Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Этиология и патогенез сахарного диабета и диабетической полинейроптии 11
1.2. Состояние энергетического обмена при сахарном диабете .18
1.3. Нарушение обмена веществ у больных сахарным диабетом.22
1.4. Механизмы образования свободных радикалов в организме 27
1.5. Окислительные процессы, связанные с образованием свободных радикалов при сахарном диабете 32
1.6. Система антиоксидантной защиты организма .40
1.6.1. Ферментативное звено антиоксидантной системы 41
1.6.2. Неферментативное звено антиоксидантной системы 46
ГЛАВА 2. Объект и методы исследований
2.1. Объект исследования 51
2.2. Характеристика групп больных .51
2.3. Приготовление проб для исследвания 53
2.4. Методы исследований .54
2.4.1. Продукты перекисного окисления липидов:
2.4.1.1. Определение содержания малонового диальдегида и гидроперекисей 54
2.4.1.2. Определение количества диеновых конъюгатов в эритроцитах 55
2.4.1.3. Определение ТБК - активных продуктов в сыворотке крови 55
2.4.2. Показатели энергетического обмена:
2.4.2.1. Определение содержания аденозинтрифосфата крови 56
2.4.2.2. Определение концентрации лактата в плазме крови .56
2.4.2.3. Определение концентрации глюкозы крови 56
2.4.2.4. Определение концентрации гликозилированного гемоглобина 56
2.4.2.5. Определение степени утилизации глюкозы эритроцитами крови .57
2.4.2.6. Определение липидного фосфора в сыворотке крови58
2.4.3. Антиоксидантная система защиты:
2.4.3.1. Определение уровня общей антиоксидантной защиты организма 58
2.4.3.2. Определение количества восстановленного глутатиона 59
2.4.3.3. Определение активности глутатионпероксидазы .60
2.4.3.4. Определение активности супероксиддисмутазы 60
2.4.3.5. Определение активности каталазы .60 2.4.4. Показатели липидного спектра крови:
2.4.4.1. Определение содержания холестерина в сыворотке крови 61
2.4.4.2. Определение содержания триацилглицеридов в сыворотке крови 61
2.4.4.3. Определение содержания липопротеинов высокой плотности 62
2.4.4.4. Определение содержания липопротеинов низкой плотности и липопротеинов очень низкой плотности 62
2.4.4.5. Расчет коэффициента атерогенности крови .62
2.5. Статистическая обработка результатов 63
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Оценка интенсивности процессов перекисного окисления липидов у больных сахарным диабетом64
3.2. Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах и общий антиоксидантный статус сыворотки крови больных сахарным диабетом 72
3.3. Дислипидемия и состояние энергетического обмена у больных сахарным диабетом 80
ГЛАВА 4. Заключение .96
Выводы 106
Практические рекомендации .108
Список сокращений .109
Список литературы 110
- Нарушение обмена веществ у больных сахарным диабетом
- Неферментативное звено антиоксидантной системы
- Определение липидного фосфора в сыворотке крови
- Оценка интенсивности процессов перекисного окисления липидов у больных сахарным диабетом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболеваемость сахарным диабетом (СД) вследствие высокой распространённости, ранней инвалидизации и уменьшения продолжительности жизни больных является одной из важнейших медико-социальных проблем. Основной причиной повышенной смертности населения являются сосудистые осложнения СД, в том числе диабетическая по-линейропатия (ДПН).
Молекулярные механизмы, определяющие взаимосвязь между нарушением гомеостаза глюкозы и развитием диабетических ангиопатий, окончательно не ясны. Многочисленные исследования в этой области свидетельствуют о том, что повреждающее действие гипергликемии на сосудистую стенку опосредуется свободными радикалами. При этом установлено, что в механизмах повышения окислительного стресса (ОС) при диабете участвует не только гипергликемия, но и гипоинсулинемия [М.И.Балаболкин. 2000; A.Ceriello, 2000; A.Majchrzak, 2001; Ф.А.Гершкорон, 2005; К.В.Антонова, 2008 S 2013].
Последствия окислительного стресса нейтрализуется системой антиокси-дантной защиты. Нарушение функционирования данной системы может играть важную роль в патогенезе СД первого (СД 1-го) и СД второго (СД 2-го) типов.
Имеющиеся литературные данные, посвященные изучению состояния пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) у больных с диабетом очень противоречивы и касаются исследований лишь некоторых показателей системы «ПОЛ-АОС» [R.C.Strange, 2000; Н.К.Зенков, 2001; V.Lankin, 2003; И.И.Дедов, 2005].
В нacтоящee вpeмя особoe знaчениe пpидaётcя cocтоянию мeмбpaн эритроцитов, как cвoeoбразнoй мoдeли для oценки cтепeни тяжecти пaтоло-гичecкогo пpoцеccа. Ведущaя рoль в иccледовaнияx oтводитcя структурно – функциональным особенностям мембран, изучению интенсивности мембрано-дестабилизирующих процессов и метаболизма мембранных липидов. Выcoкая коppеляционная связь мeжду измeнeниями cвoйcтв эритроцитарных и клетoчных мeмбpaн внутpенних opганoв пoзволяeт испoльзoвать мембраны эpитpоцитов как eстественную мoдель для иccледовaния oбщих хapaкте-риcтик вcех биoлогических мeмбpaн [М.В.Колосова, 2000].
Тaким oбpaзом, изучение cocтояния эpитpоцитаpных мeмбpaн, процессов перекисного окисления липидов, а также pазличныx звeньeв антиоксидант-ной системы имeет вaжнoе пpoгностичеecкое знaчениe для бoльныx caxapным диaбeтом. Это исследование ускорит пoзнaние пaтогенeтичecких механизмов заболевания и будeт cпocoбствoвать pазвитию иcпoльзoвaния мeмбpaнocтабилизиpующeй и aнтиoкcидaнтнoй теpaпии.
Цель исследования – изучение комплекса нарушений энергетического обмена, особенностей изменения уровня пероксидации липидов и системы антиоксидантной защиты крови у больных СД первого и СД второго типов в
зависимости от продолжительности, степени компенсации и наличия осложнений заболевания.
Задачи исследования:
1. Оценить уровень липидной пероксидации, состояние эритроцитарных
мембран и системы АОЗ в крови у больных СД второго типа в зависимости
от продолжительности заболевания.
-
Исследовать влияние развития декомпенсации на процессы ПОЛ, состояние эритроцитарных мембран и систему АОЗ у больных с СД второго типа.
-
Изучить особенности липидной пероксидации, состояние эритроцитарных мембран и антиоксидантной системы в крови у больных с осложнениями СД.
-
Провести комплексное изучение нарушений энергетического обмена на фоне развития окислительного стресса у больных с сахарным диабетом и дислипидемией.
5. На основе выявленных особенностей состояния системы ПОЛ-АОС в
крови у больных СД второго типа и потребления глюкозы эритроцитами,
разработать практические рекомендации по выявлению активации перекис-
ных процессов при СД и коррекции этих нарушении препаратами мембрано-
стабилизирующей и антиоксидантной направленности.
Научная новизна. Проведено комплексное исследование системы «ПОЛ-АОС» у больных с СД, включающее определение первичных и вторичных продуктов липидной пероксидации, изучение различных звеньев АОС, обладающих как внутриклеточной, так и внеклеточной направленностью действия.
Впервые для оценки состояния эритроцитарных мембран при СД второго типа использован метод определения утилизации глюкозы эритроцитами с помощью которого обнаружены значительные нарушения потребления глюкозы уже в дебюте данной патологии.
Впервые проведен анализ взаимосвязи нарушений энергетического обмена и утилизации глюкозы эритроцитами от степени развития окислительного стресса у больных сахарным диабетом второго типа и установлено угнетение аэробного синтеза АТФ вследствие активации гликолитических процессов и возрастания степени лактацидоза у больных с СД первого типа и впервые выявленным СД второго типа. Установлено, что увеличение концентрации метаболитов ПОЛ и лактацидоз особенно выражены при СД второго типа.
Впервые показано, что по мере нарастания продолжительности заболевания, степени декомпенсации и тяжести течения заболевания, гиперлипоси-нтетическая направленность метаболизма липидов играет важную роль в патогенезе формирования диабетической полинейропатии.
Впервые у диабетических больных с дислипидемией и нарушением энергетического обмена изучено влияние мембраномодулирующего препарата липостабила и антиоксиданта липоевой кислоты для коррекции метаболической недостаточности. Впервые получен эффект возрастания утилизации глюкозы эритроцитами при применении этих препаратов, что свидетельствует о повышении чувствительности клеток к инсулину.
Практическая значимость результатов исследования. Изучение механизмов нарушения энергетического обмена и системы ПОЛ-АОЗ клеток крови при СД повышает возможности профилактики осложнений заболевания и позволяет предложить новый подход к коррекции нарушений энергетического обмена у больных.
Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Усиление процессов ПОЛ, изменения структурно-функциональных свойств эритроцитарных мембран и нарушения в системе антиоксидантной защиты происходят уже в дебюте СД первого типа и остаются таковыми на протяжении всего исследуемого периода заболевания.
-
При декомпенсации СД наблюдается более выраженное увеличение уровня первичных продуктов ПОЛ, снижение содержания восстановленного глутатиона, снижение активности всех исследуемых ферментов (супероксид-дисмутазы, каталазы, кроме глутатионпероксидазы) и в результате этого снижение утилизации глюкозы клетками по сравнению с группой компенсированного диабета. Развитие осложнений СД второго типа сопровождается более выраженным повышением плазменного уровня МДА и снижением активности СОД по сравнению с соответствующими показателями без осложнений.
Внедрение результатов исследования. Результаты проведённых исследований внедрены в лабораторную практику центральной научной исследовательской лаборатории Северо-Осетинской государственной медицинской академии. Материалы диссертации используются при чтении курсов: «Биохимия», «Биохимия тканей», «Молекулярные механизмы гормональной регуляции» студентам Северо-Осетинской государственной медицинской академии, а также в терапевтической практике поликлиники №1 г. Владикавказа.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работах, в том числе 6 работ в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Российский медицинский журнал», «Проблемы эндокринологии», «Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии», «Фундаментальные исследования», «Владикавказский медико-биологический вестник»).
Основные положения работы доложены и обсуждены на XII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 7-10.12.2011 год), а также на Пироговской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 21 марта 2013 год).
Апробация диссертации проведена на совместном заседании сотрудников кафедры биологической химии лечебного факультета, кафедры патофизиологии, клинической патофизиологии, кафедры эндокринологии и сотрудников научной исследовательской лаборатории патологии сердечно-сосудистой системы Российского научного исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова.
Личный вклад автора в исследование. Диссертантом определены основные идеи и методики исследования. Автор самостоятельно провел по-5
дробный анализ современной литературы, набор больных и исследование лабораторных показателей крови пациентов. Представленные в диссертации результаты исследований, статистическая обработка и анализ полученных данных выполнены лично автором. На основе полученных данных сделаны выводы и практические рекомендации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, объекта и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 221 источник, в том числе 126 отечественных и 95 зарубежных авторов. Работа содержит 16 таблиц и проиллюстрирована 10 рисунками.
Нарушение обмена веществ у больных сахарным диабетом
Инсулин - самый мощный сахароснижающий анаболический гормон, принимающий участие в процессе обмена веществ и обеспечивающий жизнедеятельность организма. Это гормон немедленного действия, который быстро синтезируется и секретируется. Общее количество накопленного в островках поджелудочной железы инсулина составляет приблизительно 200 ЕД, а скорость синтеза в сутки - 30 ЕД у взрослого человека. Инсулин и С-пептид выделяются в систему воротной вены и поступают в печень, которая задерживает около 50-60% гормона. Инсулин активно участвует в процессах регуляции обмена веществ. Стимуляция инсулином приводит к увеличению скорости утилизации глюкозы клетками в 20-40 раз. Происходит это за счет 5-10-кратного увеличения содержания белков транспортеров глюкозы на поверхности мембраны, при одновременном снижении их содержания внутри клетки на 50-60% [86, 108, 125].
Биологическое действие инсулина заключается в регуляции реакций метаболизма: обмена углеводов, липидов и белков, и в том числе митогенных процессов роста, дифференцировки тканей, транскрипции генов и синтеза ДНК. [124]. Инсулин стимулирует белоксинтезирующую активность клеток путем увеличения образования всех типов РНК и активирования связывания аминокислот с т-РНК. Клинические проявления СД обусловлены нарушениями различных видов метаболизма: углеводного, липидного, белкового и водно-солевого, что связано с функциональными изменениями в геноме и белоксинтезирующем аппарате клеток [125].
Основная причина большинства проявлений СД – абсолютный дефицит инсулина в случае СД первого типа или недостаточное его действие и/или неадекватная секреция, а также недостаточное действие гормона на периферии при СД второго типа. При диабете главным звеном нарушений метаболизма углеводов, жиров белков является недостаточность функционирования инсулина в тканях-мишенях [43]. Возникающая гипергликемия, блокирует углеводный обмен. В жировой ткани, скелетных мышцах, миокарде затрудняется активный транспорт глюкозы из крови и внеклеточной жидкости внутрь клеток. Замедление поглощения глюкозы этими тканями, депонирующими ее в нормальных условиях жизнедеятельности в мышцах в форме гликогена, а в жировой ткани в виде липидов, существенно отражается на энергетическом обеспечении всего организма [78].
В норме клетки печени свободно проницаемы для глюкозы, а скорость ее поступления в клетку зависит от скорости ее внутриклеточного фосфорилирова-ния, которое осуществляется высокоспецифичной глюкокиназой. При недостатке инсулина в первую очередь тормозится глюкокиназная реакция (гексокиназа) и тем самым затрудняется начальный этап усвоения молекулы глюкозы - её фосфо-рилирование. Глюкоза + АТФ Глюкозо-6-фосфат + АДФ. Глюкокиназа обеспечивает утилизацию глюкозы при более высоких концентрациях в клетках. Торможение биосинтеза этих ферментов, вовлекающих глюкозу в энергетический обмен клеток, приводит к нарушению дальнейших этапов метаболизма [86].
Инсулиновая недостаточность приводит к нарушению всех видов обмена веществ. Недостаток инсулина проявляется в нарушении транспорта глюкозы из периферического сосудистого русла в клетки инсулинзависимых тканей. В результате в организме развивается состояние недостатка энергии, в силу чего активируются все катаболические процессы. Это приводит к существенному повышению содержания в крови антагониста инсулина - глюкагона. Так как инсулин больше не сдерживает процессы, которые глюкагон стимулирует в печени, продукция глюкозы в результате распада гликогена и глюконеогенеза резко возрастает. В то же время потребление глюкозы печенью, мышцами и жировой тканью снижается. Также гипергликемия нарастает и из-за повышения концентраций других контринсулярных гормонов – адреналина, кортизола и гормона роста. Повышение уровня глюкозы в крови выше почечного порога (7-9 ммоль/л) вызывает глюкозурию, которая сопровождается полиурией, так как избыток глюкозы, вследствие ее высокой осмотической активности, увлекает за собой большое количество жидкости при выведении с мочой. Дефицит глюкозы в клетках приводит к более активному использованию в качестве источника энергии жиров. Всё количество образующегося при этом ацетил-КоА не способно сгорать в цикле три-карбоновых кислот (ЦТК), к тому же скорость потребления ацетил-КоА в нем падает в связи с уменьшением количества промежуточных продуктов обмена углеводов, которые в норме активируют начальные процессы ЦТК. При этом часть ацетил-КоА расходуется на синтез кетоновых тел, где окисляется до ацетоацетата и -гидроксимасляной кислоты. Накопление кетоновых тел в организме вызывает развитие метаболического кетоацидоза. Компенсаторно организм пытается снизить содержание в крови продуктов, вызвавших закисление внутренней среды, и выводит их с мочой (кетонурия) и выдыхаемым воздухом. Поскольку органические анионы ацетоуксусной и -гидроксимасляной кислот связаны с ионами Na+ и К+, происходит их выведение с мочой, а почечные канальца пытаются заменить утраченные ионы катионами и реабсорбируют Н+ и ионы NH4+. Нарастающий ацидоз компенсируется за счет буферных систем, в частности гидрокарбоната натрия. По мере нарастания ацидоза и истощения емкости буферных систем развивается некомпенсированный метаболический ацидоз, приводящий к компенсаторной гипервентиляции легких, что способствует дополнительной потери жидкости через легкие [30, 77].
Недостаток инсулина усиливает также катаболизм белков организма. Образовавшиеся при этом аминокислоты включаются в процесс глюконеогенеза, что ведёт, в первую очередь, к усугублению гипергликемии, во вторую, к потере аминокислот и нарушению синтеза белка и, в третью, к росту синтеза мочевины и, как следствие,- к отрицательному азотистому балансу. Наиболее опасным последствием вышеперичисленных нарушений является наступление диабетической комы. Развитие её связано с появлением гиперосмотической дегидратации в связи с выделением с мочой большого количества растворимых веществ - глюкозы, кетоновых тел, азотсодержащих соединений и ионов натрия. Дегидратация клеток с поражением функций мозга ведёт к возникновению диабетической комы [78, 86].
При сахарном диабете активируются процессы неферментативного глико-зилирования, представляющие собой распространенный вид посттрансляционной модификации белков Они могут протекать в тканях здоровых людей, но с большей скоростью происходят у лиц с гипергликемией. При этом глюкоза и другие моносахариды ковалентно связывается с NH2-группами некоторых аминокислот. Такая модификация отмечается для многих белков, включая гемоглобин (Нb), белки эритроцитарных мембран, белки хрусталика глаза, альбумин, фибриноген, инсулин, коллаген, трансферрин, глобулины, миелины, а также все классы липо-протеинов. Важно отметить, что гликозилированный гемоглобин связывает необратимо кислород, ухудшая его доставку тканям. Неферментативное гликозилиро-вание может изменять некоторые физико-химические и функциональные свойства белков и таким образом играть существенную роль в развитии диабетических осложнений [41, 58].
Неферментативное звено антиоксидантной системы
Какова бы ни была причина усиления перекисной модификации биомолекул, изменение скорости окисления липидов находится в тесной взаимосвязи со снижением концентрации биоантиоксидантов. Такая ситуация приводит к изменению состава липидов клеточных мембран, в частности повышению процента насыщенных жирных кислот, увеличению содержания холестерина и снижению фосфолипидов, а следовательно, уменьшению текучести липидной фазы мембраны, которая становится более жесткой [79]. В результате снижения активности мембранных ферментов (в том числе аденилатциклазы), эффекторами которых являются легко окисляющиеся липиды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсе-рин, фосфатидилинозит), изменяется чувствительность клетки к гормональной и нервной регуляции. Антиоксиданты могут быть природного (биоантиоксиданты) и синтетического происхождения. Выделяют жирорастворимые биоантиоксиданты (токоферолы, витамин А, каротиноиды, витамины группы К, фосфолипиды, убихинон, стероидные гормоны), которые осуществляют свою защитную функцию в биологических мембранах, и водорастворимые (аскорбиновая, липоевая, никотиновая, лимонная кислоты, серосодержащие соединения - цистеин, гомоцистеин, фенольные соединения -полифенолы, флавоноиды, церулоплазмин, трансферрин, лактоферрин, альбумин, мочевая кислота мочевина,) - в плазме крови, лимфе, цитозоле клеток и межклеточной жидкости [17].
Хорошо изученными компонентами неферментативной АОС являются низкомолекулярные, жирорастворимые, природные антиоксиданты, к которым относятся альфа-токоферол (витамин Е), - каротин (провитамин А) и убихинон Q [54,178].
Убихиноны, витамины А, С, Е, РР являются мощными антиоксидантами, защищающими мембраны клеток от разрушения. Биофлавоноиды (витамин Р, кверцетин, катехины) улучшают микроциркуляцию за счет подключения сети капилляров, ранее не участвовавших в кровоснабжении [36]. Защита от повреждающего действия АФК, свободнорадикальное окисление осуществляется на всех уровнях организации: от клеточных мембран до организма в целом и направлена против всех видов радикалов.
К основным природным антиоксидантам относятся аскорбиновая кислота (витамин С) и -токоферол (витамин Е).
Аскорбиновая кислота, будучи хорошо растворимой в воде, способна защитить от АФК компоненты цитозоля, а гидрофобный токоферол - мембранные ли-пиды от пероксидного окисления [71]. Витамин С обладает чрезвычайно широким спектром антиоксидантных свойств: обезвреживает О2-, НО2, RO2, HO; восстанавливает -токоферильный радикал, тем самым возвращая -токоферолу антиок-сидантные свойства [112].
Витамин Е является природным антиоксидантом и неферментным компонентом антиоксидантной защиты. Как известно, активный гидроксильный радикал индуцирует окисление полиеновых липидов. Альфа-токоферол является обязательным компонентом всех плазматических мембран, обеспечивает образование малоактивных радикалов, неспособных поддерживать цепные реакции ПОЛ, и увеличивает плотность упаковки мембранных фосфолипидов, делая их менее доступными переокислению [149, 159,172].
Установлено, что витамины Е и С обеспечивают снижение концентраций первичных продуктов ПОЛ и повышение активности антиатерогенного фермента параоксоназы в сыворотке крови [33]. Антигипергликемический эффект этих витаминов реализуется путем снижения интенсивности свободнорадикального окисления, что приводит к улучшению действия инсулина и повышает в панкреатических -клетках соотношение восстановленного и окисленного глутатиона, которое играет важную роль в секреции инсулина [36].
Антиоксидантным действием обладают ряд других природных веществ: каротин, мочевая кислота, трипептид-глутатион, дипептид карнозин, таурин и т.д.
Накопленные к настоящему времени данные позволяют рассматривать ан-тиоксиданты как весьма перспективные препараты, способные оказывать протек-тивное действие как на функцию -клеток и секрецию инсулина, так и на механизмы развития ангио-, нейропатий и других осложнений диабета [19].
В последние годы внимание исследователей привлечено к -липоевой (ти-октовой) кислоте - физиологическому антиоксиданту с высокой метаболической активностью. -липоевая кислота является коэнзимом мультиферментных комплексов митохондрий, осуществляющих окислительное декарбоксилирование пи-ровиноградной кислоты и -кетокислот, и играет важную роль в процессе образования энергии АТФ. Необычным свойством тиоктовой кислоты является ее способность повышать утилизацию глюкозы тканями и предотвращать образование конечных продуктов гликирования. В клинических исследованиях лечение тиок-товой кислотой способствует коррекции показателей свободнорадикального окисления липидов, белков и сывороточной активности лизосомальных ферментов у больных СД первого типа с полинейропатией [101, 189]. Известно, что -липоевая кислота в окисленной форме способна оказывать инсулинпотенцирую-щее действие и препятствовать зависимому от оксидативного стресса развитию инсулинрезистентности в своей восстановленной форме [26].
Определение липидного фосфора в сыворотке крови
Проводили с помощью набора «Фосфор-АГАТ». Фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно – молибденовую кислоту, которая реагирует с малахитовым зеленым с образованием комплекса зеленого цвета, стабилизированного в растворе наличием детергента. К 20 мкл сыворотки приливают 2 мл рабочего раствора детергента, затем 2 мл красителя, тщательно перемешивают и через 10 мин определяют оптическую плотность против холостой пробы. Оптическая плотность комплекса при 630 нм пропорциональна концентрации фосфора в образце. Расчет проводят по калибровочному графику.
Для количественного определения in vitro концентации общих антиоксидан-тов в плазме крови на биохимическом анализаторе SAPPHIRE 400 использовали стандартный набор фирмы RANDOX. Принцип метода заключается в следующем: 2,2-азидо-ди-[3-этилбензтиазолин сульфонат] инкубировали с пероксидазой (мет-миоглобином) и H2O2 с образованием одноименного радикала. Полученный раствор имел относительно стабильный зелено-голубой цвет, который измеряли при 600 нм. Антиоксиданты, содержащиеся в тестируемой пробе, подавляли развитие окраски пропорционально их концентрации в образце. Полученую концентрацию общих антиоксидантов измеряли в ед.акт., что эвивалентно ммоль/л.
Определение основано на взаимодействии GSH с ДТНБК (5,5 -дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм. [129].
Готовили гемолизат с добавлением 0,2 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов к 1,8 мл дистилированной Н20, охлаждённой до 0С. Для осаждения белков к гемолизату добавляли 3 мл осаждающего раствора (1,67 г ледяной ортофосфорной кислоты, 0,2 г этилендиаминтетрауксусной кислоты и 30 г хлористого натрия растворяли в дистилированной Н2О и доводили до метки 100 мл). Пробы тщательно перемешивали и после 20 минутного стояния при комнатной температуре фильтровали через крупнопористый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. 2 мл фильтрата помещали в спектрофотометрическую кювету объёмом 10 мл, добавляли 8мл фосфатного буфера (0,3 М Na2HP04). Затем в пробу вносили 1 мл раствора ДТНБК (5,5 -дитио-бис-2-нитробензойной кислоты) (0,02%-ный раствор, приготовленный на 1%-ном растворе цитрата натрия). Сразу же после перемешивания должна появиться жёлтая окраска из-за образования дисульфида глутатиона с 5,5 -дитио-бис-2-нитробензойной кислотой. Пробу фотометрировали при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Поскольку раствор 5,5 -дитио-бис-2-нитробензойной кислоты имеет слабожелтую окраску, параллельно с опытной пробой готовили контрольную, содержащую вместо фильтрата осаждающий раствор, разведёный дистилированной Н20 в отношении 2:5.
Содержание восстановленного глутатиона рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции (13600 М хсм"1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с 5,5 -дитио-бис-2-нитробензойной кислотой и выражали в мкмоль на грамм НЬ.
Концентрацию глутатионпероксидазы (ГПО) определяли в лизатах эритроцитов больных с помощью стандартных наборов фирмы BioVision, USA на имму-ноферментном анализаторе Stat Fax 3200.
Принцип метода основан на способности ГПО превращать восстановленный глутатион (GSH) в окисленный глутатион (GSSG). При этом снижение концентрации НАДФН+ прямо пропорционально активности ГПО, концентрацию которой определяют спектрофотометрически при 340 нм и выражают в ЕД/мл. Количественное определение in vitro супероксиддисмутазы (СОД) в цель ной крови определяли с помощью стандартного набора фирмы RANDOX на био химическом анализаторе SAPPHIRE 400. Метод основан на использовании ксан тина и ксантиноксидазы для генерирования кислородных радикалов, которые, вступая в реакцию с 2-(4-иодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5 фенилтетразолиумхлорид, образуют окрашенное в красный цвет соединение -формазан. Активность СОД определялась как величина ингибирования этой реакции и измерялась в Ед/мл. Концентрацию КТ определяли в лизатах эритроцитов больных с помощью стандартных наборов фирмы BioVision, USA на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 3200. Принцип калориметрического метода данного набора основан на способности КТ разлагать перекись водорода до воды и кислорода в необходимых условиях при температуре 25С и pH среды 4,5. Измерение оптической плотности конечного продукта в пробе производят при длине волны равной 570 нм. Активность КТ определяют по формуле в мЕД/мл. Концентрацию холестерина (ХС) в сыворотке крови определяли с помощью набора реактивов фирмы AnalyticonBiotechnologies AG/ Germani. Метод определения представляет собой ферментативный колориметричесий тест. Холестерин определяется ферментативно с применением холестеринэстеразы и холестеринок-сидазы. Эфир холестерина расщепляется под влиянием холинэстеразы, образуя свободный холестерин и жирные кислоты. Холестерин превращается в 4-холестенон и перекись водорода под влиянием кислорода в присутствии холесте-риноксидазы. Образовавшаяся перекись водорода даёт красное окрашивание в реакции с 4 –аминоантипирином и фенолом в результате каталитического воздействия пероксидазы. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации холестерина и может быть измерена фотометрически в ммоль/л. Значения нормы для ХС 3-5,4 ммоль/л.
Оценка интенсивности процессов перекисного окисления липидов у больных сахарным диабетом
Процессы перекиснеой модификации биомолекул представляют собой нормальный биохимический процесс. Через стадию образования перекисей липидов в клетках осуществляется синтез простагландинов, стероидных гормонов, образование желчных кислот из холестерина. Процессы ПОЛ необходимы для нормальной работы цепи переноса электронов при микросомальном окислении. [4, 34, 105, 123].
Нарушения структуры и функций клеточных мембран, происходящие при пероксидации, сопровождаются вымыванием из мембран окисленных липидов и заменой их новыми, более насыщенными липидами. Это облегчает процесс самообновления мембранных структур и за счёт изменения гидрофобности слоя влияет на проницаемость мембран, на активность мембранносвязанных ферментов и ионный транспорт. Таким образом, свободнорадикальное окисление - физиологический процесс, который обеспечивает регуляцию клеточной активности. Однако, при избыточном появлении свободнорадикальных форм сомоускоряющийся процесс ПОЛ приводит к полному разрушению ненасыщенных липидов, нарушению структуры и функции белков, нуклеиновых кислот и других молекул и, в конечном счёте, к гибели клетки [9, 179].
Для оценки процессов ПОЛ у больных СД второго типа были определены следующие показатели: содержание МДА в эритроцитах и плазме крови, а также содержание ДК в эритроцитах. При исследовании уровня продуктов ПОЛ в зависимости от степени компенсации СД второго типа, осложненного ДПН, показано повышение концентрации всех продуктов пероксидации липидов относительно контрольной группы в обеих группах: при компенсированном и декомпенсированном течении заболевания. При этом более выраженное достоверное увеличение концентраций первичных и вторичных продуктов наблюдается в фазе декомпенсации (таблица 3.1.1).
Установлено, что концентрация МДА в эритроцитах и в плазме крови больных в фазе декомпенсации СД второго типа с полинейропатией увеличена в 1,62 раза и в 1,25 раза соответственно (р 0,05 в обоих случаях), по сравнению с группой контроля (рисунок 3.1.1). Содержание ДК в эритроцитах больных также увеличено по сравнению с референтными значениями с 2,46 ммоль/мл до 5,54 ммоль/мл (р 0,05), а концентрация ГП повышена в 2 раза (рисунок 3.1.2). Таким образом, состояние декомпенсации СД второго типа сопровождается более выраженным образованием продуктов ПОЛ. Содержание ДК в группе с декомпенсацией повышено по сравнению с группой компенсированного диабета, то есть можно отметить, что достижение компенсации (нормализация углеводного обмена) сопровождается снижением уровня ДК в эритроцитах больных СД. Подобное изменение содержания ДК, вероятно, можно объяснить более выраженным недостатком инсулина при декомпенсированном состоянии. Инсулин является ингибитором чувствительной к гормонам липазы и при снижении его концентрации липолиз активируется. В результате этого свободные жирные кислоты, образующиеся при гидролизе триацилглицеридов, поступают одновременно с глицеролом в кровь и, таким образом, происходит увеличение их концентрации. А поскольку свободные жирные кислоты являются основным субстратом окисления, то при увеличении их содержания можно ожидать усиления в целом интенсивности свободноради-кальное окисление и в первую очередь - увеличения содержания первичных продуктов ПОЛ - ДК. К тому же в группе больных СД второго типа с ДПН между содержанием ДК и уровнем НbА1с имеется прямая корреляционная зависимость (r=0,67), что подтверждает влияние углеводного обмена на уровень продуктов ПОЛ.
У больных СД второго типа c полинейропатией даже в компенсированной фазе концентрация НbА1с составляла в среднем (6,41±0,31) %, что достоверно превышает нормальные значения 4-5,9 %. В фазе декомпенсации количество гли-кированного гемоглобина почти в 2 раза выше нормальных величин.
После лечения больных СД второго типа с ДПН препаратами сульфонилмочеви-ны (диабетон МВ-20мг), бигуанидов (глюкофаж - 2000 мг), инсулина короткого действия (актропид 6-10 Ед) и антиоксидантами (берлитион 300мг) концентрация изученных нами продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах снижалась (таблица 3.1.1), достоверное уменьшение выявлено в группе с декомпенсацией СД второго типа. Несмотря на то, что концентрация МДА в сыворотке крови в декомпенсированной группе больных не изменилась после терапии, в компенсированной группе больных даже увеличилась на 13 % от уровня данного показателя при поступлении. Количество ГП при компенсации сахарного диабета повысилось на 22 % после лечения.
Следовательно, усиление процессов пероксидации происходит, как у больных в фазе компенсации, так и декомпенсации диабета, причем, после двух недельного лечения наблюдается снижение уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ у декомпен-сированных больных, не достигающее контрольных значений.
Изучение уровня липидной пероксидации у больных СД второго типа с ДПН в зависимости от длительности заболевания показало более выраженное повышение всех изучаемых параметров перекисного окисления липидов при декомпенсированном течении СД свыше 8 лет (таблица 3.1.2).
При этом было отмечено достоверное повышение МДА в плазме крови с длительностью заболевания более 8 лет на 12 % по сравнению с группой менее длительного течения сахарного диабета.
У 28 больных в возрасте 40-65 лет был впервые выявлен сахарный диабет второго типа. Показатели метаболизма глюкозы у них указывали на декомпенси-рованное течение заболевания (средний уровень HbA1с - 14,6%, суточная гликемия - 16,26 ммоль/л, доза инсулина 0,95 Ед/кг). Результаты исследования в данной подгруппе мы сравнивали с полученными данными у больных СД первого типа. Для этого проводили обследование 25 больных СД первого типа, которые получали человеческий рекомбинантный инсулин в индивидуальной дозе по интенсифицированной схеме (от 0,35 до 1,66 Ед/кг).
Данные исследований, представленные в таблице 3.1.3, свидетельствуют о том, что у больных СД первого типа и впервые выявленным СД второго типа усилен синтез активных кислородных метаболитов в мембранах эритроцитов, о чем свидетельствует высокая концентрация переокисленных продуктов. При этом общая антиокислительная активность сыворотки (АОА) крови повышается по сравнению с контрольной группой.
Анализ процессов свободнорадикального окисления липидов у больных с впервые выявленым СД второго типа обнаружил достоверное повышение широкого спектра продуктов липопероксидации: ДК в 2,9 раза (р 0,05), ГП в 1,8 раза (p 0,05) и МДА в эритроцитах в 1,06 раза (р 0,05) по сравнению с контрольной группой.
