58,47 % (р=0,023) и 48,47 % (р=0,01), на 30 день отличий от контроля не выявлено, а на 45 день активность изучаемых ферментов возрастала до 2,31±0,16 мкмоль/г/ч и на 84,75 % (р=0,001) превышала аналогичные показатели интактных животных. Уровень свободного гидроксипролина в компактной костной ткани достоверно изменялся лишь на 30 день сочетанного воздействия, тогда его содержание снижалось с 0,86±0,05 до 0,60±0,08 ммоль/кг (р=0,048). При «чистом» же введении аминоглютетимида СО был повышен на 5, 15 и 20 дни исследования. При «изолированном» аллоксановом диабете содержание СО в диафизе бедренной кости повышалось на 15 и 20 дни, а затем снижалось к 45 дню исследования.
