Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время ферменты глиоксилатного цикла являются объектами значительного количества исследований. Однако, основное внимание уделяется изучению этих ферментов из растений и микроорганизмов. Глиоксилатный цикл, являясь важнейшим этапом глюконеогенеза, осуществляет синтез из двух молекул ацетил-КоА одной молекулы сукцината, используемой для синтеза углеводов. Появились серьезные публикации об индукции глиоксилатного цикла в животных тканях. Наличие ферментов р-окисления жирных кислот в животных пероксисом и феномен ресинтеза гликогена в печени крыс при некоторых патологиях позволяет предположить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла (Лебкова, 1984, Епринцев, 2005, Попов, 1996). Ранее на нашей кафедре была выявлена индукция изоцитратлиазы и малатсинтазы в гепатоцитах крыс в условиях пищевой депривации и экспериментального диабета (Popov, 1996, 1998). Особый интерес вызывает функционирование аконитатгидратазы (АГ; КФ 4.2.1.3), участвующей в функционировании, как цикла Кребса, так и глиоксилатного пути. Рядом авторов было показано наличие двух изоферментных форм растительной аконитатгидратазы в цитоплазме и глиоксисомах, а также в митохондриях (Епринцев и др., 1995). В работах по изучению распространения аконитазной активности в животных тканях установлено аналогичное распределение локализации данного фермента (Kennedi et al., 1992, Konstantinova et al., 2000).
Огромную важность имеет проблема воздействия стрессовых факторов на функционирование живых организмов, как для теории, так и для практики. Ранее нами было установлено, что такие ферменты, как изоцитратлиаза, малатсинтаза, малатдегидрогеназа, индуцируются в печени крыс при пищевой депривации и экспериментальном сахарном диабете (Popov et al, 1996, Попов и др.,2001).
Особенности функционирования других ферментов, обеспечивающих протекание цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути, практически не известны. Это в полной мере относится к работе аконитатгидратазы, участвующей в ферментативном катализе так называемого «аконнтазного равновесия», обеспечивающего тонкую регуляцию анаболических и катаболических процессов и поддерживающих внутриклеточный гомеостаз в условиях нарушения факторов внешней среды.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось
исследование особенностей функционирования ферментной
аконитатгидратазной системы в животных клетках печени у крыс в условиях экспериментального сахарного диабета.
Исходя из цели, были определены следующие задачи:
-
Разработать экспериментальную модель сахарного диабета с использованием инъекций индуктора аллоксана исследуемым животным.
-
Изучить изменение активности ряда ферментов глиоксилатного цикла и цикла Кребса в различных тканях крыс, находящихся в условиях аллоксанового диабета.
-
Получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты аконитатгидратазы из клеток печени опытных и контрольных групп животных.
-
Исследовать каталитические свойства и метаболитную регуляцию изоформ аконитатгидратазы.
-
Разработать высокоспецифические праймеры для идентификации генов аконитатгидратазы с использованием методов сравнительной геномики.
-
Провести ОТ-ПЦР анализ матричной РНК для идентификации генов, кодирующих изоферменты аконитатгидратазы.
-
Провести количественный анализ уровня экспрессии генов аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального сахарного диабета.
-
Разработать гипотетическую схему регуляции клеточного метаболизма на уровне аконитатгидратазной реакции в печени крыс при аллоксановом диабете.
Научная новизна. Получены новые экспериментальные данные особенностей функционирования аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета. Применение многостадийной схемы очистки позволило получить исследуемый фермент в электрофоретически гомогенном состоянии из опытной и контрольной групп крыс. Выяснено субклеточное распределение аконитазной активности в животных клетках, которое связано с глиоксисомами, пероксисомами и цитоплазмой. Было выявлено, что значительная часть активности аконитатгидратазы сосредоточена в цитоплазматической фракции животных клеток. Анализ полученных результатов свидетельствует о полифункциональности действия аконитатгидратазы в условиях аллоксанового диабета. При этом выявлен
индуцированный синтез аконитатгидратазы, повышающий скорость превращения трикарбоновых кислот, как в энергетическом, так и в анаболическом обменах.
Практическая значимость. Модифицированные схемы очистки высокоочищенных и электрофоретически гомогенных препаратов аконитатгидратазы из животных тканей могут найти широкое применение для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием ферментных систем, обеспечивающих возникновение адаптивной реакции. Предлагается способ хранения аконитатгидратазы, обеспечивающий сохранность ее активности в течение длительного времени, что повышает эффективность применения препарата для биохимических анализов в лабораторной практике.
Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении лекций по биохимии, а также в спецкурсах по энзимологии. Кроме того, они применяются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на 12-й международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», международной научно-практической конференции «Высокие технологии. Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии», Санкт-Петербург, 2010, межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2009-20 Югт.), ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (160 источников). Иллюстрационный материал включает 21 рисунок, 11 таблиц.
