Содержание к диссертации
Введение
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ МУЛЬЖЕРМЕНТШЕ КОМПЛЕКСЫ АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗ В КЛЕТКАХ ВЫСШИХ ОРГАНИЗМОВ и
1.1. Характеристика аминоандл-тРНК-синтетазных комплексов И
1.2. Структурная организация и состав комплексов шлиноадил-тРНК-синтетаз 24
Глава 2. АКТИВНОСТЬ АШІОАІЩ-тРЖ-СИНТЕТАЗ ПРИ ДЕЙСТВИИ ПОНТИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ 32
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 42
3.1. Выделение высокомолекулярных комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз из печени крыс 43
3.2. Выделение и очистка. лизил-тРНК-синтетазы из печени крыс 44
3.3. Аналитический электрофорез высокомолекуляр- . ных комплексов ашноацил-тРНК-синтетаз 46
3.4. Определение константы седиментации высокомолекулярного комплекса ашноацил-тРНК-синте-
таз 47
3.5. Выделение суммарного препарата тРНК из печени крыс 49
3.6. Определение активности аминоадил-тРНК-синтетаз в составе высокомолекулярного комплекса 51
3.7. Определение шстивности метилтрансфераз высокомолекулярного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз. .52
3.8. Определение ДЦР-рибозилирующей способности высокомолекулярного комплекса аминоацил-тРНК-синте-
таз 53
3.9. Определение включения Д-рибозы / % / в высоко молекулярный комплекс аминоацил-тРНК-синтетаз.....53
3.10. Определение активности ацетилтрансфераз ?4
3.11. Определение включения уксусной кислоты в высокомолекулярный комплекс аминоацил-тРНК-синтетаз 4
3.12. Определение активности протеинкиназ высокомолекулярных комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз 55
3.13. Определение активности фосфопротеидфосфатазы высокомолекулярного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз .55
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ
Глава 4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВЫСОКОМОЛЕЗШЯРШГО КОМПЛЕКСА АМШОЩЭД-тРНК-аШТЕТАЗ ИЗ ПЕЧЕНИ ИНТАКТНЫХ И ОШУЧЕННЫХ КРЫС 57
Глава 5. ОСНОВНЫЕ ЭНЗИМ0Л0ШЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АМИНО -тРНК-СИНТЕТАЗНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПЕЧЕНИ.КРЫС В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО ЛУЧЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ 64
Глава 6. ФЕРМЕНТЫ ПОСТТРАНСШЯЩЮННЫХ МОДИФИКАЦИЙ БЕЛКОВ В СОСТАВЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО КОМПЛЕКСА АРСаз В . НОРМЕ И ПРИ ЛУЧЕВОМ ПОРАЖЕНИИ 73
6.1. Протеинкиназа ?3
6.2. Фосфопротеидфосфатаза 83
6.3. ГЛетилтрансфераза
6.4. Поли-ДЦР-рибозилтрансфераза Ї9?
6.5. Ацетилтрансфераза ЇЇ5
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Ш
ВЫВОДЫ Ш
ЛИТЕРАТУРА 133
- Характеристика аминоандл-тРНК-синтетазных комплексов
- АКТИВНОСТЬ АШІОАІЩ-тРЖ-СИНТЕТАЗ ПРИ ДЕЙСТВИИ ПОНТИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ
- Выделение высокомолекулярных комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз из печени крыс
- ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВЫСОКОМОЛЕЗШЯРШГО КОМПЛЕКСА АМШОЩЭД-тРНК-аШТЕТАЗ ИЗ ПЕЧЕНИ ИНТАКТНЫХ И ОШУЧЕННЫХ КРЫС
- ОСНОВНЫЕ ЭНЗИМ0Л0ШЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АМИНО -тРНК-СИНТЕТАЗНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПЕЧЕНИ.КРЫС В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО ЛУЧЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ
Характеристика аминоандл-тРНК-синтетазных комплексов
В последнее десятилетие появилось значительное количество работ, которые дают возможность заключить о существовании у высших организмов высокомолекулярных комплексов АРСаз, так называемых кодосом. Поэтому можно считать, что существенной особенностью, отличающей АРСазы эукариотических организмов от прока-риотических, является их ярко выраженная способность ассоциировать друг с другом с образованием высокомолекулярных комплексов. Эукариотические АРСазы встречаются как комплексы с молекулярной массой 10, в то время, как их прокариотические двойники имеют молекулярную массу 250000. Причем, в отличие от АРСаз высших организмов, у прокариотических организмов для каждой аминокислоты имеется только один структурный тип специфической син-тетазы, локализующийся в растворимой части цитоплазмы /г28 / На примере нескольких синтетаз было установлено, что в одной клетке E.coli содержится = 200-300 молекул каждой из них. Внутриклеточная концентрация синтетаз и тРНК у бактерий порядка І0" 6 моль/л /95,17 . У эукариот наряду с цитоплазматическими были обнаружены синтетазы хлоропласт и митохондрий / 186 /.
Впервые высокомолекулярные комплексы АРСаз обнаружены в 1970-72 гг. в составе клеток печени крыс /68 ДЗВ/. В настоящее время высокомолекулярные комплексы АРСаз выделены из различных видов клеток: печени крыс, мышей, кроликов и овец /ЙВ972/, мозга теленка, быка, крыс /&2Д93/, ретикулоцитов кролика /г85 / яйцеклеток китайского хомячка /114 /, плаценты человека /88 /, молочных желез крысы, овцы /140 /, скелетных мышц крысы /67 /, асцитных клеток Эрлиха /Г66 /, клеток Hela /191 /, покоящихся зародышей пшеницы / Г6Г/, клеток дрозофилы /174 /, дрожжей / 93 /.
Так, из печени крыс / 68 / методом хроматографии на сефа-дексе G-200 пострибосомального супернатанта выделен высокомолекулярный комплекс, который включал 18 АРСаз, с содержанием не более 10$ рибосомальной РНК. Полученные данные указывают на то, что АРСазы и тРНК печени крыс могут существовать в виде мак-ромолекулярного комплекса. Авторы отмечают, что исходный ассо-циат очень лабилен, в ходе его выделения и очистки происходит распад на свободные синтетазы и ассоциаты разного состава и разных размеров. Возможно, что полученный авторами комплекс является частью высокомолекулярной структуры, существующей в клетке и частично разрушающейся в процессе выделения.
В комплексе АРСаз I8S с молекулярной массой около I Ща из печени крыс обнаружены лизил-, аргинил-, лейцил-, изолейцил-и метионил-тРНК-синтетазы. Результаты исследований показали, что комплекс содержит одну субъединицу метионил- и 2 субъединицы лизил-тРНК-синтетазы /135 /.
Активность синтетаз при действии понтирующей радиации
Изучению влияния ионизирующей радиации на компоненты трансляции - аминоацил-тРНК-синтетазы и тРНК, посвящено небольшое количество работ. Так, в экспериментах на бактериях установлено /33,34/, что при облучении Azotobacter vinelandii активность отдельных аминоацил-тРБК-синтетаз изменяется не в одинаковой степени и зависит от дозы облучения. Высокие дозы (40 кр) вызывают заметную инактивацию большинства исследованных АРСаз, а в некоторых случаях полное подавление их активности. Низкие дозы (5 кр) или не влияют на деятельность этих ферментов, или незначительно их активируют (лизиновая и трео-ниновая). Доза 25 кр не влияет только на активность метионино-вой, тирозиновой и валиновой АРСаз. Активацию некоторых АРСаз при облучении в дозе 5 кр авторы связывают с имеющимися в литературе данными о стимуляции белкового синтеза малыми дозами рентгеновских лучей.
Опытами, проведенными на растительном объекте (проростки семян хлопчатника), были выявлены неадекватные изменения функциональной активности отдельных АРСаз в результате действия излучения. 7 растений, выращенных из семян хлопчатника, подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 30 кр в условиях естественного дня активности ряда АРСаз подавляются, в условиях короткого дня - нормализуются / F /.
Каракузиев Т.У", и др. / Г9 / изучали изменение активности некоторых аминоацил-тРНК-синтетаз в реакции присоединения аминокислоты к тРНК в проростках хлопчатника, выращенных из гамма-облученных в дозе 6,25 и 50 кр семян. Показано, что от - 33 -. дельные ферменты по-разному чувствительны к действию радиации, разные дозы облучения оказывают на фермент неодинаковое действие. Аминоацил-тРБК-синтетазы, участвующие в реакции аминоаци-лирования тРНК, более чувствительны к радиации, чем соответствующие тИЖ. Так, наиболее чувствительной к действию радиации оказалась АРСаза, специфичная к лизину, наименее радиочувствительными - глицин- и тирозин-специфичные, а гистидин-, валин-, фенилаланин-, аспарагиновая и глютаминовая синтетазы занимают промежуточное положение.
Значительные изменения в активности ферментов были обнаружены при облучении рН-5 фракции дрожжей (в состав которой входят аминоацил-тИЖ-синтетазы) очень большими дозами гамма-лучей /179 /. При термической инактивации фермента из E.coli происходит двукратное уменьшение размера его молекулы. Авторы предполагают, что радиация ослабляет силы взаимодействия между субъединицами АРСаз и, таким образом, приводит к увеличению их чувствительности к реакции среды и температуры.
Саркар и др. / 170 / выполнили исследования, в которых определили величину пострадиационных нарушений процесса активации аминокислот. Объектом исследований служила нормальная и регенерирующая после частичной гепатэктомии печень крыс. Через 2, 4, 6 и 8 часов после операции крыс подвергали рентгеновскому облучению в дозе 1000 р. Облучение контрольных крыс усиливало степень включения метки в белки надосадочной фракции. В регенерирующей печени наблюдали иную картину: в пределах 6 часов после частичной гепатэктомии прогрессивно угнеталась скорость включения меченого лейцина в белки той же фракции. На основании косвенных данных авторы делают вывод, что в течение 6 часов после операции у облученных крыс подавляется включение предшественника, вследствие снижения активации аминокислот. Другие исследователи считают этот вывод весьма предположительным, поскольку подавление или усиление степени включения метки в надосадочную фракцию может быть обусловлено многими причинами кроме активации аминокислот.
Выделение высокомолекулярных комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз из печени крыс
Для выделения ВМК АРСаз из печени крыс использовали общепринятые методы: ультрацштрифугировадае, гель-хроматографию на сефадексе G-200. За основу была принята последовательность этапов выделения, описанная в работе / Johnson, Dang, Jang,1980).
I. Среда A - 50 мМ трис-НСІ, рН 7,5; 350 мМ сахароза; 35 мМ КНСОо; 4 мМ МаСТ?; 25 мМ КСІ. - 44 2. Буфер А. - 50 мМ трис-НСІ рН 7,5; 25 мМ КСІ; 5 мМ МаДСНдСОО) ; 2 мМ 2-меркаптоэтанол; I мМ PMSF (фенилметил-сульфонилфторид). Все операции проводили при температуре 0-4С.
Печень крыс гомогенизировали в трех объемах среды А В размельчителе тканей PT-I. Экстршщию гомогената проводили на холоде при постоянном помешивании в течение 5 минут. Затем его центрифугировали при 48000 о 15 мин. Осадок отбрасывали. Су-пернатан процеживали через 4 слоя марли и центрифугировали при 105000 о 1,5 часа. Затем повторяли процеживание и прозрачный супернатант наносили на колонку с сефадексом С-200, уравновешенную буфером А (2,3 х 80 см). Элюцию проводили буфером А; (3,9 мл/час) ашноацил-тРНК-синтетазный комплекс выходил в свободном объеме колонки. Выход белка регистрировали спектро-фотометрически при длине волны 280 нм.
Физико-химические свойства высокомолезшяршго комплекса амшощэд-тРНК-аштетаз из печени интактных и ошученных крыс
Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что разнообразные изменения обмена веществ в процессе жизнедеятельности клеток приводят к перераспределению отдельных видов тРБК и АРСаз /27 /. Эти данные послужили основой для развития концепции о возможном участии тРНК и АРСаз в регуляции биосинтеза белка Д5Д7/. Однако, в настоящее время цельной картины механизма этой регуляции нет, т.к. до сих пор неизвестна ни структура этих ферментов, ни механизм катализа. К тому же, свойства отдельных АРСаз весьма, различны; обнаружены различия в структуре и механизме действия не только между синтетазами разной специфичности, но и между синтетазами специфичными к одной и той же аминокислоте, выделенными из различных организмов.
Одним из подходов для выяснения механизмов регуляции трансляции может быть изучение изменений активности АРСаз при экстремальном состоянии. Таким состоянием и является лучевое поражение организма.
Из имеющихся единичных работ известно о влиянии ионизирующей радиации на суммарные препараты АРСаз, в которых изучали активности лизиловой, аргиниловой, валиловой синтетаз из печени крыс /51-55/, фенилаланил-тРНК-синтетазы из проростков хлопчатника / Г /. Детальными кинетическими исследованиями было установлено, что ионизирующая радиация приводит к изменению сродства фермента к субстрату реакции на стадии активации аминокислоты на фоне замедления скорости заключительного эта,-па образования аминоацил-тРНК.
Б литературе имеются данные, указывающие на то , что при действии ионизирующей радиации наблюдается изменение физико-химических свойств не только АРСаз, но и тРНК /Г79 /. Было установлено, что в основе нарушений, имеющих место при облучении и приводящих к инактивации акцепторной функции тВЖ является разрыв фосфодиэфирных связей.
Так, многими авторами было показано, что АРСазы в эука-риотических организмах существуют в виде макромолекулярных комплексов (кодосом). Данные о влиянии на их структуру и физико-химические свойства ионизирующего облучения в доступной нам литературе отсутствуют. В связи с этим, представляло интерес изучить влияние рентгеновского облучения на некоторые кинетические свойства высокомолекулярного комплекса АРСаз из печени крыс. За основу в выделении комплекса АРСаз была принята последовательность этапов, описанная в работе Джонсона и др. / 13.4 / с некоторыми нашими модификациями.
Основные энзим0л0шческие характеристики амино -трнк-синтетазного комплекса из печени.крыс в условиях острого лучевого поражения
Существенным моментом в определении активности АРСаз, входящих в высокомолекулярный комплекс является определение оптимальных условий реакции аминоацилирования тРНК. Ориентация на литературные данные может привести к артефактам, так как не лимитирующие начальную скорость образования аминоацил-тРНК концентрации фермента, аминокислоты, тРНК, АТР, Мог+, время инкубации различны- не только для АРСаз из разных источников, но и для синтетаз одного происхождения, специфичных к различным аминокислотам. Поэтому, серия опытов была посвящена определению оптимальных условий реакции аминоацилирования тРНК АРСазами входящих в состав высокомолекулярного синтетазного комплекса.
Во всех случаях АРСазную активность определяли путем этерификации тРНК радиоактивной аминокислотой. Реакция аминоацилирования чувствительна к рН, температуре, концентрации АТР, аминокислот и других компонентов инкубационной смеси (табл. 5.1).
При этом различные аминоацил-тРНК-синтетазы имеют различные оптимальные условия реакции аминоацилирования.
Лизил-, аргинил- и метионил-тРНК-синтетазы комплекса АРСаз, выделенного из интактных животных, проявляют максимальную активность при внесении в пробу 50 мкг фермента; активность же этих препаратов, выделенных из облученных животных наибольшая при внесении 30 мкг фермента. Максимальная активность лейцил-тРНК-синтетазы как из интактных, так и из облученных животных проявляется при концентрации ферментативного белка - 40 мкг. Для триптофанил-тРВК-синтетазы активность препаратов из интактных и облученных животных не совпадает и оптимальна при внесении 30 и 50 мкг белка., соответственно.
